專利名稱：氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固定化酶領(lǐng)域，特別是一種氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法。
背景技術(shù)：
與傳統(tǒng)的化學(xué)催化相比，酶催化具有溫和的轉(zhuǎn)化條件、高的反應(yīng)速率、優(yōu)異的選擇性等優(yōu)點(diǎn)。在大力倡導(dǎo)流程工業(yè)綠色化、節(jié)能減排的新形勢(shì)下，酶催化將在大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品的工藝取代以及環(huán)境化學(xué)等方面發(fā)揮日益重要的作用。由于固定化酶具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用、易分離等優(yōu)點(diǎn)，成為酶催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿。但由于以下方面的約束，限制了酶催化更廣泛的應(yīng)用(I)脫離了細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境，酶在細(xì)胞外對(duì)溫度和PH耐受范圍窄、適應(yīng)性差、易失活等；(2)酶提取純化的費(fèi)用較高，而在應(yīng)用過(guò)程中重復(fù)利用率低， 造成酶催化成本較高；(3)對(duì)非天然底物的催化活性低；(4)操作穩(wěn)定性差、重復(fù)利用率低、生產(chǎn)成本較高。因此，如何最大限度地提高酶在胞外環(huán)境中的活性和穩(wěn)定性、使其更有效的適應(yīng)非生理催化環(huán)境、實(shí)現(xiàn)高效催化是新一代工業(yè)生物催化技術(shù)發(fā)展的重要課題。其中采用新穎的固定化酶技術(shù)、改造和發(fā)展高效固定化酶催化劑是解決以上問(wèn)題的重要途徑。而作為無(wú)化學(xué)損傷的定向固定化方法是最具實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的技術(shù)之一，已成為近年來(lái)固定化酶領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前定向固定化方式主要有利用酶和它的相應(yīng)抗體之間的親和性；利用生物素-親和素之間的特異親和性；通過(guò)酶分子上的糖基部分固定化；酶分子上的特定氨基酸殘基和金屬離子形成復(fù)合物；用基因工程手段改造酶分子使酶定向固定化。其中通過(guò)酶分子上的糖基部分與凝集素結(jié)合實(shí)現(xiàn)定向固定化可以確保酶的空間取向一致，酶在載體表面呈一定的方向排列，不必需氨基酸殘基參與共價(jià)結(jié)合，無(wú)化學(xué)損傷作用，且酶的活性位點(diǎn)面朝固體表面的外側(cè)排列，有利于底物與酶的活性位點(diǎn)接觸，能夠顯著提高固定化酶的活性。而伴刀豆球蛋白A是一種常用的植物凝集素蛋白，對(duì)含有甘露糖或葡萄搪的糖蛋白有特異的親和力，本發(fā)明所使用的葡萄糖氧化酶是一種含糖酶。因此本發(fā)明使用伴刀豆球蛋白A作為凝集素，利用伴刀豆球蛋白與葡萄糖氧化酶糖鏈間的特異生物親和力實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的定向固定化。葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, E. C. I. I. 3. 4,簡(jiǎn)稱GOD)是催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸的酶，屬于需氧脫氫酶類，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)。因GOD能夠利用O2將葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效去除氧，因而被廣泛用于食品、啤酒、飲料等包裝的除氧，此外GOD在蛋品加工、葡萄糖的定量分析、金屬防腐、葡萄糖酸、生物傳感器以及醫(yī)學(xué)上的快速檢驗(yàn)等方面也有著廣泛的應(yīng)用。因游離GOD存在不穩(wěn)定、不可重復(fù)使用和不易于分離等缺點(diǎn)而限制了大規(guī)模使用。通過(guò)GOD的固定化，不僅可提高酶的穩(wěn)定性，還可以擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。目前固定化方法主要有吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法。如，Liu等人(J. Mater.Chem.，2012，22，15085 15091)以Fe3O4-纖維素-殼聚糖雜化凝膠微球?yàn)檩d體，戊二醛為交聯(lián)劑，共價(jià)固定G0D，結(jié)果表明在4h時(shí)固定化酶催化葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)91. 