專利名稱：一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肌紅蛋白(Myoglobin，MY0)是一種氧結(jié)合血紅素蛋白，分子量17. 8kD,主要分布于心肌和骨骼肌組織，心肌中含量特別豐富。MYO由一條多肽鏈和一個輔基組成。多肽鏈由153個氨基酸殘基組成；輔基為血紅素；在肌肉中有運輸氧和儲氧功能。肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)的形狀呈緊密球形，多肽鏈中氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，疏水側(cè)鏈多位于分子表面，因此其水溶性較好。三級結(jié)構(gòu)有8段a -螺旋區(qū)，每個a -螺旋區(qū)含7 24個氨基酸殘基，分別稱為A、B、C…G及H肽段。有I 8個螺旋間區(qū)，肽鏈拐角處為非螺旋區(qū) (亦稱螺旋間區(qū))，包括N端有2個氨基酸殘基，C端有5個氨基酸殘基的非螺旋區(qū)。內(nèi)部存在一口袋形空穴，血紅素居于此空穴中。血紅素是鐵卟啉化合物，它由4個吡咯通過4個甲炔基相連成一個大環(huán)，F(xiàn)e2+居于環(huán)中。鐵與卟啉環(huán)及多肽鏈氨基酸殘基的連接鐵卟啉上的兩個丙酸側(cè)鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側(cè)鏈上的正電荷相連。血紅素的Fe2+與4個吡咯環(huán)的氮原子形成配位鍵，另2個配位鍵I個與F8組氨酸結(jié)合，I個與02結(jié)合，故血紅素在此空穴中保持穩(wěn)定位置。這種構(gòu)象非常有利于運氧和儲氧功能，同時也使血紅素在多妝鏈中保持穩(wěn)定。肌紅蛋白在心肌損傷后，能快速釋放入血。它占細胞漿蛋白的5% 10%以上。就骨骼肌而言，肌紅蛋白主要見于慢開關(guān)的“紅”纖維(慢纖維)；心肌有多種肌紅蛋白的同型，有無心臟特異性肌紅蛋白同型尚未證實。目前檢測到的肌紅蛋白不能區(qū)分源于骨骼肌或心肌，因此說，肌紅蛋白是非心臟特異性的。盡管如此，肌紅蛋白在胸痛發(fā)作后頭幾個小時，比CK和CKMB活性敏感性更高，它常于胸痛發(fā)作后2 4h開始升高，急性心肌梗塞(AMI)發(fā)作后6 10h，仍可檢測到。肌紅蛋白對于因胸痛入院需除外AMI的患者是一種非常好的標(biāo)志物。如果胸痛發(fā)作后8h肌紅蛋白仍在正常范嗣，則可排除AMI之診斷。在非創(chuàng)傷性胸痛患者，肌紅蛋白診斷特異性與CKMB相當(dāng)。肌紅蛋白檢測不應(yīng)當(dāng)用于復(fù)蘇后或腎功能衰竭并懷疑AMI患者。在無并發(fā)癥的患者，肌紅蛋白的快速清除特性可用于再梗死的診斷。目前認(rèn)為，肌紅蛋白是判斷AMI患者有無再灌注的最好的無創(chuàng)指標(biāo)之一。在溶栓治療開始后90min，如肌紅蛋白升高近4倍則可比較準(zhǔn)確地判定梗死相關(guān)冠脈已完全再通，因此，可用于評估溶栓治療后梗死相關(guān)血管再通情況。肌紅蛋白也是外科冠狀動脈旁路術(shù)后判斷圍手術(shù)期AMI的早期指標(biāo)，當(dāng)主動脈松開鉗夾后3h肌紅蛋白濃度明顯變化即可判斷AMI。因為肌紅蛋白在循環(huán)中的半衰期短，用于極早發(fā)現(xiàn)梗死比其他指標(biāo)更敏感。若與cTnl聯(lián)合應(yīng)用可提高其特異性，披認(rèn)為是當(dāng)前早期診斷急性心肌梗死的最佳搭配之一MYO的測定多采用雙抗體競爭放射免疫法和競爭性ELISA測定法。有研究者將金標(biāo)記或硒標(biāo)記單克隆抗體與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，用紙條法半定量床邊檢測MYO濃度，最低檢測值為20 u g/L。目前cTnT的檢測多采用化學(xué)發(fā)光法，用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記后作為檢測抗體，大大提高了測定的精確性和敏感性，但需要昂貴的檢測設(shè)備。目前的床旁檢測方法(膠體金試紙法)，不能滿足臨床診斷準(zhǔn)確定量的要求，無法對AMI的病程起到很好的療效監(jiān)測作用。因此，建立一種檢測時間盡量縮短，并且檢測除了能在實驗室進行外，還要求能夠進行床旁檢測，同時能定量測定cTnT的檢測方法，從而為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，是十分必要的
發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有肌紅蛋白(MYO)檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種快速檢測MYO的試紙條及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)免疫熒光技術(shù)特點和MYO抗原抗體系統(tǒng)特點，設(shè)計新的原材料、試劑和工藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測MYO水平，具有簡單、快速、靈敏和特異性好等特點，本發(fā)明可同時定量檢測高值和低值樣品，并且性價比高，適用于臨床快速檢測。本發(fā)明的又一目的在于提供種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條，本發(fā)明采用免疫熒光快速檢測技術(shù)，利用熒光的高靈敏特點，且樣品與熒光標(biāo)記抗體在試劑瓶內(nèi)反應(yīng)后再加入檢測卡。由于樣品與熒光標(biāo)記抗體在液相中全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高反應(yīng)靈敏度，同時增加了樣品的稀釋倍數(shù)，去除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包被的特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體，質(zhì)控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優(yōu)選地，所述底襯一面涂覆黏膠或雙面膠，用于固定所述的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，其中，包被分析膜粘附在所述底襯的中間，兩側(cè)分別與所述吸水墊和樣品墊連接。