一種測定癌胚抗原的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定癌胚抗原的試劑盒。本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中癌胚抗原檢測過程操作復(fù)雜、以及測定準(zhǔn)確度低的問題，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是：一種測定癌胚抗原的試劑盒，該試劑盒由試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，其中R1試劑包含MOPS緩沖液15~185 mmol/L、氯化鈉150~400 mmol/L、聚乙二醇5~25 g/L、牛血清白蛋白18~42 g/L、疊氮鈉0.3~0.9 g/L，其溶劑為純化水。R2試劑包含MOPS緩沖液50~150mmol/L、氯化鈉100~300 mmol/L、牛血清白蛋白4~18 g/L、海藻糖5~35 g/L、疊氮鈉0.3~0.9 g/L、乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體0.1~2.0%，其溶劑為純化水。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定癌胚抗原的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定癌胚抗原的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌胚抗原是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，作為抗原可引起患者的免疫反應(yīng)。此 種抗原稱為癌胚抗原，可廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化 管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向 人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后 估計(jì)是一個較好的腫瘤標(biāo)志物。
[0003] CEA最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原。CEA升高常見于大腸癌、胰 腺癌、胃癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌等。此外，血清CEA水平與大腸癌的分期有明確關(guān)系，越晚 期的病變，CEA濃度越高。
[0004] 原發(fā)性結(jié)腸癌患者CEA增高占45 - 80%。除原發(fā)性結(jié)腸癌以外，胰腺癌、膽管癌、胃 癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高，一般在50 - 70%。
[0005] 良性腫瘤、炎癥和退行性疾病，如結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎和酒精性肝硬 化變病人CEA也有部分升高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于惡性腫瘤，一般小于20yg/L，CEA超過20yg/L時往往 提示有消化道腫瘤。所以測定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)。
[0006] 目前檢測癌胚抗原的方法多位酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光。但酶聯(lián)免疫吸附法操 作復(fù)雜、耗時長、且對操作人員有較高的專業(yè)要求?；瘜W(xué)發(fā)光雖然靈敏度和準(zhǔn)確度均較高， 但試劑成本相對較高，且配套的大型儀器較昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中癌胚抗原檢測過程操作復(fù)雜、以及測定準(zhǔn)確度 低的問題，提供一種測定類風(fēng)濕因子的試劑盒。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:一種測定癌胚抗原的試劑盒，包括 彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，它們包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: MOPS緩沖液 15~185 mmol/L 氯化鈉 150~400 mmol/L 聚乙二醇 5~25 g/L 牛血清白蛋白 18~42 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 試劑 R2: MOPS緩沖液 50~150 mmol/L 氯化鈉 100~300 mmol/L 牛血清白蛋白 4~18 g/L 海藻糖 5~35 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體 0.1~2.0 % 其溶劑為純化水。
[0010]作為優(yōu)選方案，所述的彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 225 mmol/L 聚乙二醇 15 g/L 牛血清白蛋白 30 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 其溶劑為純化水。
[0011] 試劑R2: MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 牛血清白蛋白 11 g/L 海藻糖 20 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體1.0 % 其溶劑為純化水。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體為含有能與人癌胚抗原特異 性結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片段。
[0013]作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體的粒徑在30~200nm之間。
[0014]作為優(yōu)選，本測定癌胚抗原的試劑盒的制備方法和使用方法包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： MOPS緩沖液 15~185 mmol/L 氯化鈉 150~400 mmol/L 聚乙二醇 5~25 g/L 牛血清白蛋白 18~42 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 其溶劑為純化水。
[0015] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： MOPS緩沖液 50~150 mmol/L 氯化鈉 100~300 mmol/L 牛血清白蛋白 4~18 g/L 海藻糖 5~35 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體0.1~2.0 % 其溶劑為純化水。
[0016] (C)將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)選的R1與試劑R2 的體積比為4:1，待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1:30之間； (d) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (e) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的癌胚抗原的值。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)20000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的含8 mg/mL抗人癌胚抗原抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時，膠乳顆粒最 終濃度為3.0 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)20000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA使得BSA最終濃度達(dá)到15 g/L，4°C封閉過夜;離心 去上清，用步驟(b)制得的分散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為1.0%，超聲分散即可 制得乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體。
[0018] 本發(fā)明所采用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是:血清樣本中的癌胚抗原與含有包 被了高特異性的抗人癌胚抗原抗體的緩沖液發(fā)生特異性結(jié)合，在促凝劑作用下形成不溶性 的聚苯乙烯微球-抗原-聚苯乙烯微球顆粒復(fù)合物乳濁液，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與 樣本中的癌胚抗原抗原濃度成正比關(guān)系，在一定波長下進(jìn)行濁度測定，即可測得樣本中被 檢測癌胚抗原的含量。
[0019] 樣本中癌胚抗原(CEA)的活性
式中：ΔΑτ/min以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 ΔAs/min以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中CEA的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn):對癌胚抗原的檢測靈敏度更高，檢測準(zhǔn)確 性更好，另外檢測也比較方便。
