本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體地指一種用于甜瓜果實(shí)基因pcr表達(dá)分析的內(nèi)參基因及該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證方法。
背景技術(shù)：
：：基因表達(dá)分析是研究基因功能和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要手段。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)因具有高靈敏性、高特異性、高精確性和成本較低等的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的定量分析。在qrt-pcr分析中，為了獲得目標(biāo)基因表達(dá)水平的真正差異，需要消除不同樣本rna產(chǎn)量、質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄效率上存在的差異。消除樣本間的差異通常情況下是采用內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，即通過(guò)分別測(cè)定目的基因以及內(nèi)參基因的表達(dá)量，將內(nèi)參基因表達(dá)量作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量，再比較樣品間相對(duì)表達(dá)量的差異。相對(duì)定量方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高效，應(yīng)用十分廣泛，但需要選擇合適的內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是在所有的樣本中均表達(dá)穩(wěn)定，因此，利用qrt-pcr對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量的準(zhǔn)確性依賴于使用經(jīng)過(guò)系統(tǒng)驗(yàn)證的、表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。甜瓜是葫蘆科甜瓜屬植物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。中國(guó)甜瓜收獲面積和總產(chǎn)量均居世界第一。利用基因表達(dá)分析的方法挖掘甜瓜優(yōu)異基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是進(jìn)行甜瓜遺傳改良的前提。目前在甜瓜基因表達(dá)分析中使用的多是傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，這些傳統(tǒng)內(nèi)參基因并未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)驗(yàn)證，穩(wěn)定性較差，從而導(dǎo)致甜瓜基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性較差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了提高甜瓜基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性，從甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘出一批表達(dá)較穩(wěn)定的基因，并進(jìn)一步比較了這些基因在不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)穩(wěn)定性，最終篩選出適于甜瓜果實(shí)基因表達(dá)分析的穩(wěn)定的內(nèi)參基因。為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的一種用于甜瓜果實(shí)基因pcr表達(dá)分析的內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因?yàn)閙elo3c007745t1基因，所述內(nèi)參基因的核苷酸序列為seqidno：3所示。上述melo3c007745t1基因的pcr擴(kuò)增引物核苷酸序列是：正向引物序列：tctggaggagtaggtcggatacc；反向引物序列：cgatcaatgacgcaacaaggca。一種上述內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證方法，其特征在于，它包括以下步驟：步驟1：在雪里紅甜瓜和風(fēng)味4號(hào)甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，分別選取三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的雪里紅甜瓜和三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的雪里紅甜瓜選取兩株。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的風(fēng)味4號(hào)甜瓜也選取兩株，即一共采集30株雪里紅甜瓜果實(shí)和30株風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)；步驟2：用植物rna提取試劑分別分離以上30株雪里紅甜瓜果實(shí)和30株風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)的總rna，每個(gè)上述總rna均需滿足a260/a280在1.8～2之間以及a260/a230在1.8～2之間；且每個(gè)上述總rna均需要通過(guò)完整性檢測(cè)，對(duì)每個(gè)上述總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到對(duì)應(yīng)的每個(gè)cdna；步驟3：分析雪里紅甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在雪里紅甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別選取如下共有核苷酸序列：melo3c026953t1，核苷酸序列見seqidno：4、melo3c002234t2，核苷酸序列見seqidno：5、melo3c007745t1，核苷酸序列見seqidno：3、melo3c008016t1，核苷酸序列見seqidno：6、melo3c009005t1，核苷酸序列見seqidno：7、melo3c021785t1，核苷酸序列見seqidno：8、melo3c015496t1，核苷酸序列見seqidno：9、melo3c013938t1，核苷酸序列見seqidno：10，cmrpl和cmrps15作為候選內(nèi)參基因；步驟4：將上述8種候選內(nèi)參基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)得到8種對(