5%，并且重復(fù)使用15次后酶活力仍能保持84. 2%ο Huang等人(Biotechnol. Lett. , 2010, 32, 817 821; Mat. Sci. Eng. C，2011，31，1374 1378)分別以 Fe304/Si02 磁性納米粒子和 SiO2 納米粒子為載體共價(jià)固定化GOD。GOD被固定化后其熱力學(xué)穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均得到了很大提高。如以SiO2納米粒子為載體制備所得的固定化酶45°C下浸泡360min時(shí)酶活力仍然能保持85%,并且重復(fù)使用6次后酶活力仍能保持87%。Sohn等人(Biotechnol.Bioprocess Eng.，2008, 13，716 723)制備Fe3O4磁性納米粒子固定化GOD并應(yīng)用與生物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，獲得了較好的效果。Ying等人(J. Membr. Sci. , 2002，208:361 374)和Li等人(Biomaterials, 1998, 19:45 53)在聚偏氟乙烯修飾的微孔膜和聚苯胺膜上共價(jià)固定G0D,結(jié)果表明酶的穩(wěn)定性得到了很大提高，4°C下儲(chǔ)存30天后酶活仍然維持85%的活性。蔣利偉(北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，34(4) :428 431)等人以管狀空心SiO2為載體，對(duì)GOD進(jìn)行固定，得到了較好的操作與穩(wěn)定性；曾嘉等人(食品工業(yè)科技，2002，1 (23) :29 37)以戊二醛為交聯(lián)劑，利用殼聚糖微球制備了固定化G0D，確定了固定GOD的最佳條件，并得到了較高的酶活回收率；周濤等人(生物工程學(xué)報(bào)，2012，28 (4) :476 487)以殼聚糖為載體，在不同有機(jī)相中對(duì)GOD進(jìn)行固定化研究，結(jié)果表明在合適的有機(jī)相中固定GOD可以獲 得更優(yōu)的性質(zhì)。雖然以上這些固定化方法使酶的穩(wěn)定性得到了不同程度的提高，但目前應(yīng)用的這些固定化方法都是隨機(jī)固定化方法。隨機(jī)固定化葡萄糖氧化酶必然存在著一些不可消除的問(wèn)題，如單體、交聯(lián)劑、溶劑、引發(fā)劑等都會(huì)在不同程度上破壞酶的活性，因此，研究更溫和的固定化酶技術(shù)具有重要意義，而定向固定化技術(shù)正好可以消除這些問(wèn)題。故本發(fā)明采用定向固定化技術(shù)固定化葡萄糖氧化酶。另外在決定固定化酶系統(tǒng)的特性方面，固定化載體的特性是極其重要的。目前，納米材料在生物催化、藥物控制釋放、生物傳感器等領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力，納米技術(shù)的迅速發(fā)展為提高酶的活性和穩(wěn)定性帶來(lái)了新的機(jī)遇，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。2004年,Andre K. Geim等首次發(fā)現(xiàn)了石墨烯,作為繼富勒烯和碳納米管后又一里程碑式的納米新材料，石墨烯的制備、性質(zhì)和應(yīng)用迅速成為研究熱點(diǎn)。而作為氧化還原法制備石墨烯的前體，氧化石墨烯也引起了研究者的極大關(guān)注。它的結(jié)構(gòu)與石墨烯大體相同，只是在一層碳原子構(gòu)成的二維空間無(wú)限延伸的基面上連有羧基、羥基、羰基等官能團(tuán)，故氧化石墨烯亦稱功能化石墨烯。因其擁有大量的含氧基團(tuán)，因此可以通過(guò)某些化學(xué)反應(yīng)將一些有機(jī)小分子或大分子物質(zhì)(如酶)組裝到氧化石墨烯上，從而使氧化石墨烯具有一些特殊的性質(zhì)。同時(shí)，氧化石墨烯的層間距較原始石墨的層間距大，有利于其他物質(zhì)分子的插層。如Zhang等人(Langmuir, 2010, 26, 6083 6085)以氧化石墨烯為載體，以辣根過(guò)氧化酶為模型酶構(gòu)建的新型納米固載酶體系對(duì)許多酚類化合物均有較好的去除效果。但到目前為止，文獻(xiàn)中還未見(jiàn)以氧化石墨烯為載體對(duì)葡萄糖氧化酶進(jìn)行定向固定化的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、對(duì)酶活損失小的固定化葡萄糖氧化酶的方法，它是以氧化石墨烯為固定化載體，利用酶分子上的糖基與伴刀豆蛋白A的特異性親和力實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的定向固定化，該方法固定化酶制備工藝簡(jiǎn)單，酶活損失小且固定化效率較高。本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是