[0020]
【附圖說明】： 圖1為本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果對比。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0022] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 225 mmol/L 聚乙二醇 15 g/L 牛血清白蛋白 30 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 其溶劑為純化水。
[0023]試劑 R2: MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 牛血清白蛋白 11 g/L 海藻糖 20 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體1.0 % 其溶劑為純化水。
[0024] 實(shí)施例2 試劑盒的制備和使用方法 1、乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體的制作： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)20000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的含8 mg/mL抗人癌胚抗原抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時，膠乳顆粒最 終濃度為3.0 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)20000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA使得BSA最終濃度達(dá)到15 g/L，4°C封閉過夜;離心 去上清，用步驟(b)制得的分散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為1.0%，超聲分散即可 制得乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體。
[0025] 2、按照下列組分含量配制好試劑： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 225 mmol/L 聚乙二醇 15 g/L 牛血清白蛋白 30 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 其溶劑為純化水。
[0026] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 牛血清白蛋白 11 g/L 海藻糖 20 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體1.0 % 其溶劑為純化水。
[0027] 3、全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測步驟 (a) 取160μ1試劑R1與20μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入40μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1;
(d)樣本中癌胚抗原(CEA)的活性 計(jì)算出樣本中 的癌胚抗原的活度。
[0028] 參照附圖1，附圖1為用實(shí)施例1所制得的一種測定癌胚抗原的試劑盒多次測定不同樣 本中癌胚抗原的測定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果的對比分析。從相關(guān) 性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方程y=l.〇191x+ 0.2502，R 2=0.9966,從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好，可以應(yīng)用于癌 胚抗原的檢測。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定癌胚抗原的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體 組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: MOPS緩沖液 15~185 mmol/L 氯化鈉 150~400 mmol/L 聚乙二醇 5~25 g/L 牛血清白蛋白 18~42 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MOPS緩沖液 50~150 mmol/L 氯化鈉 100~300 mmol/L 牛血清白蛋白 4~18 g/L 海藻糖 5~35 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體 0.1~2.0 % 其溶劑為純化水。2. 如權(quán)利要求1所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒，其特征在于:所述的彼此獨(dú)立的試 劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 225 mmol/L 聚乙二醇 15 g/L 牛血清白蛋白 30 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MOPS緩沖液 100 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 牛血清白蛋白 11 g/L 海藻糖 20 g/L 疊氮鈉 0.6 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體1.0 % 其溶劑為純化水。3. 如權(quán)利要求1所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗人 類風(fēng)濕因子抗體為含有能與人癌胚抗原特異性結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片 段。4. 如權(quán)利要求1所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗人 類風(fēng)濕因子抗體的粒徑在30~200nm之間。5. 如權(quán)利要求1所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒，其特征在于:試劑盒的制備方法和 使用方法包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好R1試劑： MOPS緩沖液 15~185 mmol/L 氯化鈉 150~400 mmol/L 聚乙二醇 5~25 g/L 牛血清白蛋白 18~42 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 其溶劑為純化水 (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： MOPS緩沖液 50~150 mmol/L 氯化鈉 100~300 mmol/L 牛血清白蛋白 4~18 g/L 海藻糖 5~35 g/L 疊氮鈉 0.3~0.9 g/L 乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體 0.1~2.0 % 其溶劑為純化水 (c) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (d) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (e )根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的癌胚抗原的值。6. 如權(quán)利要求1所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗人 癌胚抗原單克隆抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)20000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的含8 mg/mL抗人癌胚抗原抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時，膠乳顆粒最 終濃度為3.0 g/L; (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)20000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA使得BSA最終濃度達(dá)到15 g/L，4°C封閉過夜;離心 去上清，用步驟(b)制得的分散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為1.0%，超聲分散即可 制得乳膠包被抗人癌胚抗原單克隆抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(c)中，所述的試劑R1與試劑R2的體積比為4:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定癌胚抗原的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(c)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1:30之間。
【文檔編號】G01N33/577GK106093405SQ201610359615
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司