熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，本發(fā)明使用易錯(cuò)PCR 方法對(duì)野生型葡萄糖氧化酶基因進(jìn)行突變，再通過(guò)高通量篩選方法將正突變檢出。經(jīng)上述突變文庫(kù)構(gòu)建、篩選方法，獲得3個(gè)熱穩(wěn)定性顯著提高的葡萄糖氧化酶突變體，熱穩(wěn)定性比野生型提高1?3 倍，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景和工業(yè)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶 突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C. 1.1.3.4，G0D)有氧條件下能專一性地催化 β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。葡萄糖氧化酶是目前主要的工具酶之一，被廣泛應(yīng)用 于在食品工業(yè)、畜牧養(yǎng)殖和醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域。葡萄糖氧化酶作為公認(rèn)的安全抗氧劑應(yīng)用于 食品加工工藝中，在醫(yī)療產(chǎn)業(yè)中，葡萄糖氧化酶可以用于血糖測(cè)定等方向，作為一種飼料添 加劑，葡萄糖氧化酶可以改善動(dòng)物腸道環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。隨著葡萄糖氧化酶越來(lái)越多的 被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，工業(yè)上尤其是飼料工業(yè)對(duì)其現(xiàn)有性能有了越來(lái)越高的要求，如在常溫 下較長(zhǎng)時(shí)間保持酶活力不下降，對(duì)熱和極端pH條件具有耐受性，對(duì)消化酶具有耐受性。其中 酶的熱穩(wěn)定性對(duì)于葡萄糖氧化酶的應(yīng)用非常關(guān)鍵，在酶的制備過(guò)程中和極端反應(yīng)條件下 (高溫），耐熱性強(qiáng)的酶有著比較大的優(yōu)勢(shì)。
[0003] 易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)技術(shù)是一種在DNA序列中制造隨機(jī)突變的方法，其基 本原理是在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過(guò)改變傳統(tǒng)PCR過(guò)程的反應(yīng)條件(如提高酶離子濃度，改 變體系中4種dNTP的濃度等），使用較低保真度的Taq酶，從而以一定頻率隨機(jī)引入錯(cuò)誤堿 基，從而形成序列不同的突變體庫(kù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用，本發(fā)明 提供的葡萄糖氧化酶突變體熱穩(wěn)定性有了顯著的提升。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明提供了 一種熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2，所述的葡萄糖 氧化酶突變體G0D-H-2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，所述的突變體G0D-H-2序列由氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼帷⒌?61位 氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)楫惲涟彼岖@得。
[0007] 本發(fā)明提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0008] 本發(fā)明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明提供了 一種熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5，所述的葡萄糖 氧化酶突變體G0D-H-5的氨基酸序列如SEQ ID勵(lì):7所示，所述的突變體600-!1-5序列由氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第29位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榱涟彼?、?43位 氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼?、?90位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼帷⒌?61位氨基酸由苯丙 氨酸變?yōu)楫惲涟彼岖@得。
[0010] 本發(fā)明提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0011] 本發(fā)明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。
[0012] 本發(fā)明提供了 一種熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6，所述的葡萄糖 氧化酶突變體G0D-H-6的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述的突變體G0D-H-6序列由氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼?、?41位 氨基酸由脯氨酸變?yōu)樘扉T冬氨酸、第359位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸、第461位氨基酸由 苯丙氨酸變?yōu)楫惲涟彼岖@得。
