本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種實時熒光定量PCR檢測方法及其標準品和檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)是基因結(jié)構(gòu)變異的重要組成部分，由基因組發(fā)生重排而導致，一般指長度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復。CNV與腫瘤發(fā)生聯(lián)系密切，Disklin等發(fā)現(xiàn)1q21.1位點的CNV與成神經(jīng)細胞瘤關(guān)系密切；而且腫瘤相關(guān)基因的CNV會對腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生很大的影響，例如GSTM1基因上的CNV會導致膀胱癌的發(fā)病風險增高；抑癌基因WWOX上的CNV會導致抑癌基因的活性下降，使肺癌更易發(fā)生。對相關(guān)CNV的檢測對于某些腫瘤患者的靶向治療是至關(guān)重要的，醫(yī)生可以針對患者的相關(guān)基因拷貝數(shù)差異采取個性化的治療手段，例如通過對HER2基因拷貝數(shù)(HER2基因相對定量)的檢測判斷其是否擴增是臨床治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌是否適用靶向藥物赫賽汀的關(guān)鍵指征。

乳腺癌是危害女性健康最主要的惡性腫瘤，在原發(fā)性乳腺癌患者中觀察到有25％-30％的患者HER2過度表達。HER2(人類表皮生長因子受體2，human epidermal growth factor receptor-2，HER2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上，編碼相對分子質(zhì)量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。正常人體情況下，HER2是單拷貝基因，但是在乳腺癌及胃癌腫瘤細胞中，常有染色體異質(zhì)性現(xiàn)象發(fā)生，如17號染色體數(shù)量增加，更常見的是17號染色體上HER2基因及其上下游300-1000M的DNA序列經(jīng)過基因重排插入到其他染色體上，由此導致HER2基因的拷貝數(shù)增加，進而導致腫瘤細胞表面HER2蛋白過表達。自1997年起，美國食品藥品監(jiān)督局先后批準了赫賽汀(曲妥珠單抗商品名)用于HER2過表達的乳腺癌、HER2過度表達的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、HER2過表達的轉(zhuǎn)移性胃癌的治療。赫賽汀是一種重組人源化單克隆抗體，能夠特異性地作用于人表皮生長因子受體-2(HER2)的細胞外部位，可以抑制HER2過度表達的腫瘤細胞的增殖。目前赫賽汀已成為臨床HER2陽性乳腺癌靶向治療的一線藥物，全球年銷售額近80億美元。臨床實驗證明HER2過度表達患者接受赫賽汀治療效果更為顯著。美國臨床腫瘤學會及中華醫(yī)學病例學會發(fā)布的《乳腺癌治療指南》及《乳腺癌HER2檢測指南》均明確提出在乳腺癌靶向治療前必須進行HER2檢測，正確檢測和評定乳腺癌的HER2蛋白表達和基因擴增狀態(tài)對乳腺癌的臨床治療和預后判斷至關(guān)重要，不僅涉及患者是否適合針對HER2的靶向治療，并且對內(nèi)分泌治療、化療方案的選擇及預后評估起指導作用。

目前，F(xiàn)DA認可的HER2檢測方法分為免疫組化(IHC)及原位雜交(ISH包括FISH、CISH、SISH)兩類。IHC是利用免疫顯色反應在蛋白水平上對福爾馬林固定的石蠟切片進行HER2過表達檢測，而ISH則是利用特殊標記的核酸探針與石蠟切片上固定的細胞核內(nèi)HER2基因DNA靶序列雜交，在核酸水平上，檢測HER2基因的擴增情況，當IHC檢測結(jié)果為2+時還需要進一步進行FISH檢測確診。以上兩類方法在臨床檢測中操作繁瑣，耗時較長，價格昂貴(臨床收費2500-3000元)，在一般的臨檢實驗室中很難進行標準化。

