一種葡萄糖氧化酶酶活性的測(cè)量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶活性測(cè)量技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種葡萄糖氧化酶酶活性的測(cè)量方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶是一種具有高效催化效率的糖蛋白，在有氧氣的情況下催化葡萄糖 轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過氧化氨，葡萄糖氧化酶活力的測(cè)量是研究其性能的基礎(chǔ)，目前有一些 方法來測(cè)量，如鹽酸滴定法中，當(dāng)向葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖反應(yīng)體系中加入氨氧化 鋼時(shí)，反應(yīng)會(huì)被其終止，然后再用一定量的鹽酸溶液滴定，計(jì)算出鹽酸溶液的消耗量，從而 得出葡萄糖氧化酶的活性。
[0003] 但是大多數(shù)研究者還是更傾向于利用其催化β-D-葡萄糖時(shí)產(chǎn)生的過氧化氨，在過 氧化物酶存在的情況下，催化顯色劑，測(cè)定有色產(chǎn)物的生成速率，W此測(cè)定酶的活性。苯酪 和鄰聯(lián)茵香胺是兩種常見的發(fā)色體。但是，苯酪易揮發(fā)，對(duì)人體有害，鄰聯(lián)茵香胺在水溶液 中的溶解度很低，而且生成的有色產(chǎn)物的最大吸收峰在400nm處，該吸收峰處不穩(wěn)定的，容 易被樣本中的一些背景材料所干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種葡萄糖氧化酶酶活性的測(cè)量方法。 [000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種葡萄糖氧化酶酶活性的測(cè)量方法，其包括如下步驟： 1) 配置pH值為5.8的憐酸鹽緩沖液，然后室溫下依次加入辣根過氧化物酶液、葡萄糖氧 化酶液、愈創(chuàng)木酪溶液和葡萄糖溶液； 2) 當(dāng)加入葡萄糖后酶促反應(yīng)開始，此時(shí)開始計(jì)時(shí)，在吸收波長為470nm條件下采用紫外 可見光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描，獲得產(chǎn)物四鄰甲氧基連酪的吸光值隨時(shí)間的變化數(shù)據(jù)； 3) 根據(jù)朗伯比爾定律將四鄰甲氧基連酪的吸光值換算為濃度，然后W時(shí)間為橫坐標(biāo)， 濃度為縱坐標(biāo)，在excel中作散點(diǎn)圖，添加趨勢(shì)線，趨勢(shì)線斜率即為四鄰甲氧基連酪的生成 速率，該生成速率乘W系數(shù)4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反應(yīng)速率，再根據(jù)酶活力單 位定義進(jìn)行換算即得到葡萄糖氧化酶酶活性。
[0006] 依據(jù)朗伯比爾定律，采用公式c= A/eb將四鄰甲氧基連酪的吸光值換算為濃度;式 中，C為四鄰甲氧基連酪的濃度;A為吸光值;ε為四鄰甲氧基連酪470nm處的摩爾吸收系數(shù);b 為比色皿光程，1cm。
[0007] 其中，四鄰甲氧基連酪的生成速率的計(jì)算原理如下所示：
式中，V為四鄰甲氧基連酪的生成速率； A2、Ai分別為t2、ti時(shí)四鄰甲氧基連酪470nm處的吸光值，t2、ti單位s; b為比色皿光程，1cm; ε為四鄰甲氧基連酪470nm處的摩爾吸光系數(shù)。
[0008] 具體的，酶促反應(yīng)中，辣根過氧化物酶的濃度為2.5X10-5mmol/レ葡萄糖氧化酶的 初始濃度為9Xl(T6mmol/L，愈創(chuàng)木酪的初始濃度為3mmol/l;葡萄糖的初始濃度為50mmol/ L。
[0009] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明方法利用光譜學(xué)儀器-紫外可見光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，使用的體系是葡萄糖 氧化酶化0D)-辣根過氧化物酶(HRP)-愈創(chuàng)木酪化uaiacol)禪聯(lián)體系，利用愈創(chuàng)木酪和葡萄 糖氧化酶催化葡萄糖產(chǎn)生的過氧化氨在皿P催化下生成的有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酪，該有 色產(chǎn)物在4 7 0nm波長光照射時(shí)有光吸收，而且隨著有色產(chǎn)物的增加，光的吸收越強(qiáng)，吸光值 越大。根據(jù)470nm處四鄰甲氧基連酪的摩爾吸光系數(shù)，利用朗伯比爾定律換算為四鄰甲氧基 連酪的濃度，做出時(shí)間-濃度散點(diǎn)圖，其斜率便是該四鄰甲氧基連酪的生成速率。然后根據(jù) 反應(yīng)比例乘W相應(yīng)系數(shù)4得到GOD催化葡萄糖的反應(yīng)速率，再根據(jù)酶活力單位定義進(jìn)行換算 即可。
