一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法，所述納米粒子的成分包括：3?丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA和N?乙烯基己內(nèi)酰胺NVCL。制備方法包括：將AAPBA、NVCL和引發(fā)劑混合，溶解在溶劑中；在無氧條件下，采用可逆加成反應(yīng)，得到聚合物p(NVCL?co?AAPBA)；將聚合物溶于超純水中，300r/min旋轉(zhuǎn)3h，得到具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子。本發(fā)明的方法反應(yīng)簡單快速；納米粒子可以用于包載胰島素，所包裹的胰島素可以隨著葡萄糖濃度的升高，改變釋藥速度，有著很好的實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】
一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于納米粒子的制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前糖尿病已成為影響人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，目前唯一有效的治療方法是每日皮下注射胰島素，給予胰島素可以很好的調(diào)劑其血糖水平，但是卻不能根據(jù)葡萄糖濃度來調(diào)節(jié)其血糖的變化，此外胰島素注射過量可導(dǎo)致低血糖效應(yīng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者亡，所以設(shè)計(jì)一種根據(jù)體內(nèi)的葡萄糖濃度來自動(dòng)調(diào)節(jié)胰島素分泌的智能型載藥系統(tǒng)是十分必要的。近年來關(guān)于葡萄糖敏感性材料被廣泛的研究報(bào)道，伴刀豆球蛋白、葡萄糖氧化酶和苯硼酸系統(tǒng)是三種葡萄糖敏感性的主要單體，由于伴刀豆球蛋白和葡萄糖氧化酶是基于蛋白質(zhì)應(yīng)用的，所以其有一定的缺陷，這主要是由于其在體內(nèi)不穩(wěn)定，可以刺激血液產(chǎn)生抗體，此外其還價(jià)格昂貴，不易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003]相反，PBA可以克服這些缺點(diǎn)，PBA可以提供一個(gè)葡萄糖敏感性的硼羥基，硼羥基可以根據(jù)葡萄糖的濃度而控制自身的大小，進(jìn)而用來調(diào)節(jié)血糖的濃度變化，然而PBA作為葡萄糖敏感性有一個(gè)最大的缺點(diǎn)，就是它的PKa值要遠(yuǎn)高于人體正常情況下的pH值，否則就會(huì)失去其葡萄糖敏感性，所以當(dāng)前許多專家和學(xué)者針對(duì)這種情況想出了三種手段來降低PBA的PKa值。第一種方法外，將使用一種含有羧基的高分子聚合物，這種聚合物可以和硼羥基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致其PKa的下降，另一種方法為將PBA與另一種高分子材料結(jié)合，調(diào)控二者的比例，以尋找一個(gè)最佳的比例，使得其PKa降低，目前溫敏性材料研究最多，這主要是由于溫敏性材料可以改變PBA的溶解度，此外其可以提高藥物的載藥率，進(jìn)而達(dá)到降低其pKa的作用。
[0004]關(guān)于溫敏性材料，應(yīng)用最多的為聚(N-1sopropylacryIamide)P(NIPAAm)，此溫敏性材料被廣泛的應(yīng)用于載藥系統(tǒng)，同時(shí)已有的研究報(bào)道，其可以降低PBA的pKa值，使得其可以適用于載藥系統(tǒng)，然而P(NIPAAm)有一個(gè)最大的缺陷，就是其有一定的毒理性，特別是其在中度到高度的酸性水溶液中可以分解，產(chǎn)生一種有毒的有機(jī)胺成分，這種有機(jī)胺具有一定的神經(jīng)毒性，因此當(dāng)前科學(xué)家均在積極的尋找替代其的溫敏性成分。(N-vinylcaprolactam) P (NVCL)是一種溫敏聚合物，目前已經(jīng)有的研究報(bào)道，其相較于P(NIPAAm)具有明顯的低毒性，同時(shí)由于其具有優(yōu)良的性能，可以適用于包括水凝膠、納米粒子等多種載藥系統(tǒng)。
[0005]目前已經(jīng)有溫度和葡萄糖敏感的NVCL和4-vinylpheny lboroni c (VPBA)結(jié)合的微凝膠的專利，但是，上述形成的微凝膠有一個(gè)缺點(diǎn)，就是其的水溶性是很差的，可能并不適合用于載藥系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法，該方法納米粒子可以用于包裹胰島素，且具有很好的釋藥性能。
