一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子測量領(lǐng)域，特別涉及一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 下箴刺桐堿又名海帕刺桐堿，CAS號487-58-1，分子式C14H18N2O 2，是豆科相思子屬 和刺桐屬植物中常見的生物堿。下箴刺桐堿能明顯抑制小鼠耳廓腫脹，減少小鼠耳廓重量； 增加小鼠胸腺、脾臟重量，提高小鼠血清溶血素水平；明顯降低〇：1 4和異硫氰酸萘酯所致的 肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性及膽紅素含量，保護肝損傷。小鼠實驗提示海帕刺桐堿具有明 顯的抗炎、增強免疫和降酶退黃、抗肝損傷作用，是雞骨草等藥材的有效成分之一，下箴刺 桐堿的結(jié)構(gòu)與植物生長激素之一的生長素相似，均含吲哚基，但卻是生長素拮抗劑，通過抑 制植物根毛的伸長而發(fā)揮作用。
[0003] 色氨酸分子含有吲哚基，結(jié)構(gòu)與下箴刺桐堿、生長素的相似，微溶于乙醇，不溶于 氯仿、乙醚，在稀酸或稀堿中溶解。
[0004] 生長素、色氨酸、下箴刺桐堿的定量方法主要是液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和酶連 免疫分析法。但這些方法存在儀器較貴或者檢測費用高、樣品處理步驟比較復(fù)雜、消耗時間 比較長等局限。
[0005] 熒光光譜法是利用物質(zhì)吸收較短波長的光波后發(fā)射較長波長特征光譜的性質(zhì)，對 物質(zhì)定性或定量分析的方法，該方法靈敏度高，選擇性強。
[0006] 色氨酸的定量很早就已經(jīng)運用熒光方法，通常用三氯醋酸除去蛋白質(zhì)后添加甲醛 與三氯化鐵使色氨酸的熒光衍產(chǎn)物生成后以激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長450nm進行測量，作 用原理是色氨酸與甲醛縮合成環(huán)狀，經(jīng)三氯化鐵氧化成熒光較強的去甲哈爾曼，但此法也 沒有考慮生長素和下箴刺桐堿等其他含吲哚基物質(zhì)對測定結(jié)果的影響。
[0007] 下箴刺桐堿、色氨酸、生長素分子內(nèi)都含吲哚基，均具天然熒光。單獨存在時，各自 的熒光強度與其濃度具有良好的線性關(guān)系，但三者的熒光光譜幾乎完全重疊，當(dāng)激發(fā)波長 280nm時發(fā)射波長為350nm，因此三者混合時無法直接用熒光光譜法分別定量，雖然根據(jù)三 者的的親水性可以用有機溶劑（乙酸乙酯）將生長素分離，但下箴刺桐堿與色氨酸的親水 性非常接近，無法用常見的溶劑進行萃取分離，這樣，在下箴刺桐堿的定量過程中，色氨酸 成了一種難以除去的雜質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明為在色氨酸雜質(zhì)存在條件下一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量 方法，其前處理時間短、檢測成本低、能快速大批量檢測。
[0009] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：
[0010] 一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法，包含如下步驟：
[0011] 1)配制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0012] 2)配制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與下箴刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的熒光強度， 繪制混標(biāo)準(zhǔn)合液的標(biāo)準(zhǔn)曲線；計算混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中色氨酸質(zhì)量濃度（A)與下箴刺桐堿質(zhì)量 濃度⑶的比值U(U = A/B)
[0013] 3)線性關(guān)系曲線1的繪制
[0014] 4)線性關(guān)系曲線2的繪制
[0015] 5)推導(dǎo)下箴刺桐堿的濃度的計算公式
[0016] 6)下箴刺桐堿溶液濃度的確定
[0017] 步驟1)中配制一定濃度梯度的色氨酸溶液，測定其熒光強度，以濃度值為橫坐 標(biāo)，對應(yīng)各濃度值的熒光強度為縱坐標(biāo)繪制色氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018] 步驟2)中配制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與下箴刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按一定體積比混合，計 算混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中色氨酸質(zhì)量濃度A與下箴刺桐堿質(zhì)量濃度B的比值U并記錄；
[0019] 步驟3)中測定標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的熒光強度X，空白對照組（蒸餾水）的熒光強度為 X。，在試管中分別滴加甲醛，靜置1小時，再測定添加甲醛后的混合溶液的熒光強度Y，空白 對照組（蒸餾水中滴加甲醛）的熒光強度為Y。，
[0020] W = Y/X (1)
[0021] 式中W為橫坐標(biāo)，以色氨酸與下箴刺桐堿的質(zhì)量濃度之比U為縱坐標(biāo)，得到線性關(guān) 系曲線1 ;
[0022] 步驟4)中使用步驟2)試管中色氨酸質(zhì)量濃度在步驟1)中對應(yīng)的熒光強度值記 為Z，空白對照組如蒸餾水的熒光強度為Z。，計算減去空白值后的值Z'與減去空白值后的 不添加甲醛的色氨酸熒光強度值t之比V，以每只試管添加甲醛與不添加甲醛的測量值 之比W'為橫坐標(biāo)，以V為縱坐標(biāo)，得線性關(guān)系曲線2 ;
[0023] 步驟5)中色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為
[0024] Tr =mA+n (2)
[0025] 線性關(guān)系曲線1的線性方程為
[0026] U = kff+j (3)
[0027] 線性關(guān)系曲線2的線性方程為
[0028] V = pff ; +q (4)
[0029] 推導(dǎo)下箴刺桐堿的濃度P的計算公式為
[0030] p = [V (X 一 X0) 一 n]/mU (5)