[0013] 本發(fā)明提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0014] 本發(fā)明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。
[0015] 本發(fā)明提供了葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2、G0D-H-5和G0D-H-6在用于制備動(dòng)物 飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是:本發(fā)明的目的是采用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)來(lái)源于黑曲霉 (Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明 使用易錯(cuò)PCR方法對(duì)葡萄糖氧化酶基因進(jìn)行突變，再通過(guò)高通量篩選方法將正突變檢出，得 到熱穩(wěn)定性提高的突變體，相比野生型葡萄糖氧化酶GOD-1，本發(fā)明的6個(gè)突變體G0D-H-1、 600-!1-2、600-!1-3、600-!1-4、600-!1-5、600-!1-6熱穩(wěn)定性明顯提高，在80°(：處理3111丨11后，殘余 酶活分別提高了 1.3、1.6、1.9、2.1、2.5、2.3倍。本發(fā)明提供的突變體具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用 前景和工業(yè)價(jià)值
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-1與野生型氨基酸序列比對(duì)圖；
[0018] 圖2是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2與野生型氨基酸序列比對(duì)圖；
[0019] 圖3是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-3與野生型氨基酸序列比對(duì)圖；
[0020] 圖4是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-4與野生型氨基酸序列比對(duì)圖；
[0021 ]圖5是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5與野生型氨基酸序列比對(duì)圖；
[0022] 圖6是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6與野生型氨基酸序列比對(duì)圖；
[0023] 圖 7為葡萄糖氧化酶突變體 G0D-H-1、G0D-H-2、G0D-H-3、G0D-H-4、G0D-H-5、G0D-H-6在不同溫度下的殘余酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0025] 本發(fā)明用到了分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法。實(shí)施例僅是用于解釋本發(fā) 明，不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 實(shí)施例1:易錯(cuò)PCR(err〇r-pr〇ne PCR)方法構(gòu)建葡萄糖氧化酶G0D-1突變文庫(kù)
[0027] 來(lái)源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶基因 G0D-1由589個(gè)氨基酸構(gòu) 成(如SEQ ID N0:1所示），采用全基因合成的方法合成了該葡萄糖氧化酶基因 G0D-1(如SEQ ID N0:2所示），合成的基因兩端還帶有EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)。以合成的該基因?yàn)槟０鍞U(kuò) 增葡萄糖氧化酶G0D-1基因，使用GeneMorph II隨機(jī)突變PCR試劑盒(Stratagene)隨機(jī)引入 突變。
[0028] 所用引物為：5' -GCGCGAATTCCGCTGCGGCCCTGCCACACTAC-3' (SEQ ID No：9),
[0029] 57-TAAAGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATCC-3 7(SEQ ID No： 10)〇
[0030]下劃線處分別為EcoR I和Not頂每切位點(diǎn)。
[0031] 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性10min，94°C變性60s，58°C退火60s和72°C延伸2min，共30 個(gè)循環(huán)，回收目的基因片段。
[0032] 將目的片段用EcoR I和Not I雙酶切消化后，與經(jīng)過(guò)相同酶切的pET 21a( + )載體 (氨芐抗性基因）用Ligase進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接好的片段轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-DE3,涂布 含有氨芐青霉素的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子后，挑取單克隆至96孔板， 每孔中含有150uL LB培養(yǎng)基(含有ImM IPTG，50ng/mL氨芐青霉素），30°C220rpm震蕩培養(yǎng) 12h，將孔板置于-20°C，反復(fù)凍融破壁，獲得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。分別取出5ul裂解 液至兩塊新的96孔板，其中一塊于80°C處理3min，兩塊96孔板都加入含有鄰聯(lián)茴香胺甲醇 緩沖液、葡萄糖緩沖液、辣根過(guò)氧化物酶溶液的顯色液，37 °C反應(yīng)3min后加入100uL2M硫酸 終止反應(yīng)，根據(jù)顯色反應(yīng)測(cè)定殘余酶活。
