一種燕窩制品實時熒光pcr鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及化學檢測技術領域，具體涉及燕窩的鑒定方法。
【背景技術】
[0002]燕窩是中國自明代以來開始被食用的傳統名貴食品之一，是指雨燕目雨燕科金絲燕屬的幾種金絲燕攝食的昆蟲、海藻、銀魚等物經消化后，分泌出來的唾液與絨羽等混合筑成的巢窩。燕巢呈半月形，，直徑6?7厘米，基底厚，廓壁薄，重約5?15克。燕巢外圍整齊，內部粗糙，有如絲瓜網絡。主要產自印尼、馬來西亞、泰國和越南等東南亞國家。
[0003]中醫(yī)認為燕窩:〃養(yǎng)陰潤燥、益氣補中、治虛損、咳痰喘、咯血、久痢”，適宜于體質虛弱，營養(yǎng)不良，久痢久瘧，痰多咳嗽，老年慢性支氣管炎、支氣管擴張、肺氣腫、肺結核、咯血吐血和胃痛病人食用。研究發(fā)現燕窩含有豐富的活性蛋白質，以及鈣、磷、鐵等微量元素。其含有的表皮生長因子和水溶性物質能夠刺激細胞分裂、再生和組織重建，促進人體康復。同時能增強人體免疫力，抵抗病毒和感冒。由于燕窩具有較高的營養(yǎng)和保健價值，市場對燕窩制品的需求量日益增加。一些商販以銀耳、豬皮、瓊脂、果膠等原料偽造燕窩制品，危害了消費者的利益。
[0004]目前燕窩真?zhèn)舞b定方法主要是經驗鑒別法、顯微鑒別法和儀器鑒別法(包括凝膠電泳法、紅外光譜法、氣相色譜法等)。這些方法中有的準確性不高，靈敏度低；有的提取純化程序冗長，重現性不好；有的鑒別成本高昂。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，解決以上技術問題。
[0006]本發(fā)明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現:
[0007]一種燕窩制品實時熒光PCR鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008]步驟一，待檢燕窩制品DNA的提?。?br>[0009]步驟二，金絲燕成分實時熒光PCR擴增；
[0010]首先，在PCR反應管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各
0.5-1 μ L，Taqman 探針 0.5-1 μ L，50ng/μ L 待檢燕窩制品 DNA1-2 μ L，補充雙蒸水至 25 μ L，混勻；
[0011]其次，將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0012]a.94-95 °C 5min，I 個循環(huán)，預變性；
[0013]b.94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，40 個循環(huán)，PCR 擴增；
[0014]步驟三，使用實時熒光PCR儀分析軟件分析擴增結果。
[0015]本發(fā)明的主要原理是燕窩主要來自金絲燕的唾液，里面含有金絲燕的DNA，通過檢測燕窩中的金絲燕12S rRNA基因來鑒別燕窩的真假。如果燕窩制品中能檢出金絲燕特異性12S rRNA基因，則待檢燕窩制品為真燕窩；如果未檢出金絲燕特異性12S rRNA基因，說明待檢燕窩制品為假冒燕窩。
[0016]本發(fā)明特異性好、靈敏度高的特點，簡單快速，整個檢測過程只需要3?4小時。
[0017]步驟一中，待檢燕窩制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。
[0018]在步驟二與步驟三之間，進行DNA濃度的測定，將DNA濃度調整為50ng/ μ L，首先使用紫外分光光度計檢測提取待檢燕窩制品DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值在1.7?2.0之間，按以下公式計算DNA濃度:
[0019]C = A*N*50 ;
[0020]其中C— DNA濃度，單位為ng/ μ L ;
[0021]A — 260nm處的吸光值；
[0022]N — DNA稀釋倍數；
[0023]將DNA濃度稀釋到50ng/ μ L0
[0024]步驟二中，通過對金絲燕特異性12S rRNA基因進行擴增。
[0025]通過特異性擴增金絲燕的12S rRNA基因序列對燕窩進行鑒定，擴增的DNA片段大小為144bp。
[0026]步驟二中，擴增金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan探針的序列如下:
[0027]上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’
[0028]下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’ ；
[0029]TaqMan 探針序列:
[0030]5，-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3，，
[0031]其中5’端標記FAM報告熒光集團，3’端標記TAMRA淬滅熒光基團。
[0032]在應用中，上游引物、下游引物、TaqMan探針的濃度為lOymol/L。
[0033]本發(fā)明根據金絲燕的12S rRNA基因特異性序列設計一對組引物(上游引物SffT-F:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’ 和下游引物 SWT_R:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3 ’)和一條 Taqman 探針(探針 SWT-P 序列為:5 ’ -FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’)。進行核酸檢測時，模板DNA經加熱至94?95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性結合。探針的5端標記有報告熒光集團，3端有淬滅熒光集團，當探針完整的時候，報告集團所發(fā)射的熒光能量被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結合的探針時，其3’ 一5’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告集團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。隨著PCR循環(huán)的增加，目的片段成指數增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反應模板數量。
[0034]本發(fā)明對待檢燕窩制品進行檢測時，每個待檢燕窩制品同時做兩個平行。
[0035]步驟二中，對金絲燕成分實時熒光PCR擴增時，應設立三個對照:陽性對照(金絲燕基因組DNA)、陰性對照(非金絲燕基因組DNA)、空白對照(不含DNA模板，可以水代替)；
[0036]并且，同時擴增真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因。
[0037]步驟二中，同時檢測真核生物18S rRNA基因以判斷是否從待檢燕窩制品中提取適宜進行實時熒光PCR的DNA或提取的DNA中是否存在PCR反應抑制因子；
[0038]步驟二中，分別配置真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探針。
[0039]本發(fā)明涉及的真核生物18S rRNA基因引物和探針序列參考標準GB/T25165-2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法》:
[0040](I)上游引物 18S-F:5’ -CCTGAGAAACGGCTACCAC-3，；
[0041](2)下游引物 18S-R:5’ -CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’ ；
[0042](3) TaqMan 探針 18S-P:5’ -TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’，其 5’ 端標記 FAM 報告熒光集團，3’端標記TAMRA淬滅熒光基團。
[0043]步驟三，分析擴增結果時，應設置的各種對照實時PCR檢測結果應全部符合以下情況，否則應重做實驗:
[0044]a.陽性對照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都出現擴增曲線，Ct值小于30 ;
[0045]b.陰性對照的真核生物18S rRNA基因出現擴增曲線，Ct值小于30，金絲燕12SrRNA基因未出現擴增曲線，Ct值彡40 ；
[0046]c.空白對照的真核生物18S rRNA基因和金絲燕12S rRNA基因都未出現擴增曲線，Ct值Ct值彡40。
[0047]此外，待檢燕窩制品的真核生物18S rRNA基因實時PCR檢測結果Ct值應小于30，否則重新提取DNA。
[0048]只有在滿足以上兩種情況下，判斷待檢燕窩制品是否含有燕窩成品，判斷方法如下:
[0049]a.如待檢燕窩制品出現擴增曲線，且Ct值小于或等于35，陰性對照、陽性對照和空白對照結果都成立(即陽性待檢燕窩制品出現典型陽性擴增曲線，陰性待檢燕窩制品盒空白對照無擴增)，則可判定該待檢燕窩制品檢測出燕窩成分；