一種測定肌紅蛋白的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定肌紅蛋白的試劑盒。本試劑盒由R1、R2雙試劑組成，試劑R1的組分為：Tris緩沖液15~145 mmol/L、氯化鈉50~200 mmol/L、聚乙二醇?8000 5~20 g/L、疊氮鈉0.4~1.2 g/L、牛血清白蛋白12~32 g/L、溶劑為純化水；試劑R1的組分為：Tris緩沖液50~150 mmol/L、牛血清白蛋白4~26 g/L、甘油5~15 g/L、疊氮鈉0.6~1.2 g/L、乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體1~4 g/L、溶劑為純化水。樣品中肌紅蛋白（MYO）可與試劑R2中相應(yīng)的特異性抗?MYO抗體結(jié)合形成抗原?抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定濁度。該濁度高低在一定抗體存在時與抗原的含量成正比。在一定波長下測定濁度并通過多點(diǎn)定標(biāo)曲線可進(jìn)行肌紅蛋白的定量測定。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定肌紅蛋白的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定肌紅蛋白的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌紅蛋白（Myoglobin,Mb)是一種氧結(jié)合血紅素蛋白，主要分布于心肌和骨豁肌組 織約占肌肉總量的0.1%~0.2%。在急性心肌損傷時，Mb最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約 2-3小時后，血中Mb可超出正常上限，9-12小時達(dá)到峰值，24-36小時后恢復(fù)正常。對于懷疑 ACS的病人建議連續(xù)采樣測定，因為癥狀出現(xiàn)和蛋白標(biāo)志物釋放到血液之間有一段延遲。Mb 陰性有助于排除心梗。
[0003] 測定血清肌紅蛋白肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指 標(biāo)。但特異性差，骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高。Myo陽性雖不 能確診AMI，但可用于早期排除AMI診斷的重要指標(biāo)，如Myo陰性，則基本排除心肌 梗死，還可用于再梗死的診斷，結(jié)合臨床，如Myo重新升高，應(yīng)考慮為再梗死或者梗死 延展。
[0004] 目前肌紅蛋白的檢測方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光等。放射 免疫法有放射性物質(zhì)，會造成放射性污染;酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜、耗時長，對操作人員 有較高的專業(yè)要求;化學(xué)發(fā)光成本較高，且檢測所需儀器較為昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中肌紅蛋白檢測過程操作復(fù)雜、以及測定準(zhǔn)確度 低的問題，提供一種測定肌紅蛋白的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:一種測定肌紅蛋白的試劑盒，包括 彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 試劑 R2: Tris緩沖液 5CK150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含 量為： 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 試劑 R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體為含有能與人肌紅蛋白特異性結(jié)合 的Fab功能部位的完整抗體或抗體片段。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體的粒徑在40~500nm之間。
[0012] 作為優(yōu)選，試劑盒的制備方法和使用方法包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0013] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0014] (c)將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)作為進(jìn)一步的優(yōu)選，試劑R1 與試劑R2的體積比為3:1，待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:60之 間。
[0015] (d)用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (e)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的人肌紅蛋白的值。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的抗人肌紅蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時，膠乳顆粒最終濃度為 3.0 g/L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人肌紅蛋白 抗體。
[0017] 本發(fā)明所采用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是利用抗原抗體反應(yīng)，樣品中肌 紅蛋白（MY0)可與試劑中相應(yīng)的特異性抗-MY0抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定濁 度。該濁度高低在一定抗體存在時與抗原的含量成正比。在一定波長下測定濁度并通過多 點(diǎn)定標(biāo)曲線可進(jìn)行肌紅蛋白的定量測定。
[0018] 樣本中肌紅蛋白（MY0)的活性（
式中：A AT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 A AS以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 CS校準(zhǔn)液中al-MG的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn):對肌紅蛋白的檢測靈敏度更高，檢測準(zhǔn)確 性更好，另外檢測也比較方便。
[0019]
【附圖說明】： 圖1為本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果對比。
【具體實施方式】
[0020] 以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
[0021] 實施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0022] 試劑 R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。
[0023] 實施例2 試劑盒的制備和使用方法 1、乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體制備： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的抗人肌紅蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時，膠乳顆粒最終濃度為 3.0 g/L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人肌紅蛋白 抗體。
[0024] 2、按照下列組分含量配制好試劑： (a) 按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水 (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。
[0025] 3、全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570nm; (C)反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測步驟 (a) 取180yl試劑R1與6yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入60yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1;
(d)肌紅蛋白（MYO)的活性 計算出樣本中的肌紅蛋白 的活度。
[0026]參照附圖1，附圖1為用實施例1所制得的一種測定肌紅蛋白的試劑盒多次測定不 同樣本中肌紅蛋白的測定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果的對比分析。從 相關(guān)性實驗結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方程y=〇.9781x+ 1.165，R 2=0.9955,從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好，可以應(yīng)用于肌 紅蛋白的檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種測定肌紅蛋白的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其特征 在于:所述的彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。2. 如權(quán)利要求1所述的一種測定肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的彼此獨(dú)立的試 劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。3. 如權(quán)利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗 人肌紅蛋白抗體為含有能與人肌紅蛋白特異性結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片 段。4. 如權(quán)利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗 人肌紅蛋白抗體的粒徑在40~500nm之間。5. 如權(quán)利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:試劑盒的制備方法 和使用方法包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好Rl試劑： Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水； (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水； (c) 將待測樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (d) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (e )根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的人肌紅蛋白的值。6. 如權(quán)利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗 人肌紅蛋白抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的抗人肌紅蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時，膠乳顆粒最終濃度為 3.0 g/L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo I /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人肌紅蛋白 抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定肌紅蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(c)中，所述的試劑Rl與試劑R2的體積比為3:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定肌紅蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于：步驟（c)中，所述的待測樣本與試劑Rl和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:60之 間。
【文檔編號】G01N33/72GK105911298SQ201610359613
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司