[0033]取殘余活性比野生型G0D-1高的菌株到新的96孔培養(yǎng)板中，進(jìn)行重復(fù)篩選。篩選到 2個(gè)突變體，分別為G0D-H-1和G0D-H-2，殘余活性是野生型對(duì)照的1-3倍，對(duì)這兩個(gè)突變體進(jìn) 行DNA測(cè)序。
[0034] 測(cè)序結(jié)果顯示，如圖1和圖2所示，本輪易錯(cuò)PCR獲得了一個(gè)含K122N和G492E的兩點(diǎn) 突變的突變體G0D-H-1，其氨基酸序列為SEQ ID N0:3,一個(gè)含A143P和F461I的兩點(diǎn)突變的 突變體G0D-H-2,其氨基酸序列為SEQ ID N0:4。
[0035] G0D-H-1:該酶的第122位的賴氨酸K變?yōu)樘於０種(AAG變?yōu)锳AC)，第492位的甘氨 酸G變?yōu)楣劝彼酔(GGG變?yōu)镚AG)。
[0036] G0D-H-2:該酶的第143位的丙氨酸A變?yōu)楦彼酨(GCC變?yōu)镃CC)，第461位的苯丙氨 酸F變?yōu)楫惲涟彼酙(TTC變?yōu)锳TC)。
[0037]實(shí)施例2:第二輪易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的構(gòu)建和篩選突變文庫(kù)的構(gòu)建 [0038]將第一輪易錯(cuò)PCR方法篩選到的耐熱性提高的兩個(gè)突變體G0D-H01和G0D-H02分別 提取質(zhì)粒作第二輪易錯(cuò)PCR的模板，突變文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程，使用的引物，PCR反應(yīng)條件，同實(shí) 施例1。
[0039]通過(guò)第二輪易錯(cuò)PCR，同樣獲得了大量的突變體基因片段。將構(gòu)建得到的突變體轉(zhuǎn) 入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21-DE3，篩選耐熱性正突變時(shí)以G0D-H-1和G0D-H-2為對(duì)照，其余操 作與實(shí)施例2相同，取殘余活性比突變型G0D-H-1和G0D-H-2高的菌株到新的96孔培養(yǎng)板中， 進(jìn)行重復(fù)篩選。
[0040] 本輪篩選共獲得4個(gè)突變體，分別命名為G0D-H-3、G0D-H-4，G0D-H-5和G0D-H-6。其 中G0D-H-3和G0D-H-4是以G0D-H01為模板獲得的突變體，其熱穩(wěn)定性高于G0D-H01，G0D-H-5 和G0D-H-6是以G0D-H02為模板獲得的突變體，其熱穩(wěn)定性高于G0D-H02,挑取突變體菌株送 測(cè)序公司測(cè)序。
[0041 ] 測(cè)序結(jié)果顯示，如圖3、圖4、圖5和圖6所示，本輪易錯(cuò)PCR獲得一個(gè)含D70Q、K122N和 G492E的三點(diǎn)突變的突變體G0D-H-3,其氨基酸序列為SEQ ID N0:5。一個(gè)含K122N、Q263P、 R341S和G492E的四點(diǎn)突變的突變體G0D-H-4,其氨基酸序列為SEQ ID N0:6。一個(gè)含I29L、 A143P、G390R和F461I的四點(diǎn)突變的突變體G0D-H-5，其氨基酸序列為SEQIDN0:7。一個(gè)含 A143P、P241D、T359S和F4611的四點(diǎn)突變的突變體G0D-H-6，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 8。
[0042] G0D-H-3:該酶的第70位天冬氨酸D變?yōu)楣劝彼酫(DNA序列由GAC變?yōu)镚AA)，第122位 的賴氨酸K變?yōu)樘於０種(AAG變?yōu)锳AC)，第492位的甘氨酸G變?yōu)楣劝彼酔(GGG變?yōu)镚AG)。 [0043] G0D-H-4:該酶的第122位的賴氨酸K變?yōu)樘於０種(AAG變?yōu)锳AC)，第263為的谷氨 酰胺Q變?yōu)楦彼酨(CAG變?yōu)镃CG)，第341位的精氨酸R變?yōu)榻z氨酸S(CGC變?yōu)锳GC)，第492位 的甘氨酸G變?yōu)楣劝彼酔(GGG變?yōu)镚AG)。
[0044] G0D-H-5:該酶的第29位的異亮氨酸I變?yōu)榱涟彼酟(AUC變?yōu)镃UC)，第143位的丙氨 酸A變?yōu)楦彼酨(GCC變?yōu)镃CC)，第390位的甘氨酸G變?yōu)榫彼酭(GGC變?yōu)镃GC)，第461位的 苯丙氨酸F變?yōu)楫惲涟彼酙(TTC變?yōu)锳TC)。
[0045] G0D-H-6:該酶的第143位的丙氨酸A變?yōu)楦彼酨(GCC變?yōu)镃CC)，第241位的脯氨酸 P變?yōu)樘扉T冬氨酸D(CCC變?yōu)镚AC)，第359位的蘇氨酸T變?yōu)榻z氨酸S(ACC變?yōu)閁CC)，第461位 的苯丙氨酸F變?yōu)楫惲涟彼酙(TTC變?yōu)锳TC)。
[0046] 實(shí)施例3:畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建