實時熒光定量PCR具有線性檢測范圍大、檢測速度快、通量高、封閉檢測無污染、靈敏度高等諸多優(yōu)點，已經(jīng)在核酸拷貝數(shù)定量方面有了諸多臨床應用。目前將熒光定量PCR應用于基因拷貝數(shù)變異的檢測主要有兩種相對定量方法。其一是以羅氏HER2基因擴增檢測試劑盒(僅限科研使用，未申請臨床許可)為代表的ΔΔCt法，其檢測原理是根據(jù)HER2基因與參照基因擴增反應的Ct值差異(經(jīng)參照樣本的ΔCt校正后即為ΔΔCt)比較的拷貝數(shù)差異，而實際上不同PCR反應的體系之間擴增效率的差異很難消除且PCR設(shè)備還存在孔間差異，故而此方法難以滿足臨床HER2檢測對穩(wěn)定性、精密度的要求。另外由于其選用的參照基因Gastrin在部分胃癌患者中也存在著擴增現(xiàn)象，因此在赫賽汀增加了胃癌適應癥后，該試劑盒退出了市場。其二是以賽默飛世爾為代表的相對標準曲線法，利用標準曲線得到真實的擴增效率值，可在一定程度上修正結(jié)果。具體方法是利用一系列不同濃度梯度的目的基因及參照基因標準品(質(zhì)粒、基因組DNA或化學成序列中的一種)繪制標準曲線后，分別計算樣本中目的基因、參照基因相對于各自標準品的拷貝數(shù)。但由于標準品本身的絕對定量難度高，標準品濃度誤差范圍較大，使得目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制，會造成實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對現(xiàn)有的基因拷貝數(shù)相對定量檢測方法中由于標準品本身絕對定量難度高、標準品濃度誤差范圍較大，導致目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制，從而造成的實驗結(jié)果誤差以及檢測方法復雜，耗費時間成本較高等問題，提供了一種簡便、高效的實時熒光定量PCR檢測方法及其標準品和檢測試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種基因拷貝數(shù)相對定量的實時熒光定量PCR檢測方法，該實時熒光定量PCR檢測方法包括以下步驟：

(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線；

(2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。

其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線。

其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。

步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。

其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。

其中所述標準曲線為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴增方法所得標準曲線，所述標準曲線的繪制方法為本領(lǐng)域常規(guī)繪制方法。本發(fā)明所述術(shù)語“拷貝數(shù)”為本領(lǐng)域常規(guī)含義，即指某基因在某一生物的基因組中的個數(shù)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二為：一種用于基因拷貝數(shù)相對定量實時熒光定量PCR檢測的標準品，所述標準品是一種等比例包含參照基因片段與待測目的基因片段的質(zhì)粒載體。

其中所述的參照基因為本領(lǐng)域常規(guī)的參照基因，較佳地為管家基因，更佳地為RPPH1基因。其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因。其中所述的質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常用質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，更佳地為TA cloning載體，所述TA cloning載體優(yōu)選地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列優(yōu)選地如序列表中SEQ ID NO:6所示。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為：一種實時熒光定量PCR檢測試劑盒，該實時熒光定量PCR檢測試劑盒包括：Taq酶、PCR反應緩沖液、dNTP混合液、目的基因以及參照基因各自對應的特異性上、下游引物和熒光探針、標準品、陰性對照和陽性對照。

其中所述目的基因較佳地為HER2基因，其對應的特異性上游引物序列較佳地如SEQ ID NO:7所示，其對應的特異性下游引物較佳地如SEQ ID NO:8所示，其對應的探針為本領(lǐng)域常規(guī)熒光探針，較佳地為Taqman熒光探針。所述探針較佳地為：在5’端連接有熒光發(fā)光基團，在3’端連接有熒光淬滅基團，所述發(fā)射基團較佳地為本領(lǐng)域常規(guī)熒光發(fā)射基團，優(yōu)選地為HEX，所述熒光淬滅基團較佳地為TARMA，所述熒光探針的序列優(yōu)選地如序列表中SEQ ID NO:11所示。

其中所述參照基因較佳地為RPPH1基因，其對應的特異性上游引物序列較佳地如SEQ ID NO:9所示，其對應的特異性下游引物較佳地如SEQ ID NO:10所示，其對應的探針為本領(lǐng)域常規(guī)熒光探針，較佳地為Taqman熒光探針。所述探針優(yōu)選在5’端連接有熒光發(fā)光基團，在3’端連接有熒光淬滅基團，所述發(fā)射基團較佳地為本領(lǐng)域常規(guī)熒光發(fā)射基團，優(yōu)選地為FAM，所述熒光淬滅基團較佳地為TARMA，所述熒光探針的序列優(yōu)選地如序列表中SEQ ID NO:12所示。