優(yōu)選地，所述吸水墊為一種濾紙，為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時吸水墊與包被分析膜重疊l-2mm連接。優(yōu)選地，所述包被分析膜為硝酸纖維膜，且在包被分析膜上噴涂抗肌紅蛋白單克隆抗體和兔IgG抗體。所述樣品墊為玻璃纖維膜，用含0. 01% -0. 5% PEGU % -5%牛血清白蛋白、0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液緩沖液浸泡，緩沖液PH為7. 2，浸泡處理后，37°C干燥過夜；樣品墊(6)位于所述包被分析膜上。優(yōu)選地,所述鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,并分別用含有如下組分的0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚乙二醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、0. 01% -0. 05%表面活性劑。優(yōu)選地，所述獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記的激發(fā)光波長范圍為390-420nm，發(fā)射光波長范圍為 600nm-700nm。
一種制備上述的定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法，包括以下步驟第一步，抗體的制備，選用純化的基因工程表達的抗肌紅蛋白單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ；第二步，包被分析膜的制備，采用噴膜機分別在一硝酸纖維膜上劃檢測線和質(zhì)控線，劃線細致均勻，檢測線與質(zhì)控線間隔5mm ；用檢測線包被緩沖液稀釋抗肌紅蛋白單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機將抗肌紅蛋白單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；
用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG至濃度為10_20ug/ml，采用噴膜機將純化的兔IgG噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上；將噴膜后的硝酸纖維膜放入30_50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用；第三步，樣品墊的制備，將玻璃纖維膜用含0. 01% -0. 5% PEGU% -5%牛血清白蛋白、0. 01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用；第四步，鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的制備將抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用0. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至Img/ml，分別加入30-50mg的熒光素溶解液，攪勻，室溫孵育I小時，每隔15分鐘混勻一次，最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標(biāo)記好的熒光素標(biāo)記抗體，用0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于4°C保存；第五步，形成免疫熒光試紙條，先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上，在包被分析膜一端粘附吸水墊，二者重疊l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附樣品墊，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細條，即成一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙。優(yōu)選地，所述檢測線包被緩沖液為含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1 %的蔗糖、0. 2% -0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌紅蛋白單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液?；颍鰴z測線包被緩沖液為含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1 %的海藻糖蔗糖、0. 2% -0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌紅蛋白單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7.6的輕乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液。 優(yōu)選地，所述質(zhì)控線包被緩沖液為含0. 7-1 %的甲醇、0. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗體0. 5mg/ml的50mM pH值為7. 6磷酸鹽緩沖液。一種應(yīng)用上述定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的檢測卡組件，包括試紙條組件和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的蓋板和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板組成的卡盒，所述背板包括放置所述試紙條的卡槽和用于與所述蓋板結(jié)合的卡齒，所述蓋板包括可觀測檢測結(jié)果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用于與所述背板的卡齒結(jié)合的固定孔，所述試紙條通過所述卡齒與所述固定孔結(jié)合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間，其中，所述包被分析膜正對所述檢測窗，所述樣品墊正對所述加樣孔；另外，獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。一種制備上述定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的檢測卡組件的方法，包括以下步驟I)制成背板和蓋板用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材質(zhì)制成背板和蓋板，所述背板包括放置上述試紙條的卡槽和用于與所述蓋板結(jié)合的卡齒，所述蓋板包括可測結(jié)果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用于與所述背板的卡齒結(jié)合的固定孔；2)組裝