[0047] 使用實(shí)施例1中所述引物，以實(shí)施例1和實(shí)施例2所獲得的突變體作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同。
[0048] 將擴(kuò)增得到的實(shí)施例1及實(shí)施例2所述葡萄糖氧化酶突變體基因片段，以及野生型 基因片段，通過(guò)EcoR I和Not I位點(diǎn)與表達(dá)載體pPIC9K相連接，構(gòu)建表達(dá)載體?？1091(-600-1、pPIC9K-G0D-H-1、pPIC9K-G0D-H-2、pPIC9K-G0D-H-3、pPIC9K-G0D-H-4、pPIC9K-G0D-H-5 和PPIC9K-G0D-H-6。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子后大量提取質(zhì)粒。
[0049] 將以上表達(dá)質(zhì)粒用Sail進(jìn)行線性化，線性化片段用片段純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)純化收集后，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115，涂布MD平板。將在MD平板上生長(zhǎng)出的菌落涂布到濃度依次逐漸升高（lmg/mL，2mg/ mL，4mg/mL，8mg/mL)的遺傳霉素的YH)平板上篩選多拷貝的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到畢赤酵母重組 菌株。
[0050] 將7個(gè)基因的轉(zhuǎn)化子分別命名為畢赤酵母600-1(?丨吐丨3口38如^8 600-1)、600-H_l(Pichia pastoris G0D-H-1)、畢赤酵母G0D-H_2(Pichia pastoris G0D-H-2)、畢赤酵 母G0D-H_3(Pichia pastoris G0D-H-3)、畢赤酵母G0D-H_4(Pichia pastoris G0D-H-4)、 畢赤酵母G0D-H_5(Pichia pastoris G0D-H-5)和畢赤酵母G0D-H_6(Pichia pastoris G0D-H-6)，分別挑取每個(gè)基因的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)18h后， 離心獲得菌體，將適量菌體轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，使菌體濃度達(dá)到0D600 = 1，30°C，220rpm繼 續(xù)振蕩培養(yǎng)，每24h添加培養(yǎng)體積1 %的甲醇。誘導(dǎo)表達(dá)4d后，將培養(yǎng)液離心獲得上清，將上 清液進(jìn)行葡萄糖氧化酶活力測(cè)定和熱穩(wěn)定性測(cè)定。
[0051 ]實(shí)施例4:突變體和野生型表達(dá)產(chǎn)物酶活力及熱穩(wěn)定性的測(cè)定 [0052]酶活力測(cè)定方法：
[0053] 取鄰聯(lián)茴香胺緩沖液2.5mL(0 . lmLl %鄰聯(lián)茴香胺甲醇儲(chǔ)備液加入到12mL 0.1M pH6.0磷酸緩沖液配成），18%葡萄糖溶液0.3mL，0.03 %過(guò)氧化物酶溶液0. lmL，加入到比色 管中37°C保溫5min，再加入0. lmL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0. lmL蒸餾水），反應(yīng)3min 后，加入2M硫酸2mL，混勻以終止反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定空白 (A〇)和試樣溶液(心)的吸光值。得出Δ A=Ai-Ao
[0054]試樣酶活力計(jì)算：
[0055] X=( AAXnX3)/(11.3XtX0.1)
[0056] T一測(cè)定時(shí)間，min
[0057] 0.1-樣品體積，mL
[0058] 11.3-消光系數(shù)
[0059] N-稀釋倍數(shù) [0060] 3-反應(yīng)液體積，mL
[00611酶活單位與定義:在pH5.5、37°C的條件下，每分鐘能把1. Ownol的β-D-葡萄糖氧化 成葡萄糖酸和H202的酶量為一個(gè)單位。
[0062]將實(shí)施例3所述發(fā)酵上清液用pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋至約20U/mL，在80°C條件 下處理3min后，測(cè)定殘余酶活，以未處理樣品的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖7所 示，野生型葡萄糖氧化酶在80°C條件下處理3min，酶活僅剩23%，而突變體600-!1-1、6(?-!!- 2、600-!1-3、600-!1-4,600-!1-5和600-!1-6同樣在80°(：條件下處理3111丨11仍能保持30-60%的酶 活。其耐熱性分別與野生型基因相比，分別提高了 1.3、1.6、2.2、2.1、2.7、2.3倍。
[0063] 由此可見，突變后的葡萄糖氧化酶的耐熱性與野生型相比有了較大提高，更加有 利于其在工業(yè)中的應(yīng)用。
[0064] 實(shí)施例5:葡萄糖氧化酶的養(yǎng)殖應(yīng)用實(shí)驗(yàn)
[0065] 5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0066]白羽肉雞苗購(gòu)自某種禽廠，共分為8棟雞舍，每一雞舍20000只雞，其中1、2、3、4為 對(duì)照組，5、6、7、8為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加0.2U/g本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶 G0D-H-5,實(shí)驗(yàn)為期40天。