[0031] 即：
[0033] 其中X為不添加甲醛測得的待測液熒光強度，Y為添加甲醛后待測液的熒光強度， XD、Yc分別為添加甲醛前后空白對照的熒光強度，P的濃度單位與測定色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線時A 的單位相同，P的單位為μ g/L。公式（6)的建立；
[0034] 步驟6)中取1份體積的待測下箴刺桐堿溶液，加9份pH7. 4磷酸氫二鈉/磷酸二 氫鈉緩沖溶液，試測此稀釋液的熒光強度，熒光強度應(yīng)在1000至4000范圍內(nèi)，若熒光強度 過高，可再適當(dāng)稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)；測得合適的熒光強度X后，按步驟5)中的公式計算 出稀釋后下箴刺桐堿溶液的濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出原溶液中下箴刺桐堿的濃度。
[0035] 有益效果
[0036] 本發(fā)明為一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法，能直接用熒光光譜法 在色氨酸雜質(zhì)存在條件下定量下箴刺桐堿的熒光量，避免色氨酸雜質(zhì)對測試結(jié)果的影響， 本法前處理時間短、檢測成本低、能快速大批量檢測。
【附圖說明】
[0037] 圖1為添加等體積的濃度為40%甲醛前后，下箴刺桐堿溶液的熒光光譜；
[0038] 圖2為添加等體積的濃度為40%甲醛前后，色氨酸溶液的熒光光譜；
[0039] 圖3為色氨酸的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0040] 圖4為線性關(guān)系曲線1 ;
[0041] 圖5為線性關(guān)系曲線2。
【具體實施方式】
[0042] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的闡述，但不是對本發(fā)明的限定。
[0043] 實施例
[0044] -種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法，包含如下步驟：
[0045] 1)配制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0046] 2)配制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與下箴刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的熒光強度， 繪制混標(biāo)準(zhǔn)合液的標(biāo)準(zhǔn)曲線；計算混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中色氨酸質(zhì)量濃度A與下箴刺桐堿質(zhì)量濃 度B的比值U
[0047] 3)線性關(guān)系曲線1的繪制
[0048] 4)線性關(guān)系曲線2的繪制
[0049] 5)推導(dǎo)下箴刺桐堿的濃度的計算公式
[0050] 6)下箴刺桐堿溶液濃度的確定
[0051] 步驟1)中配制一定濃度梯度的色氨酸溶液，測定其熒光強度，以濃度值為橫坐 標(biāo)，對應(yīng)各濃度值的熒光強度為縱坐標(biāo)繪制色氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0052] 步驟2)中配制色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與下箴刺桐堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按一定體積比混合，計 算混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中色氨酸質(zhì)量濃度A與下箴刺桐堿質(zhì)量濃度B的比值U并記錄；
[0053] 步驟3)中測定標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的熒光強度X，空白對照組（蒸餾水）的熒光強度為 X。，在試管中分別滴加甲醛，靜置1小時，再測定添加甲醛后的混合溶液的熒光強度Y，空白 對照組（蒸餾水中滴加甲醛）的熒光強度為Y。，
[0054] W = Y/X (1)
[0055] 式中W為橫坐標(biāo)，以色氨酸與下箴刺桐堿的質(zhì)量濃度之比（U)為縱坐標(biāo)，得到線性 關(guān)系曲線1 ;
[0056] 步驟4)中使用步驟2)試管中色氨酸質(zhì)量濃度在步驟1)中對應(yīng)的熒光強度值記 為Z，空白對照組如蒸餾水的熒光強度為Z。，計算減去空白值后的值Z'與減去空白值后的 不添加甲醛的色氨酸熒光強度值t之比V，以每只試管添加甲醛與不添加甲醛的測量值 之比W'為橫坐標(biāo)，以V為縱坐標(biāo)，得線性關(guān)系曲線2 ;
[0057] 步驟5)中色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為
[0058] Τ' = mA+n (2)
[0059] 線性關(guān)系曲線1的線性方程為
[0060] U = kff+j (3)
[0061] 線性關(guān)系曲線2的線性方程為
[0062] V = pff ; +q (4)
[0063] 推導(dǎo)下箴刺桐堿的濃度P的計算公式為
[0064] P = [V (X - X0) - n]/mU (5)
[0065] 艮P :
[0067] 其中X為不添加甲醛測得的待測液熒光強度，Y為添加甲醛后待測液的熒光強度， XD、Yc分別為添加甲醛前后空白對照的熒光強度，P的濃度單位與測定色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線時A 的單位相同，P的單位為μ g/L。公式（6)的建立；
[0068] 步驟6)中取1份體積的待測下箴刺桐堿溶液，加9份pH7. 4磷酸氫二鈉/磷酸二 氫鈉緩沖溶液，試測此稀釋液的熒光強度，熒光強度應(yīng)在1000至4000范圍內(nèi)，若熒光強度 過高，可再適當(dāng)稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)；測得合適的熒光強度X后，按步驟5)中的公式計算 出稀釋后下箴刺桐堿溶液的濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出原溶液中下箴刺桐堿的濃度。 [0069] 下箴刺桐堿與色氨酸都具有天然熒光，在添加等體積的甲醛（濃度為40% )前后， 下箴刺桐堿溶液的熒光光譜如圖1所示，可見熒光強度降低了一半。在添加等體積的甲醛