將試紙條放在所述背板的所述卡槽內(nèi)，通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔(10)結(jié)合，將試紙條嵌合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對所述檢測窗，樣品墊(6)正對所述加樣孔；另外，獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。3)包裝將I人份的檢測卡組件與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入一個包裝盒，在2 °C -8 °C環(huán)境下避光不凍存的進行保存。本發(fā)明的有益效果應(yīng)用本發(fā)明提供的試紙條檢測人體內(nèi)MYO水平，成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套專用熒光檢測儀，因此可廣泛應(yīng)用于各級醫(yī)療檢驗場所，尤其是基層醫(yī)療機構(gòu)，包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開展。本發(fā)明可定量測定MY0，其對于心腦血管事件發(fā)生的預(yù)防有極為重要的意義。


圖I為本發(fā)明的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的檢測卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線；圖4為本發(fā)明的反應(yīng)方式示意圖；圖5為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖；圖6為本發(fā)明的肌紅蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。附圖標(biāo)記1 :底襯；2 :吸水塾；3 :包被分析I吳；4 :檢測線；5 :質(zhì)控線；6 :樣品塾；7 :加樣孔；8:檢測窗；9:項目名稱；10:固定孔；11:蓋板；12:卡槽；13:背板；14:卡齒；15 :鉬n卜啉標(biāo)記抗體；16 :肌紅蛋白；17 :檢測線抗肌紅蛋白單克隆抗體；18 :質(zhì)控線兔IgG抗體。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。如附圖I所示，一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯I、依次接合在底襯I上的吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，該包被分析膜上3設(shè)有檢測線4和質(zhì)控線5，檢測線4包被的特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體，質(zhì)控線5包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體。底襯I 一面涂覆黏膠或雙面膠，用于固定所述的吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，其中，包被分析膜3粘附在所述底襯I的中間，兩側(cè)分別與吸水墊2和樣品墊6連接。吸水墊2為一種濾紙，為吸水紙或濾油紙；吸水墊2粘附在所述底襯I上，同時吸水墊2與包被分析膜3重疊l-2mm連接。包被分析膜3為硝酸纖維膜，且在包被分析膜3上噴涂抗肌紅蛋白單克隆抗體和兔IgG抗體。樣品墊6為玻璃纖維膜，用含0. 01 % -0. 5 % PEG、1% -5%牛血清白蛋白、0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液緩沖液浸泡，緩沖液PH為7. 2，浸泡處理后，37°C干燥過夜；樣品墊6位于所述包被分析膜3上。鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含有如下組分的0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01%-0.5%聚乙二醇、I %-5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、0. 01% -0. 05%表面活性劑。制備上述定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法，包括以下步驟第一步，抗體的制備，選用純化的基因工程表達的抗肌紅蛋白單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG0第二步，包被分析膜3的制備，用檢測線包被緩沖液稀釋抗肌紅蛋白單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用BIO-DOT噴膜機將抗肌紅蛋白單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG至濃度為10_20ug/ml，采用BIO-DOT噴膜機將純化的兔IgG噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上；將噴膜后的硝酸纖維膜放入30_50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用；其中，檢測線包被緩沖液的制備20mM pH7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)，含甲醇