[0067] 5.2生產(chǎn)性能測(cè)定
[0068] 分別實(shí)驗(yàn)開始第2、40天對(duì)各組雞空腹稱重，記錄初始重和末重。飼養(yǎng)過(guò)程中，觀察 記錄各組雞的健康狀況，并記錄每周每籠采食量，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)的成活率、料重比及計(jì)算歐 洲指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0069] 表1對(duì)照組生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)
[0071 ]表2實(shí)驗(yàn)組生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)
[0073] 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的均重有所增加，成活率也有所增加，而料重比有所下降， 經(jīng)過(guò)計(jì)算歐洲指數(shù)上升了 2.9 %，表明在日糧中添加了葡萄糖氧化酶G0D-H-5使養(yǎng)殖效益有 所增加。
[0074] 本實(shí)施例5為了便于體現(xiàn)本發(fā)明所述的葡萄糖氧化酶的應(yīng)用，并不限于肉雞的應(yīng) 用，因?yàn)樗龅钠咸烟茄趸缚梢蕴砑拥交A(chǔ)日糧中，可以用于其他畜禽類的飼喂。通?？?以在豬、兔和奶牛等養(yǎng)殖過(guò)程中在其配合飼料中添加。
[0075] 以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施 例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或替 換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2,其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-H-2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，所述的突變體G0D-H-2序列由氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼?、?61位氨基 酸由苯丙氨酸變?yōu)楫惲涟彼岖@得。2. 權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2的葡萄糖氧化酶編碼基因。3. 含有權(quán)利要求2所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。4. 一種熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5，其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-H-5的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，所述的突變體G0D-H-5序列由氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第29位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榱涟彼?、?43位氨基 酸由丙氨酸變?yōu)楦彼?、?90位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?、?61位氨基酸由苯丙氨酸 變?yōu)楫惲涟彼岖@得。5. 權(quán)利要求4所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5的葡萄糖氧化酶編碼基因。6. 含有權(quán)利要求5所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。7. -種熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6，其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-H-6的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述的突變體G0D-H-6序列由氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼帷⒌?41位氨基 酸由脯氨酸變?yōu)樘扉T冬氨酸、第359位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸、第461位氨基酸由苯丙 氨酸變?yōu)楫惲涟彼岖@得。8. 權(quán)利要求7所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6的葡萄糖氧化酶編碼基因。9. 含有權(quán)利要求8所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。10. 葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2、G0D-H-5和G0D-H-6在用于制備動(dòng)物飼料添加劑中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK105950577SQ201610528932
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】肖志壯, 張穩(wěn), 李俊安, 趙志強(qiáng), 武傳菊
【申請(qǐng)人】青島紅櫻桃生物技術(shù)有限公司