[0007]本發(fā)明的一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子，所述納米粒子的主要成分為3-丙烯酰胺基苯硼酸(3-(ACRYL0YLAMIN0)BENZENEB0R0NICACID，AAPBA)以及溫度敏感性基團(tuán)N-乙烯基己內(nèi)酰胺(N-Vinylcaprolactam，NVCL);其中，AAPBA與NVCL的質(zhì)量比為1:10。
[0008]本發(fā)明的一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，包括:
[0009](I)將AAPBA和NVCL和引發(fā)劑混合，溶解在溶劑中；在無氧條件下，采用可逆加成反應(yīng)，得到聚合物P(NVCL-co-AAPBA);其中，AAPBA與NVCL的質(zhì)量比為1:10;
[0010](2)將步驟(I)中的聚合物溶于超純水中，300r/min旋轉(zhuǎn)3h，得到具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子。
[0011 ] 所述步驟(I)中引發(fā)劑為AIBN;溶劑為DMF;引發(fā)劑的質(zhì)量與AAPBA和NVCL的質(zhì)量之和比為1: 1100;溶劑與AAPBA的比例為Iml:1OOmg。
[0012]所述步驟(I)中AAPBA與NVCL的質(zhì)量比為1:10。
[0013]所述步驟(I)中可逆加成反應(yīng)的條件為:70°C反應(yīng)8h。
[0014]所述步驟(2)中旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為300r/min，時(shí)間為3h。
[0015]所述步驟(2)中納米粒子的直徑為100-200nm;具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性，用于載藥微球具有很好的包載率和穩(wěn)定的釋藥率。
[0016]本發(fā)明中納米粒子的最佳條件:AAPBA/NVCL為1:10;所用的引發(fā)劑為六181所反應(yīng)的最佳環(huán)境為無氧;反應(yīng)時(shí)間Sh。
[0017]所述制作納米粒子不需要特別的條件，反應(yīng)簡單快速，制作的納米粒子穩(wěn)定，任何添加特定條件的其它專利都屬于本專利的范疇。
[0018]本發(fā)明的納米粒子可以載胰島素、載藥量高、同時(shí)溶解性好、具有穩(wěn)定的釋藥性，同時(shí)其是低毒的，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0019]所得的P(NVCL-C0-AAPBA)高分子聚合物通過核磁和紅外對(duì)其進(jìn)行了表征，實(shí)驗(yàn)的方法如下:
[0020 ] (I)準(zhǔn)確稱量P (NVCL-CO-AAPBA) 2mg，使用傅里葉紅外儀對(duì)其進(jìn)行掃描即可。
[0021](2)稱取3-5mg的p(NVCL-co-AAPBA)，將其用氘帶DMSO溶解后，使用核磁H譜測定即完成。
[0022]形成的納米粒子的基本性能表征:
[0023](I)分別稱取多份Img p(NVCL-co-AAPBA)，將其溶解于不同濃度(0g/mL、lg/mL、2g/mL、3g/mL)的葡萄糖水溶液中、不同pH值的溶液(pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)以及不同溫度的溶液中(I2度到37度，每5度測定一次)，低速旋轉(zhuǎn)1h后，使用DLS測定其粒徑是否隨著上述控制的液體濃度而變化。
[0024](2)將P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子的水溶液滴一滴，置于銅網(wǎng)上，投射電鏡觀察其形貌特點(diǎn)。
[0025]形成的納米粒子的載藥特點(diǎn)測試:
[0026](3)將Img胰島素，與1mg的p(NVCL-co-AAPBA)溶解于1mL的水溶液中，在低速300r/min的轉(zhuǎn)速下，將其旋轉(zhuǎn)3h，即完成，之后根據(jù)公式計(jì)算載藥率和包封率。
[0027](4)將包裹有胰島素的？(附0^0^4?84)納米粒子置于?!1值為7.4的水溶液中，溫度設(shè)置為37攝氏度，考查其在120h內(nèi)的釋藥特點(diǎn)。
[0028]有益效果
[0029](I)本發(fā)明利用AAI3BA和NVCL制作的具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的高分子無規(guī)共聚物及其所形成的自組裝納米粒子，其制備方法操作簡單、實(shí)驗(yàn)條件溫和；
[0030](2)本發(fā)明的制作的納米粒子藥物裝載量高，能夠緩釋，且在體內(nèi)穩(wěn)定，其分解產(chǎn)物在體內(nèi)沒有毒副作用，可能在今后具有臨床應(yīng)用價(jià)值；