I%、鹿糖0. 8 %、牛血清白蛋白0.2*%、4E2抗體lmg/ml。質(zhì)控線包被緩沖液的制備50mM pH7. 6磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)，含甲醇I %、牛血清白蛋白0. 8*%、兔IgGO. 5mg/ml。第三步，樣品墊6的制備， 用含0. 2 %聚乙二醇、2. 5 %牛血清白蛋白、0. 03 %表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液，采用BIO-DOT噴膜機分別噴印在樣品墊上，將噴印后的樣品墊放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥3小時后取出密封備用。第四步,鉬P卜啉標(biāo)記特異抗體的制備將抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用0. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至Img/ml,分別加入30-50mg的鉬卩卜啉溶解液,攪勻，室溫孵育I小時，每隔15分鐘混勻一次,最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標(biāo)記好的熒光素標(biāo)記抗體，用0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于4°C保存；第五步，形成免疫熒光試紙條，
先將包被分析膜粘附在底襯I中間位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水墊2，二者重疊l-2mm ;在包被分析膜3另一端粘附樣品墊6，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜(3)、吸水墊2和樣品墊6的底襯I裁切成細條；即成一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫突光試紙。如附圖2所示，一種應(yīng)用上述定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的檢測卡組件，包括試紙條組件和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的蓋板11和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板13組成的卡盒，背板13包括放置所述試紙條的卡槽12和用于與蓋板11結(jié)合 的卡齒14，蓋板11包括可觀測檢測結(jié)果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用于與背板的卡齒14結(jié)合的固定孔10,試紙條通過卡齒14與所述固定孔10結(jié)合而嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析膜3正對檢測窗8，樣品墊6正對加樣孔7 ;另外，獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。一種制備上述定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的檢測卡組件的方法，其特征在于，包括以下步驟I)制成背板13和蓋板11 用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材質(zhì)制成背板13和蓋板11，背板13包括放置試紙條的卡槽12和用于與蓋板11結(jié)合的卡齒14，蓋板11包括可測結(jié)果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7以及用于與背板的卡齒14結(jié)合的固定孔10 ；2)組裝將試紙條放在背板13的卡槽12內(nèi)，通過背板13的卡齒14與蓋板11的固定孔10結(jié)合，將試紙條嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析膜3正對所述檢測窗8，樣品墊6正對所述加樣孔7 ;另外，獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。3)包裝將I人份的檢測卡組件與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入一個包裝盒，在2 °C -8 °C環(huán)境下避光不凍存的進行保存。本發(fā)明的檢測原理參照附圖3，對鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)鉬卟啉所具有的特征光譜的激發(fā)光光源范圍為390_420nm,發(fā)射光波長范圍為600_700nm。由于鉬B卜啉發(fā)光標(biāo)記物的特點，使得以其作為標(biāo)記物的免疫熒光試紙條可與儀器結(jié)合，使得基于鉬卟啉發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙條可進行靈敏度極高的多重分析、且對目標(biāo)被檢測物進行靈敏度極高的精確定量檢測。另外，本發(fā)明的快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條及檢測卡，利用熒光的高靈敏特點，使待測樣品與鉬卟啉標(biāo)記先在試劑瓶內(nèi)反應(yīng)，由于待測樣品與鉬卟啉標(biāo)記在液相中全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高反應(yīng)靈敏度，同時增加了待測樣品的稀釋倍數(shù)，去除了待測樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性；而且鉬卟啉標(biāo)記上的特異抗體與待測樣品充分結(jié)合形成一復(fù)合物，然后將復(fù)合物轉(zhuǎn)加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上，實現(xiàn)鉬卟啉發(fā)光材料與免疫層析技術(shù)相結(jié)合從而檢測人體內(nèi)肌紅蛋白水平。如圖4所示，當(dāng)復(fù)合物加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上后，在吸水墊2的吸力下鉬卟啉標(biāo)記抗體15流經(jīng)到檢測卡中的包被分析膜3上，如果該復(fù)合物具有肌紅蛋白，其能被檢測線4上的肌紅蛋白單克隆抗體17捕獲，在綠色光照射下以紅外光光信號的形式表現(xiàn)出來，所發(fā)出的熒光可用專用儀器定量測定，熒光強度與樣品中肌紅蛋白的濃度成正比。如果復(fù)合物中肌紅蛋白低于最低檢測標(biāo)準(zhǔn)，則檢測線4不會發(fā)出熒光。另外，參閱圖5的a、b、c所示，試紙條有效的情況下，檢測線4上的抗肌紅蛋白單克隆抗體17與質(zhì)控線5上的兔IgG抗體18均會與復(fù)合物反應(yīng)發(fā)出熒光，即檢測線4與質(zhì)控線5均發(fā)光，試紙條檢測結(jié)果呈陽性；只有質(zhì)控線5發(fā)光，試紙條檢測結(jié)果呈陰性；兩條線均未發(fā)光，試紙條檢測結(jié)果無效。 本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制