—種固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法，其具體步驟是I)氧化石墨烯的酯化將氧化石墨烯溶于蒸餾水中，超聲混合得到濃度為lmg/mL的氧化石墨烯懸濁液；向該懸濁液中加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，其配比為在每50 μ L lmg/mL氧化石墨烯懸池液中加入100 μ g N-輕基硫代琥珀酰亞胺和44. Iygl-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，然后用2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(O. 1M, pH 6. O)定容使I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二胺終濃度為20mM，振搖30mi η后，高速離心，棄去上清液，在沉淀中加入O. 05M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(ΡΗ6. O)洗滌，離心分離，最后沉淀在真空干燥24h即得酯化氧化石墨烯；2)定向固定化酶的制備取上步得到的酯化氧化石墨烯重新懸浮于蒸餾水中，超聲分散得到均勻的lmg/mL酯化氧化石墨烯懸濁液，在懸濁液中加入已活化的伴刀豆蛋白A溶液(PH7. 0)，其配比為在50 μ L酯化氧化石墨烯溶液中加入300 1500 μ L O. lmg/mL伴刀豆蛋白A，反應(yīng)60min后，4°C高速離心，棄去上清液，沉淀用0.05M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6. O)充分洗滌；在沉淀中加入pH 4. 5 8. O的葡萄糖氧化酶溶液(O. 5mg/mL)，其配比為質(zhì)量比伴刀豆蛋白A :葡萄糖氧化酶=1: 5，反應(yīng)30 120min，4°C高速離心，棄去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)充分洗滌后，真空冷凍干燥24h即得定向固定化·葡萄糖氧化酶。所述的葡萄糖氧化酶溶液是按照配比為Img葡萄糖氧化酶溶解于2mL、pH值為4. 5 8. O的磷酸鹽緩沖液中配制得到；所述的伴刀豆蛋白A活化過(guò)程是將伴刀豆蛋白A溶于含O. lmol/L KCl、lmmol/LCaCl2 和 lmmol/L MnCl2 的 O. lmol/L PBS (pH 7. O)中配成 O. lmg/mL 的蛋白質(zhì)溶液,并于4 °C冰箱中活化12h。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明是一種制備固定化酶的方法，由于采用了伴刀豆蛋白A，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的定向固定化，避免了隨機(jī)固定化造成的酶活性位點(diǎn)取向不一致或酶活性位點(diǎn)被掩蓋等缺點(diǎn)，提高了固定化效率和固定化酶的活性；2.本發(fā)明制備固定化酶的工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)酶活性損失小，酶活可達(dá)150 195U/mg。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的氧化石墨烯購(gòu)自中科碳納米科技有限公司。本發(fā)明所用的葡萄糖氧化酶、伴刀豆蛋白A、I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳化二胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺和2- (N-嗎啉代)乙磺酸均購(gòu)于sigma公司。本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖溶液為Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液，不同pH值的緩沖液按如下方法配制得到稱取Na2HPO4及NaH2PO4,分別配制成O. IM的溶液，用pH計(jì)標(biāo)定二者混合液的pH至所需pH。本發(fā)明所用的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液按如下方法配制得到稱取I. 952g2- (N-嗎啉代)乙磺酸于燒杯中，加少量水溶解再轉(zhuǎn)至IOOmL容量瓶中定容，并用NaOH調(diào)pH至6.0，即可配成pH 6. 00. lmol/L的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；稱取O. 976g2- (N-嗎啉代)乙磺酸于IOOmL容量瓶中，加少量水定容，并用NaOH調(diào)pH至6. O,即可配成pH 6. 00. 05mol/L的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液。實(shí)例I :