其中所述標準品為本領(lǐng)域常規(guī)標準品，較佳地為等比例包含參照基因RPPH1基因以及待測目的基因HER2基因的pMD18-T載體，其序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

其中所述Taq酶為本領(lǐng)域常規(guī)Taq酶，較佳地為熱啟動Taq酶；PCR反應緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)PCR反應緩沖液，所述PCR反應緩沖液的配方為本領(lǐng)域常規(guī)配方，較佳地市售可得，例如購買熱啟動Taq酶時配套提供的10X PCR緩沖液，其中所述dNTP混合液為本領(lǐng)域常規(guī)dNTP混合液。

其中所述陰性對照和陽性對照為本領(lǐng)域常規(guī)對照品，其中陰性對照較佳地為HER2與RPPH1基因片段比例為1：1的單一質(zhì)粒，其中HER2與RPPH1基因片段濃度較佳地為5E6copies/μL。陽性對照較佳地由包含不同比例的目標基因和對照基因的質(zhì)粒組成，其中HER2與RPPH1擴增片段比例較佳地為4：1，其中RPPH1基因片段濃度較佳地為5E6copies/μL，HER2基因片段濃度較佳地為2E7copies/μL。

所述PCR擴增體系各成分終濃度為：目的基因、參照基因所對應的引物濃度較佳地為0.14-0.18μM，更佳地為0.16μM；探針濃度較佳地為0.06-1.0μM，更佳地為0.08μM；Taq酶用量較佳地為0.02-0.06U，更佳地為0.04U，所述Taq酶更佳地為熱啟動Taq酶。

本發(fā)明還提供了如上所述的實時熒光定量PCR檢測試劑盒在檢測待測樣品HER2基因擴增狀態(tài)時的用途。待測樣品為本領(lǐng)域常規(guī)待測樣品，較佳地包括：新鮮組織、石蠟包埋組織以及外周血回收細胞等樣品。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明提供的標準品是由包含目的基因HER2基因及參照基因RPPH1基因的核酸序列按照1:1比例連接而成的質(zhì)粒。該標準品能夠解決目前相對標準曲線法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性，能夠正確檢測和評定乳腺癌組織或細胞中HER2基因擴增狀態(tài)。

本發(fā)明提供的實時熒光定量PCR檢測方法采用雙通道熒光PCR進行HER2基因與參照基因的同步擴增，能夠顯著提高檢測通量，大幅降低檢測成本。同時，本發(fā)明所提供的檢測試劑盒具有操作簡便、穩(wěn)定性好、重復性高、檢測效率高等優(yōu)勢。本發(fā)明對于HER2陽性的乳腺癌的診斷，抗該疾病藥物的研究開發(fā)、質(zhì)量控制乃至臨床應用都具有重要的意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例3構(gòu)建所得標準品的質(zhì)粒圖譜，箭頭所指即為載體中插入基因PCR產(chǎn)物序列的位置。

圖2是實時熒光定量PCR擴增結(jié)果。其中，圖2(A)是以本發(fā)明實施例3所得質(zhì)粒標準品為模板，單通道進行HER2基因擴增的擴增曲線，圖2(B)是以本發(fā)明實施例3所得質(zhì)粒標準品為模板，單通道進行RPPH1基因擴增的擴增曲線，圖2(C)是本發(fā)明實施例3所得質(zhì)粒標準品雙通道同步擴增HER2與RPPH1的擴增曲線圖。

圖3是根據(jù)圖2(C)繪制的HER2及RPPH1的標準曲線。

圖4是實施例5所述樣本的HER2及RPPH1基因擴增曲線。其中圖4(A)是編號為1520438的石蠟包埋組織的基因擴增曲線，圖4(B)是編號為1601415的石蠟包埋組織的基因擴增曲線。

圖5是所述實時熒光定量PCR檢測方法示意圖。

具體實施方式

以下的實施例用于為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員提供有關(guān)如何實施和使用本發(fā)明的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對發(fā)明人所認為的發(fā)明范圍進行限制，亦非意指下文的實驗是被實施的全部實驗而且是僅可實施的實驗。實驗例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。