首先，將提純的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用I : 10稀釋的正常人血清(采用pH7. 20. 02MPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為Ong/ml、I Ong/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次,每個樣品分別用10個肌紅蛋白試紙條檢測10次，10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果,列于表I。表I、不同濃度下的T/C值
權(quán)利要求
1.一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，其特征在于包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括底襯(I)、依次接合在底襯(1)上的吸水墊(2)、包被分析膜(3)及樣品墊￠)，該包被分析膜上(3)設(shè)有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，檢測線⑷包被的特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體，質(zhì)控線(5)包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述底襯(I) 一面涂覆黏膠或雙面膠，用于固定所述的吸水墊(2)、包被分析膜(3)及樣品墊￠)，其中，包被分析膜(3)粘附在所述底襯(I)的中間，兩側(cè)分別與所述吸水墊(2)和樣品墊(6)連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述吸水墊(2)為一種濾紙，為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊(2)粘附在所述底襯(I)上，同時吸水墊(2)與包被分析膜(3)重疊1-2_連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條，其特征在于包被分析膜(3)為硝酸纖維膜，且在包被分析膜(3)上噴涂抗肌紅蛋白單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述樣品墊(6)為玻璃纖維膜，用含0.01% -0.5% PEGU% -5%牛血清白蛋白、0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液浸泡，緩沖液PH為7. 2，浸泡處理后，37°C干燥；樣品墊(6)位于所述包被分析膜(3)上。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述鉬卟啉標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體，并分別用含有如下組分的0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得0. 01% -0. 5%聚乙二醇、I % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、0. 01% -0. 05%表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件，其特征在于所述獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記的激發(fā)光波長范圍為390-420nm，發(fā)射光波長范圍為600nm-700nmo
8.一種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于，包括以下步驟 第一步，抗體的制備， 選用純化的基因工程表達的抗肌紅蛋白單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ； 第二步，包被分析膜(3)的制備， 采用噴膜機分別在一硝酸纖維膜上劃檢測線和質(zhì)控線，劃線細致均勻，檢測線與質(zhì)控線間隔5mm ； 用檢測線包被緩沖液稀釋抗肌紅蛋白單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機將抗肌紅蛋白單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上； 用質(zhì)控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG至濃度為10-20ug/ml，采用噴膜機將純化的兔IgG噴印在硝酸纖維膜的質(zhì)控線上； 將噴膜后的硝酸纖維膜放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用； 第三步，樣品墊的制備，將玻璃纖維膜用含0.01% -0.5%聚乙二醇、1% -5%牛血清白蛋白、0.01% -0. 05%表面活性劑的0. 02M磷酸鹽緩沖液浸泡，放入30-50°C的真空干燥箱內(nèi)，干燥后取出密封備用； 第四步，鉬卟啉標(biāo)記特異抗體的制備 將抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用0. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml，分別加入30-50mg鉬卟啉標(biāo)記溶解液，攪勻，室溫孵育I小時，每隔15分鐘混勻一次，最后用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標(biāo)記好的熒光素標(biāo)記抗體，用0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于4°C保存； 第五步，形成免疫熒光試紙條， 先將包被分析膜粘附在底襯(I)中間位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水墊(2)，二者重疊l_2mm ;在包被分析膜(3)另一端粘附樣品墊￠)，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜(3)、吸水墊(2)和樣品墊(6)的底襯(I)裁切成細條。