將氧化石墨烯溶于蒸懼水中,超聲混合60min后得到分散均勻的濃度為lmg/mL的氧化石墨烯懸池液。取50 μ L lmg/mL氧化石墨烯懸浮液，向其中加入100 UgN-輕基硫代琥珀酰亞胺和44. I μ g I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二胺，用2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(O. 1M, pH 6. O)定容使I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二胺終濃度為20mM，劇烈振搖30min后,在13000r/min下離心20min,棄去上清液,在沉淀中加入O. 05M 2_(N_嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6.0)洗滌，離心，棄上清液，重復(fù)洗滌、離心分離步驟三次，最后沉淀在40°C下真空干燥24h即得酯化氧化石墨烯；將上面得到的酯化氧化石墨烯重新懸浮于蒸餾水中，超聲IOmin得到50 μ L分散均勻的濃度為lmg/mL的酯化氧化石墨烯懸池液，向其中加入300 μ L已活化 的O. lmg/mL伴刀豆蛋白 A 溶液(pH 7. O)反應(yīng) 60min,4°C 13000r/min 下離心 20min,用 O. 05M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6. O)洗滌3次，得沉淀；在沉淀中加入300 μ L pH 4. 5的O. 5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反應(yīng)30min，4°C 13000r/min下離心20min，用PBS洗滌3次，沉淀真空冷凍干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法測(cè)定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活為150U/mg。比色法測(cè)定酶活方法取I. 5mL溶液A (3. 5mg辣根過(guò)氧化物酶和3. 5mg4_氨基安替吡啉溶于20mL pH 7. O的PBS緩沖液中，再加入ImL 3%的苯酚溶液，即得A液)和I. 5mL溶液B( 13g葡萄糖中加入87g蒸餾水，即得B溶液)混合均勻后加入到固定化酶中，于25°C劇烈震蕩30s，過(guò)濾，測(cè)其上清液在500nm處不同時(shí)間的吸光度值。實(shí)例2:氧化石墨烯的酯化方法同實(shí)例I ;將酯化氧化石墨烯重新懸浮于蒸餾水中，超聲IOmin得到50 μ L分散均勻的濃度為lmg/mL的酯化氧化石墨烯懸池液，向其中加入700 μ L已活化的O. lmg/mL伴刀豆蛋白A(ρΗ7· O)反應(yīng) 60min, 13000r/min 4°C離心 20min,用 O. 05M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6. O)洗滌3次，得沉淀；在沉淀中加入700 μ L pH 5. 5的O. 5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反應(yīng)60min, 13000r/min 4°C離心20min,用PBS洗漆3次,沉淀真空冷凍干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法測(cè)定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活為195U/mg。酶活測(cè)定方法同實(shí)例I。實(shí)例3 氧化石墨烯的酯化方法同實(shí)例I ;將酯化氧化石墨烯重新懸浮于蒸餾水中，超聲IOmi η得到50 μ L分散均勻的濃度為lmg/mL的酯化氧化石墨烯懸池液，向其中加入1000 μ L已活化的O. lmg/mL伴刀豆蛋白A(ρΗ7· O)反應(yīng) 60min, 13000r/min 4°C下離心 20min,用 O. 05M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6. O)洗滌3次，得沉淀；在沉淀中加入1000 μ L ρΗ7. O的O. 5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反應(yīng)120min, 13000r/min 4°C下離心20min,用PBS洗漆3次,沉淀真空冷凍干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法測(cè)定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活為180U/
mg ο酶活測(cè)定方法同實(shí)例I。實(shí)例4 氧化石墨烯的酯化方法同實(shí)例I ;