實施例1人類細胞系基因組DNA抽提

本發(fā)明質(zhì)粒標準品構(gòu)建用的基因組DNA來自于體外培養(yǎng)的K562細胞系(購買自ATCC公司)。

以使用Qiagen公司的Allprep DNAmini KIT為例介紹細胞系DNA提取步驟：

(1)對細胞數(shù)進行計數(shù)，若細胞數(shù)＜5×10⁶，加入350μL Buffer RLT Plus；若細胞數(shù)≤1×10⁷，加入600μL Buffer RLT Plus(若體積過大，分次抽提)。

(2)混勻后轉(zhuǎn)移到Allprep DNA吸附柱中(置于2mL收集管內(nèi))，最高速離心30秒。

(3)換一新2mL收集管，加入500μL Buffer AW1，最高速離心15秒后倒掉收集管中液體。

(4)加入500μL Buffer AW2，最高速離心2分鐘。

(5)換一新收集管(1.5mL帶蓋)，加入100μL Buffer EB，室溫放置1分鐘。最高速離心1分鐘洗脫得到DNA。

實施例2人類石蠟包埋組織基因組DNA抽提

本發(fā)明測試的樣本的為石蠟包埋的人類乳腺癌組織(來源于第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院)。

以使用Qiagen公司的GeneRead DNA FFPE KIT為例介紹樣本DNA提取步驟：

(1)刮取石蠟切片上的組織入1.5mL離心管中。

(2)加入160μL去石蠟溶液，渦旋10s后簡單離心，56℃孵育3min。

(3)在室溫下恢復平衡后加入新鮮配制的100μL溫育緩沖液/蛋白酶K溶液(具體由55μL無RNA酶水，25μL FTB緩沖液，20μL蛋白酶K配制而成)。渦旋離心后，56℃孵育1小時后，直接轉(zhuǎn)入90℃繼續(xù)孵育1小時。

(4)簡單離心后，取清澈底層液體，入新的離心管中，加入115μL無RNA酶水混合。

(5)加入35μL UNG酶渦旋后50℃孵育1小時。

(6)簡單離心后加入2μL核糖核酸酶A(100mg/ml)混合，室溫下孵育2分鐘后，加入250μL AL buffer，高速渦旋震蕩后加入250μL乙醇，再次高速渦旋震蕩后離心。

(7)往QIAampMinElute柱中轉(zhuǎn)入裂解液(若體積高于700μL，可分次轉(zhuǎn)入)，注意不要觸碰到管壁。最高速離心1分鐘后，去除所有裂解液。

(8)加入500μL清洗緩沖液1后最高速離心1分鐘，去除所有緩沖液。

(9)加入500μL清洗緩沖液2后最高速離心1分鐘，去除所有緩沖液。

(10)轉(zhuǎn)移到新的收集管中，最高速離心1分鐘以去除所有殘留溶液。

(11)轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，開蓋，加入20-40μL洗脫液(滴加在膜的中心)。

(12)室溫下孵育1-5分鐘后，最高速離心1分鐘后即得到基因組DNA。

實施例3制備特殊標準品

1、載體的準備

TA克隆載體pMD18-T購自promega公司。

2、插入片段的準備

2.1、目的基因及參照基因擴增區(qū)域的準備

使用PCR方法制備目的基因與參照基因的基因片段，PCR模板為經(jīng)實施例1提取的細胞基因組DNA，反應體系如表1所示(PCR反應體系1)。

表1、PCR擴增制備靶標基因片段的反應體系(50μL/管，PCR反應體系1)

PCR擴增體系中加入HER2外側(cè)正、反向引物序列，可制備得到HER2基因片段；擴增體系中加入RPPH1外側(cè)正、反向引物序列，可制備得到RPPH1基因片段，所述序列如表2所示，PCR擴增條件如表3所示。