[0031](3)本發(fā)明的納米粒子可以用于包載胰島素，所包裹的胰島素可以隨著葡萄糖濃度的升高，通過改變納米粒子的大小而改變釋藥速度(苯硼酸中的硼酸會(huì)識(shí)別葡萄糖中的羥基，進(jìn)而拉拽納米粒子，通過改變納米粒子的大小而改變釋藥速度)，有著很好的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明中p(NVCL-co-AAPBA)的合成示意圖；
[0033]圖2為實(shí)施例1所得的p(NVCL-co-AAPBA)的紅外圖譜；
[0034]圖3為實(shí)施例1所得的P(NVCL-co-AAPBA)的核磁圖譜；其中，A、B、C和D分別對(duì)應(yīng)AAPBA、NVCL、pnycI和p(NVCL-co-AAPBA)；
[0035]圖4為實(shí)施例2所得的p(NVCL-co-AAPBA)納米粒子的TEM;
[0036]圖5為實(shí)施例2中p(NVCL-co-AAPBA)納米粒子在不同葡萄糖濃度中的粒徑變化；
[0037]圖6為實(shí)施例2中P(NVCL-co-AAPBA)納米粒子在不同pH值的水溶液中的粒徑變化；
[0038]圖7為實(shí)施例2中P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子在不同溫度中的粒徑變化；
[0039]圖8為實(shí)施例3中p(NVCL-co-AAPBA)納米粒子的載藥率和包封率；
[0040]圖9為實(shí)施例3中p(NVCL-co-AAPBA)納米粒子在體外的釋藥特點(diǎn)；
[0041 ] 圖10為實(shí)施例4中p(NVCL-co-AAPBA)納米粒子的細(xì)胞毒性考查。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0043]實(shí)施例1
[0044](I)稱取AAPBA100mg，NVCL1000mg;同時(shí)加入Img的AIBN，將上述所有材料混合后溶解于ImL的DMF中，充滿氮?dú)狻?0°C，反應(yīng)8h，即反應(yīng)生成p(NVCL-co-AAPBA)。
[0045](2)稱取1mg的p(NVCL-co-AAPBA)，將其溶于1mL的超純水中，在低速300r/min的轉(zhuǎn)速下，將其旋轉(zhuǎn)3h，即形成P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子。
[0046](3)準(zhǔn)確稱量p(NVCL-co-AAPBA)2mg，使用傅里葉紅外儀對(duì)其進(jìn)行表征，如圖2所示。AAPBA呈現(xiàn)出6個(gè)主要的特征峰，分別為C = O的吸收峰(1660cm—M，C = C的吸收峰(1620cm—1KO-B-O的吸收峰(1352cm—O以及B-O的吸收峰(1014cm—O，苯環(huán)的吸收峰位于1555cm—1到1610cm—1之間，同時(shí)苯環(huán)在698cm—1和791cm—1還有一個(gè)微弱的吸收峰。在p(NVCL)和p(NVCL-co-AAPBA)之間，二者的C = C吸收峰消失，這提示其發(fā)生了聚合反應(yīng)，此外P(NvCL-CO-AAI3BA)在1340cm—1位置出現(xiàn)一個(gè)O-B-O的吸收峰，這提示，AAI3BA成功的聚合到P(NVCL)0
[0047](4)稱取3-5mg的p(NVCL-co-AAPBA)，將其用氘帶DMSO溶解后，使用核磁H譜表征，如圖3所示。AAPBA(圖3A)的溶于DMSO中的核磁H譜吸收峰為:δ: 10.09 (1H, 4-H)，8.10-7.25(苯環(huán))，6.47(1!1，2-!0，6.20(1!1，3-!1)和5.75(2!1，1-!0。附(^溶于0150中的核磁!1譜吸收峰為:7.23(1Η，3-Η)，5.81(2Η，2-Η)，4.46(2Η，4-Η)，3.35(2Η，1-Η)，1.62(2Η，6-Η)，2.40(2Η，5-Η)和1.14(2!1，7-!0 4(附(^)溶于0150中的核磁!1譜吸收峰為5:4.33(1!1，4-!0，7.22(1!1，2-H),4.33(2H,2-H)，1.04(6H,1-H) dUAPBA-co-NVCL)溶于 DMSO中的核磁 H 譜吸收峰為 δ:9.55( 1HJ-H) ,8.17-7.32(苯環(huán)的吸收峰)，7.22( 1H，2-H) ,4.33( 1Η，6-Η)，3.19(2H，5-H),2.36(IH，4-H)和1.65(6H，3-H).與AAPBA和NVCL的吸收峰相比較，可以明顯看出，p(AAPBA-co-NVCL)有一個(gè)明顯的苯環(huán)吸收峰，提示AAPBA成功的聚合到p (NVCL)。
[0048]實(shí)施例2
[0049]實(shí)施例1中得到的納米粒子的基本性能。