將酯化氧化石墨烯重新懸浮于蒸餾水中，超聲IOmin得50 μ L分散均勻的濃度為lmg/mL的酯化氧化石墨烯懸池液，向其中加入1500 μ L已活化的O. lmg/mL伴刀豆蛋白A(pH 7. O)反應(yīng) 60min, 13000r/min 4°C下離心 20min,用 O. 05M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(PH6. O)洗滌3次，得沉淀；在沉淀中加入1500 μ L pH 8的O. 5mg/mL葡萄糖氧化酶溶液反應(yīng)60min, 13000r/min 4°C下離心20min,用PBS洗漆3次,沉淀真空冷凍干燥24h即得定 向固定化葡萄糖氧化酶。采用比色法測(cè)定固定化酶活性，得到固定化酶的酶活為165U/mg。酶活測(cè)定方法同實(shí)例I。
權(quán)利要求
1.一種固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法，其特征包括以下步驟 1)氧化石墨烯的酯化將氧化石墨烯溶于蒸餾水中，超聲混合得到分散均勻的濃度為I mg/mL的氧化石墨烯懸濁液；向該懸濁液中加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺,其配比為在每50 μ L I mg/mL氧化石墨烯懸池液中加入100 UgN-羥基硫代琥珀酰亞胺和44. I Ug I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二胺，然后用2- (N-嗎啉代 )乙磺酸緩沖液(O. I M, pH 6. O)定容使I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二胺終濃度為20 mM，振搖30 min后，高速離心，棄去上清液，在沉淀中加入O. 05 M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6.0)洗滌，離心分離，最后沉淀在真空干燥24 h即得酯化氧化石墨烯； 2)定向固定化酶的制備取上步得到的酯化氧化石墨烯重新懸浮于蒸餾水中，超聲分散得到分散均勻的I mg/mL酯化氧化石墨烯懸濁液，在懸濁液中加入已活化的伴刀豆蛋白A溶液(pH 7.0)，其配比為在50 “1^酯化氧化石墨烯溶液中加入300 150(^1^ O. I mg/mL伴刀豆蛋白A，反應(yīng)60 min后，4 °C高速離心，棄去上清液，沉淀用0.05 M 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(pH 6. O)充分洗滌；在沉淀中加入pH 4. 5^8. O的葡萄糖氧化酶溶液(O. 5mg/mL),其配比為質(zhì)量比伴刀豆蛋白A :葡萄糖氧化酶=1:5,反應(yīng)3(Tl20 min, 4 °C高速離心，棄去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)充分洗滌后，真空冷凍干燥24 h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。
2.如權(quán)利要求I所述的固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法，其特征為所述的葡萄糖氧化酶溶液是按照配比為I mg葡萄糖氧化酶溶解于2 mL、pH值為4. 5^8. O的磷酸鹽緩沖液中配制得到。
3.如權(quán)利要求I所述的固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法，其特征為所述的伴刀豆蛋白A活化過(guò)程是將伴刀豆蛋白A溶于含O. I mol/L KClU mmol/L CaCljPl mmol/L MnCl2的O. I mol/L PBS (pH 7. 0)中配成0. I mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，并于4 °C冰箱中活化12 h。
全文摘要
本發(fā)明為一種固定化葡萄糖氧化酶的工藝方法，其步驟是1)將氧化石墨烯溶于蒸餾水中，超聲混合得到濃度為1mg/mL的氧化石墨烯懸濁液；向該懸濁液中加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二胺，振搖后，洗滌，分離，得酯化氧化石墨烯；2)向均勻的酯化氧化石墨烯懸濁液中加入已活化的伴刀豆蛋白A，反應(yīng)后離心，充分洗滌沉淀；然后加入葡萄糖氧化酶溶液，反應(yīng)后充分洗滌，真空冷凍干燥24h即得定向固定化葡萄糖氧化酶。本發(fā)明制備固定化酶的方法，固定化效率高，避免了酶活性位點(diǎn)取向不一致或酶活性位點(diǎn)被掩蓋等缺點(diǎn)，從而提高了固定化酶的活性；對(duì)酶活性損失小，酶活可達(dá)150~195U/mg。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102876656SQ201210389959
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者高靜, 周麗亞, 姜艷軍 申請(qǐng)人:河北工業(yè)大學(xué)