表2、PCR反應體系的外側(cè)引物和連接引物序列

表3、制備基因片段的PCR擴增條件

2.2連接目的基因及參照基因的基因片段

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購自天根公司)回收目標片段后，利用PCR方法連接HER2基因片段與RPPH1基因片段，制備成插入片段，PCR擴增引物及連接引物序列如表2所示，靶標序列連接PCR反應體系如表4所示(PCR反應體系2)，PCR擴增條件如表5所示。

表4、靶標序列連接PCR反應體系(50μL，PCR反應體系2)

表5、靶標序列連接PCR體系反應條件

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目標片段。

3、載體的構(gòu)建與鑒定

通過TA克隆將插入片段連接入pMD18-T載體(購自promega公司)，所述TA克隆方法請參見載體系統(tǒng)產(chǎn)品說明書。新構(gòu)建的質(zhì)粒在大腸桿菌JM109菌株中進行大量擴增，進行藍白斑篩選后挑取單克隆送測序，測序正確后作為標準品。所得標準品的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

圖1是本發(fā)明構(gòu)建所得標準品的質(zhì)粒圖譜，箭頭所指即為載體插入基因PCR產(chǎn)物序列的位置。

實施例4單、雙通道熒光定量PCR擴增結(jié)果的比較

1、目的基因與參照基因的單通道熒光定量PCR擴增結(jié)果

1.1、單通道熒光定量PCR反應模板為實施例3制備的標準品，以雙蒸水為空白對照。

1.2、單通道熒光定量PCR反應體系如表6所示(PCR反應體系3)，PCR反應條件如表8所示。

表6、單通道熒光定量PCR反應體系(25μL/管，PCR反應體系3)

HER2基因熒光定量PCR擴增體系中需要加入HER2內(nèi)側(cè)正、反向引物及HER2探針；RPPH1熒光定量PCR擴增體系中需要加入RPPH1內(nèi)側(cè)正、反向引物及RPPH1探針，所述引物和探針的序列如表7所示。所述探針中，標記HER2基因熒光探針5’端的熒光發(fā)射基團為HEX，3’端的熒光淬滅基團為TARMA，標記RPPH1基因熒光探針5’端的熒光發(fā)射基團為FAM，3’端的熒光淬滅基團為TARMA。

表7、內(nèi)側(cè)引物和熒光探針的核苷酸序列

表8、熒光定量PCR體系反應條件

熒光定量PCR擴增結(jié)果如圖2所示，其中：圖2(A)中，上升的8條曲線是以不同濃度(4倍梯度稀釋)的質(zhì)粒標準品為模板，進行HER2基因單通道熒光定量PCR擴增所得的擴增曲線，自左到右質(zhì)粒標準品濃度依次為3.2E8copies/μL、8E7copies/μL、2E7copies/μL、5E6、1.25E6copies/μL、3.12E5copies/μL、7.81E4copies/μL、1.95E4copies/μL的質(zhì)粒標準品的擴增曲線。圖2(B)中，上升的8條曲線是以不同濃度(4倍梯度稀釋)的質(zhì)粒標準品為模板，進行RPPH1基因單通道熒光定量PCR擴增所得的擴增曲線，自左到右質(zhì)粒標準品濃度依次為3.2E8copies/μL、8E7copies/μL、2E7copies/μL、5E6、1.25E6copies/μL、3.12E5copies/μL、7.81E4copies/μL、1.95E4copies/μL。

2、目的基因與參照基因的雙通道熒光定量PCR擴增結(jié)果

2.1熒光定量PCR反應模板為實施例3制備的標準品，以雙蒸水為空白對照。

2.2、雙通道熒光定量PCR反應所需引物和探針序列如表7所示，熒光定量PCR體系的反應條件如表8所示，雙通道熒光定量PCR反應體系如表9所示(PCR反應體系4)。

表9、雙通道熒光定量PCR反應體系(25μL/管，PCR反應體系4)

根據(jù)系列梯度稀釋的標準品所得CT值結(jié)果繪制標準曲線。圖2(C)是以本發(fā)明實施例3所得特殊標準品為模板，雙通道熒光定量PCR同步擴增HER2與RPPH1所得的擴增曲線圖。質(zhì)粒標準品濃度依次為3.2E8copies/μL、8E7copies/μL、2E7copies/μL、5E6、1.25E6copies/μL、3.12E5copies/μL、7.81E4copies/μL、1.95E4copies/μL。在圖中，實線代表HER2基因的擴增曲線，虛線代表RPPH1基因的擴增曲線，自左到右質(zhì)粒標準品濃度4倍梯度降低。