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種制備權(quán)利要求I所述的定定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于，所述檢測線包被緩沖液為含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1%的鹿糖、0. 2%-0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌紅蛋白單克隆抗體lmg/ml的2OmM pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于，所述檢測線包被緩沖液為含有0. 8-1 %的甲醇、0. 8-1 %的海藻糖鹿糖、0. 2% -0. 6%的牛血清白蛋白、抗肌紅蛋白單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7. 6的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種制備權(quán)利要求I所述的定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法，其特征在于，所述質(zhì)控線包被緩沖液為含0. 7-1 %的甲醇、0. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗體0. 5mg/ml的50mM pH值為7. 6磷酸鹽緩沖液。
12.—種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的定量檢測檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的檢測卡組件，其特征在于所述檢測卡組件包括試紙條組件和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的蓋板(11)和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板(13)組成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述試紙條的卡槽(12)和用于與所述蓋板(11)結(jié)合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可觀測檢測結(jié)果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)和用于與所述背板的卡齒(14)結(jié)合的固定孔(10)，所述試紙條通過所述卡齒(14)與所述固定孔(10)結(jié)合而嵌合在所述背板(13)和所述蓋板(11)之間，其中，所述包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，所述樣品墊(6)正對所述加樣孔(7);另外，獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶至Jhl o
13.一種制備權(quán)利要求12所述的定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件的檢測卡組件的方法，其特征在于，包括以下步驟 I)制成背板(13)和蓋板(11) 用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材質(zhì)制成背板(13)和蓋板(11)，所述背板(13)包括放置所述試紙條的卡槽(12)和用于與所述蓋板(11)結(jié)合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可測結(jié)果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)以及用于與所述背板的卡齒(14)結(jié)合的固定孔(10)；2)組裝 將試紙條放在所述背板(13)的所述卡槽(12)內(nèi)，通過所述背板(13)的卡齒(14)與所述蓋板(11)的固定孔(10)結(jié)合，將試紙條嵌合在背板(13)和蓋板(11)之間，其中，包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，樣品墊(6)正對所述加樣孔(7);另外，獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
3)包裝 將I人份的檢測卡組件與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，并配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體，將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標(biāo)記特異抗體裝入一個包裝盒，在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進行保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速定量檢測肌紅蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件和制備方法，該免疫熒光試紙條組件包括了試紙條和獨立包裝的鉑卟啉標(biāo)記特異抗體，試紙條包括了由底襯上依次接合的吸水墊、包被分析膜及樣品墊而組成的條形物，包被分析膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述包被分析膜上的檢測線包被特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體，質(zhì)控線包被兔IgG抗體，獨立包裝的熒光素標(biāo)記特異抗體為抗肌紅蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體，檢測卡則將一卡盒和試紙條組件結(jié)合即可，應(yīng)用本發(fā)明所提供的試紙條檢測人血液、血清或血漿中肌紅蛋白，操作簡單、快速、靈敏和特異性好等特點，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/68GK102680703SQ201210133570
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者李必松, 梁萬興, 羅琪, 謝愛武 申請人:廣州鴻琪光學(xué)儀器科技有限公司