[0010] 此外，本發(fā)明試驗(yàn)過程中還使用鄰聯(lián)茵香胺方法測(cè)量，對(duì)比吸光度的變化?？傮w來 說，葡萄糖氧化酶(GOD)-辣根過氧化物酶(HRP)-愈創(chuàng)木酪化uaiacol)禪聯(lián)體系測(cè)量葡萄糖 氧化酶酶活性的新方法具有操作簡便，便于控制，反應(yīng)現(xiàn)象明顯，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu) 點(diǎn)。
【附圖說明】
[0011 ]圖巧四鄰甲氧基連酪的時(shí)間濃度變化圖； 圖2為本發(fā)明葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶-愈創(chuàng)木酪禪聯(lián)體系的光譜掃瞄圖； 圖3為溶液pH值對(duì)葡萄糖氧化酶酶活性的影響； 圖4為采用本發(fā)明禪聯(lián)體系（圖中a)和采用現(xiàn)有鄰聯(lián)二茵香胺體系（圖中b)測(cè)量葡萄糖 氧化酶酶活性的對(duì)比； 圖5為葡萄糖氧化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，圖中，（A):隨葡萄糖濃度變化反應(yīng)速率變化 圖；（B):雙倒數(shù)作圖； 圖6為采用本發(fā)明葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶-愈創(chuàng)木酪禪聯(lián)體系測(cè)量葡萄糖氧化 酶酶活性的可重復(fù)性檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不局限于此。
[001引原理及方法 1.1試劑： 憐酸鹽緩沖液（Na2HP04-NaH2P04, Sigma公司）、辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP, Sigma公司）、葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD, Sigma公司）、葡 萄糖（Glucose，Sigma公司）、愈創(chuàng)木酪溶液（Guaiacol，Sigma公司）、鄰聯(lián)二茵香胺（ο- 01日]1131(1;[]16,51邑1]1日公司）、雙蒸水(出0)。
[0014] 1.2試劑配制： ①憐酸鹽緩沖液(Na2HP〇4-N址2P〇4)的配制： 取89.5g Na2HP〇4和39.0g Na出P化分別用雙蒸水定溶于500mL容量瓶，摩爾濃度為 500mmol/L。實(shí)驗(yàn)所需緩沖液濃度為50mmol/L，分別將化抽Κ)4和Na此Κ)4母液稀釋10倍后，將 二者按一定體積比調(diào)制pH值為5.8。配制好后，4°C低溫儲(chǔ)存。
[0015] ②愈創(chuàng)木酪化uaiacol)溶液的配制： 取ImL濃度為9mol/L的愈創(chuàng)木酪溶液，加入99mL溫?zé)?<60°C)雙蒸水中，搖晃，使愈創(chuàng)木 酪充分溶解于雙蒸水中，稀釋后的摩爾濃度為90mmol/L。配制好后，避光常溫儲(chǔ)存。
[0016] ③辣根過氧化物酶(HRP)溶液的配制： 取5mg辣根過氧化物酶于2mL的EP管中，加入ImL雙蒸水溶解，摩爾濃度為1.25 X 10一 Vol/L作為母液，-20°C冷凍儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)前解凍母液，取30化加入4970化配好的憐酸鹽緩沖 液中，摩爾濃度為7.5 X 1 οΛιπιο 1/L，待用。
[0017] ④葡萄糖氧化酶(GOD)溶液的配制： 取14.4mg辣根過氧化物酶于2mL的EP管中，加入ImL雙蒸水溶解，摩爾濃度為9Xl〇- 2mm〇l/L作為母液，-20°C冷凍儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)前解凍母液，取15化加入4985化配好的憐酸鹽緩沖 液中，摩爾濃度為2.7 X 1 (T4mmo 1/L，待用。
[0018] ⑤葡萄糖化lucose)溶液的配制： 取1.44g葡萄糖溶于8ml配好的憐酸鹽緩沖液中作為母液，葡萄糖的摩爾濃度為 lOOOmmol/L。用憐酸鹽緩沖液對(duì)其稀釋梯度，W備實(shí)驗(yàn)所需濃度。配制好后，常溫儲(chǔ)存。
[0019] ⑥鄰聯(lián)二茵香胺(0-Dianisidine)溶液的配制： 取1.173mg鄰聯(lián)二茵香胺溶于ImL配好的憐酸鹽緩沖液中，鄰聯(lián)二茵香胺的摩爾濃度為 4.8mmol/L。配制好后，封口膜封口通風(fēng)楓常溫儲(chǔ)存。
[0020] 1.3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 采用光