3、單、雙通道熒光定量PCR擴增結(jié)果的比較

從圖2所示結(jié)果可以看出，雙通道熒光定量PCR檢測方法所得結(jié)果的準確性與單通道檢測系統(tǒng)的高度一致，且具有提高檢測通量，節(jié)約檢測成本的優(yōu)勢。

實施例5雙通道熒光定量PCR檢測人類石蠟包埋組織樣本中HER2基因擴增狀態(tài)

1、熒光定量PCR反應模板為實施例2提取的乳腺癌樣本基因組DNA，以雙蒸水為空白對照，陰性對照為實施例3制備所得HER2與RPPH1基因片段比例為1：1的單一質(zhì)粒，HER2與RPPH1擴增片段濃度均為5E6copies/μL；陽性對照品由兩種不同質(zhì)粒組成，調(diào)整HER2與RPPH1擴增片段比例為4：1，其中RPPH1擴增片段濃度為5E6copies/μL，HER2擴增片段濃度為2E7copies/μL。

2、熒光定量PCR反應所用引物和熒光探針序列，擴增反應條件以及反應體系參見表7、表8、表9內(nèi)容。使用雙通道熒光定量PCR方法同時進行HER2與RPPH1基因檢測。HER2擴增體系中需要加入HER2-F-2與HER2-R-2引物及其熒光探針。RPPH1擴增體系中需要加入RPPH1-F-2與RPPH1-R-2引物及其熒光探針。

3、繪制標準曲線

如圖2(C)所示，以含有等比例目的基因與參照基因基因片段的質(zhì)粒標準品為模板，進行雙通道熒光定量PCR檢測同步得到HER2及RPPH1基因的擴增曲線后，可進一步繪制得到相應基因的標準曲線。圖3為根據(jù)圖2(C)繪制的HER2及RPPH1的標準曲線，其中黑色方塊曲線代表的是HER2基因的標準曲線，白色方塊曲線代表的是RPPH1基因的標準曲線。

4、利用基因拷貝數(shù)相對定量檢測方法評估樣本中HER2基因的擴增狀態(tài)

根據(jù)繪制的標準曲線，可分別求出HER2與RPPH1基因拷貝數(shù)，進而通過計算HER2與RPPH1基因拷貝數(shù)的比值關(guān)系實現(xiàn)對HER2基因拷貝數(shù)的相對定量，圖5為所述實時熒光定量PCR檢測方法示意圖。

圖4是本實施例中兩例樣本HER2及RPPH1基因擴增曲線。其中圖4(A)是編號為1520438的石蠟包埋組織的基因擴增曲線，其CT值為22.57；圖4(B)是編號為1601415的石蠟包埋組織的基因擴增曲線，其Ct值為27.42。參照基因RPPH1的CT值分別為25.33與27.75，分別由對應的標準曲線公式(圖3)求得各自的拷貝數(shù)后，得到HER2/RPPH1分別為7.86(HER2擴增)與1.72(HER2不擴增)。

5、利用ΔΔCt方法評估樣本中HER2基因的擴增狀態(tài)

如上文所示，通過實時熒光定量PCR檢測方法，能夠獲得未知樣本及對照樣本中目的基因及參照基因的Ct值，之后可依據(jù)公式1、2、3計算出HER2的擴增倍數(shù)。所述公式1、2、3如下所示：

公式1：ΔCt＝Ct目的基因-Ct參照基因

公式2：ΔΔCt＝ΔCt未知樣本-Ct對照樣本；

公式3：倍數(shù)變化＝2^-ΔΔCt。

本實施例中以包含HER2與RPPH1基因片段比例為1：1的單一質(zhì)粒作為對照樣本，對所述照樣本進行熒光定量PCR定量檢測，根據(jù)HER2與RPPH1的平均Ct值獲得平均ΔCt對照樣本值；