[0050](I)分別稱取多份Img p(NVCL-co-AAPBA)，將其溶解于不同濃度(0g/mL、lg/mL、2g/mL、3g/mL)的葡萄糖水溶液中、不同pH值的溶液(pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)以及不同溫度的溶液中(I2度到37度，每5度測定一次)，低速旋轉(zhuǎn)1h后，使用DLS測定其粒徑。其中，圖5為所得的P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子在不同葡萄糖濃度中的粒徑變化；圖6為所得的p(NVCL-co-AAPBA)納米粒子在不同pH值的水溶液中的粒徑變化；圖7為所得的P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子在不同溫度中的粒徑變化。
[0051 ] (2)將P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子的水溶液滴一滴，置于銅網(wǎng)上，透射電鏡觀察其形貌特點(diǎn)，TEM圖如圖4所示。
[0052] 實(shí)施例3
[0053 ]實(shí)施例1中得到的納米粒子的載藥特點(diǎn)。
[0054](1)將11^胰島素，與1011^的？(,(^-(3044?84)溶解于1011^的水溶液中，在低速300r/min的轉(zhuǎn)速下，將其旋轉(zhuǎn)3h，即完成，之后根據(jù)公式計(jì)算載藥率和包封率，如圖8所示。
[0055](2)將包裹有胰島素的P (NVCL-co-AAPBA)納米粒子置于0mg/mL、lmg/mL、2mg/mL和3mg/mL葡萄糖濃度的，pH值為7.4的水溶液中，溫度設(shè)置為37攝氏度，考查其在120h內(nèi)的釋藥特點(diǎn)，如圖9所示。
[0056]實(shí)施例4
[0057]p(NVCL-co_AAPBA)(實(shí)施例1)的細(xì)胞毒性考查。
[0058]將處于對(duì)數(shù)生長期的單層培養(yǎng)PIEC細(xì)胞用胰蛋白酶消化、離心、懸浮、細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備成15個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后以2X 14個(gè)/孔的接種密度將其接種在已經(jīng)滅菌處理的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，把P (NVCL-co-AAPBA)的I3BS溶液加入到接種的細(xì)胞中，最終形成的聚合物濃度為25，50，100，250，500mg/L，比較其細(xì)胞生長特點(diǎn)，如圖1O所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子，其特征在于，所述納米粒子的成分包括:3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA和N-乙烯基己內(nèi)酰胺NVCL;其中，AAPBA與NVCL的質(zhì)量比為1:10。2.一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，包括: (1)將AAPBA、NVCL和引發(fā)劑混合，溶解在溶劑中；在無氧條件下，進(jìn)行可逆加成反應(yīng)，得到聚合物P(NVCL-co-AAPBA);其中，AAPBA與NVCL的質(zhì)量比為1:10； (2)將步驟(I)中的聚合物溶于超純水中，旋轉(zhuǎn)，得到具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中引發(fā)劑為AIBN;溶劑為DMF;引發(fā)劑的質(zhì)量與AAPBA和NVCL的質(zhì)量之和比為1:1100;溶劑與AAPBA的比例為Iml: 10mgo4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中可逆加成反應(yīng)的條件為:70 0C反應(yīng)Sh。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為300r/min，時(shí)間為3h。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中納米粒子的直徑為100-200nm。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK106075404SQ201610415172
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日 公開號(hào)201610415172.4, CN 106075404 A, CN 106075404A, CN 201610415172, CN-A-106075404, CN106075404 A, CN106075404A, CN201610415172, CN201610415172.4
【發(fā)明人】朱利民, 武俊紫, 吳煥玲, 李赫宇, 周開春
【申請(qǐng)人】東華大學(xué)