在評估未知樣本的HER2基因擴增情況時，分析步驟為：

第一、通過qPCR定量檢測，獲得目的基因及參照基因的Ct值后，根據(jù)公式1得到ΔCt未知樣本、ΔCt對照樣本；

第二、利用公式2及已有的ΔCt未知樣本值和ΔCt對照樣本值，算得ΔΔCt后，即可根據(jù)公式3得到倍數(shù)變化關(guān)系。

利用ΔΔCt方法對50例樣本的HER2基因的擴增情況進行評估，具體檢測分析結(jié)果見表10。

6、樣本檢測結(jié)果分析

本實施例對50例乳腺癌石蠟包埋組織樣本進行了HER2基因的相對定量檢測，并與熒光原位雜交(FISH)、免疫組化(IHC)的檢測結(jié)果進行了比較。

本發(fā)明樣本處理方法參照Qiagen公司的GeneRead DNA FFPE KIT使用說明，引物序列、擴增體系和擴增條件參照表7、8、9所述內(nèi)容，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行擴增，同時利用兩種HER2基因相對定量檢測方法對擴增結(jié)果進行評估。本實驗中IHC檢測抗體購自Abcam公司，F(xiàn)ISH檢測試劑購自雅培Vysis，實驗操作參照說明書進行。本發(fā)明提供的兩種HER2基因擴增檢測方法與熒光原位雜交(FISH)、免疫組化(IHC)的檢測結(jié)果，如表10所示。

表10、50例石蠟包埋組織樣本的HER2與RPPH1基因拷貝數(shù)比例關(guān)系及其熒光免疫原位雜交與免疫組化的檢測結(jié)果

IHC是利用福爾馬林固定的石蠟切片免疫顯色反應在蛋白水平上進行HER2蛋白過表達檢測，而FISH則是通過熒光標記的核酸探針與石蠟切片上固定的細胞核內(nèi)的HER2基因的DNA靶序列雜交以檢測其在染色體上的基因擴增情況。當IHC檢測結(jié)果為2+時還需要進一步進行FISH檢測確診。

通過分析表10所得的結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，對30例FISH陽性樣本，本發(fā)明提供的兩種HER2基因相對定量檢測方法檢測均判斷為HER2擴增陽性；對20例FISH陰性樣本，本發(fā)明提供的兩種HER2基因相對定量檢測方法檢測均判斷為HER2擴增陰性，表明，本發(fā)明提供的兩種方法獲得的結(jié)果與臨床金標準FISH結(jié)果高度一致。

傳統(tǒng)的IHC檢測以及FISH檢測方法在臨床檢測中不僅操作繁瑣，價格昂貴，而且耗時較長(IHC檢測需要1-2工作日，F(xiàn)ISH檢測方法則需要4-5個工作日)，無法進行標準化。與本發(fā)明所述方法相比，不僅靈敏度較低，而且還有非特異的假陽性。

本方法整個檢測過程可在3-5小時內(nèi)完成，可實現(xiàn)全自動化操作；另外本方法采用雙通道檢測，操作簡便，一次可實現(xiàn)40-50個樣本的同時檢測，而FISH完全是手工操作，一次檢測樣本難以超過10人份；最后本方法操作簡便，因而穩(wěn)定性好，其重復性遠優(yōu)于IHC及FISH檢測。因此本方法完全可以成為臨床HER2基因檢測的新標準，具有巨大的經(jīng)濟價值。

應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

序列表

<110> 三生國健藥業(yè)（上海）股份有限公司

<120> 一種實時熒光定量PCR檢測方法及其標準品和檢測試劑盒

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggccaaacct tacgatggga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgtctttga cgaccccatt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atagggcgga gggaagctca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatgggcgga ggagagtagt 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctcctccgc ccattggcca aaccttacga 30

<210> 6

<211> 2431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atagggcgga gggaagctca tcagtggggc cacgagctga gtgcgtcctg tcactccact 60

cccatgtccc ttgggaaggt ctgagactag ggccagaggc ggccctaaca gggctctccc 120

tgagcttcgg ggaggtgagt tcccagagaa cggggctccg cgcgaggtca gactgggcag 180

gagatgccgt ggaccccgcc cttcggggag gggcccggcg gatgcctcct ttgccggagc 240

ttggaacaga ctcacggcca gcgaagtgag ttcaatggct gaggtgaggt accccgcagg 300

ggacctcata acccaattca gactactctc ctccgcccat tggccaaacc ttacgatggg 360

atcccagccc gggagatccc tgacctgctg gaaaaggggg agcggctgcc ccagcccccc 420

atctgcacca ttgatgtcta catgatcatg gtcaaatgtg cgtggctgag ctgtgctggc 480

tgcctggagg agggtgggag gtcctgggtg gaggagccca caaggggcat gaaaggggac 540

caggatgtat gtagacccag gagccctagt atgttaggag cctcaaaacc ttcttgtatc 600

ccttttacag tcaaagtcca aagccactct tgaggaacac tcttgtacaa aattaagctg 660

ggcacagtgg ctcatgcctg taatcccagt acttttggag gctgaggtgg gaggatccct 720

tgaagccagg agttcaagac cagcctgggc aacatagtga gatcctatct ctacaaaaaa 780

taaaaaaatt atctgggtgt ggtggtgtgt gccagtagtc ccagctactc aggagaggct 840

gaggcaggaa gatcacttga gcctagttta aggttgcagt aagctatgat tgcaccactg 900

aaatccagcc tgggtgacag agcgaaacct catctcaaaa aaataaaaaa gcaaacaaaa 960

agaaaaaaaa aattaaaagg gaaactagaa gagatgccaa aggttctggc tgaagacccc 1020

agagtctggt gctacttctc taccacctga gggctttggg ctgtcccttg ggactgtcta 1080

gaccagactg gagggggagt gggaggggag aggcagcaag cacacagggc ctgggactag 1140

catgctgacc tccctcctgc cccaggttgg atgattgact ctgaatgtcg gccaagattc 1200

cgggagttgg tgtctgaatt ctcccgcatg gccagggacc cccagcgctt tgtggtcatc 1260

caggtactgg gcctctgtgc cccatccctg cctgtggcta agagcaccct cctgcagagg 1320

gtgggaagga gagatgagtc cagtatgcca ggcccctcac ggaaggctgc atgctgggct 1380

ggggaggggc caccatcctg cctctccttc ctccacagaa tgaggacttg ggcccagcca 1440

gtcccttgga cagcaccttc taccgctcac tgctggagga cgatgacatg ggggacctgg 1500

tggatgctga ggagtatctg gtaccccagc agggcttctt ctgtccagac cctgccccgg 1560

gcgctggggg catggtccac cacaggcacc gcagctcatc taccagggtc agtgccctcg 1620

gtcacactgt gtggctgtct gcttacctcc cccaaccccg gtggactagg gtccctttct 1680

ctgatgttcc ctcaactgtc acctctcaag gaaaccccat tatccctaca aaaaattctt 1740

actgccttcc aacccctgtg accccattct ctccacggtg actgtgtcat accccaaagg 1800

tgacctctgt ttttctcctg tgaccctgtc accttccatg gagtccccat cccagatccg 1860

tgagtgaccc ccatcatgac tttctttctt gtccccagag tggcggtggg gacctgacac 1920

tagggctgga gccctctgaa gaggaggccc ccaggtctcc actggcaccc tccgaagggg 1980

ctggctccga tgtatttgat ggtgacctgg gaatgggggc agccaagggg ctgcaaagcc 2040

tccccacaca tgaccccagc cctctacagc ggtacagtga ggaccccaca gtacccctgc 2100

cctctgagac tgatggctac gttgcccccc tgacctgcag cccccagcct ggtatggagt 2160

ccagtctaag cagagagact gatgggcagg ggaggtggga ccttcagccc agggtccact 2220

gtgggggcag agggagtggc agagacaccg gggttccttc ccctaatggg tcaccttctc 2280

ttgacctttc agaatatgtg aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag 2340

agggccctct gcctgctgcc cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc aagactctct 2400

ccccagggaa gaatggggtc gtcaaagacg t 2431

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctaagcagag agactgatgg gc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggtgaccca ttaggggaag g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcctgtcact ccactcccat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgttctctgg gaactcacct 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcccagggt ccactgtggg gg 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agccctgtta gggccgcctc tgg 23