duì)應(yīng)的引物，并保證各個(gè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在80-150bp之間，用上述8種引物均對(duì)每個(gè)cdna進(jìn)行常規(guī)pcr擴(kuò)增得到每個(gè)cdna對(duì)應(yīng)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)每個(gè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)檢驗(yàn)上述每個(gè)引物是否擴(kuò)增出有效的唯一的條帶；步驟5：將引物稀釋至不同倍數(shù)后對(duì)所有上述獲得的cdna進(jìn)行qrt-pcr實(shí)驗(yàn)，以引物的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)ct值為縱坐標(biāo)繪制引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到引物的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)；步驟6：采用genorm軟件分析上述候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，表達(dá)最穩(wěn)定的一對(duì)候選內(nèi)參基因是melo3c008016t1，melo3c009005t1，其次是melo3c007745t1，最不穩(wěn)定的是cmrps15；步驟7：對(duì)上述所有候選內(nèi)參基因在每個(gè)樣本中的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)用normfinder軟件計(jì)算基因表達(dá)穩(wěn)定值m，根據(jù)得到的所有基因表達(dá)穩(wěn)定值m的到上述所有候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的排列順序依次是：melo3c008016t1﹥melo3c007745t1﹥melo3c009005t1﹥melo3c002234t2﹥melo3c013938t1﹥melo3c021785t1﹥melo3c015496t1﹥cmrpl﹥melo3c026953t1﹥cmprs15；上述樣本為步驟1中采集的30株雪里紅甜瓜和30株風(fēng)味4號(hào)甜瓜；步驟8：使用bestkeeper軟件計(jì)算所有候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差sd和變異系數(shù)cv，以及各候選內(nèi)參基因間的泊松相關(guān)系數(shù)r，以此來(lái)確定候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)差sd小于1的候選內(nèi)參基因被認(rèn)為是穩(wěn)定表達(dá)的基因，標(biāo)準(zhǔn)差sd越小，變異系數(shù)cv越小，該候選內(nèi)參基因越穩(wěn)定，泊松相關(guān)系數(shù)r值越大的候選內(nèi)參基因越穩(wěn)定；反之，則越不穩(wěn)定，上述所有候選內(nèi)參基因中，melo3c026953t1基因?yàn)樽罘€(wěn)定的候選內(nèi)參，其次是melo3c008016t1、melo3c002234t2、melo3c007745t1和melo3c009005t1；步驟9：利用genorm、normfinder和bestkeeper三個(gè)內(nèi)參篩選軟件綜合分析各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序，利用genorm、normfinder和bestkeeper三個(gè)內(nèi)參篩選軟件得到的共同的穩(wěn)定性最好的前四個(gè)的候選內(nèi)參基因依次是melo3c008016t1、melo3c009005t1、melo3c007745t1和melo3c002234t2，共同的穩(wěn)定性最差的前兩個(gè)候選內(nèi)參基因順序依次是cmprs15和cmrpl。本發(fā)明的內(nèi)參基因具有如下有益效果：1、表達(dá)穩(wěn)定性高：本發(fā)明利用甜瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在全基因組水平上比較了基因的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，并從中篩選出了合適的內(nèi)參基因，而傳統(tǒng)的內(nèi)參基因在轉(zhuǎn)錄組分析中表達(dá)水平和穩(wěn)定性不高。因此，本發(fā)明獲得的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性要優(yōu)于目前使用的傳統(tǒng)內(nèi)參基因。2、適用范圍廣：本發(fā)明分析了新內(nèi)參基因在兩個(gè)不同風(fēng)味的甜瓜品種果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性，因此，本發(fā)明所獲得的內(nèi)參基因具有廣泛的適用性。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明中候選內(nèi)參基因的pcr擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。圖2為本發(fā)明中“風(fēng)味4號(hào)”甜瓜果實(shí)中cmain2基因在不同候選內(nèi)參基因中的相對(duì)表達(dá)量；圖3為本發(fā)明中“雪里紅”甜瓜果實(shí)中cmain2基因在不同候選內(nèi)參基因中的相對(duì)表達(dá)量；圖4為本發(fā)明中“風(fēng)味4號(hào)”甜瓜果實(shí)中cmsps1基因在不同候選內(nèi)參基因中的相對(duì)表達(dá)量；圖5為本發(fā)明中“雪里紅”甜瓜果實(shí)中cmsps1基因在不同候選內(nèi)參基因中的相對(duì)表達(dá)量。圖1中，1—melo3c009005t1、2—melo3c026953t1、3—melo3c007745t1、4—melo3c013938t1、5—melo3c015496t1、6—cmrpl、7—cmrps15、8—melo3c021785t1、9—melo3c002234t2、10—melo3c008016t1。圖1中，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp表示對(duì)應(yīng)條帶的大小。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明：本發(fā)明的一種用于甜瓜果實(shí)基因pcr表達(dá)分析的內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因?yàn)閙elo3c007745t1基因，所述內(nèi)參基因的核苷酸序列為seqidno：3所示。上述melo3c007745t1基因的pcr擴(kuò)增引物核苷酸序列是：正向引物序列：tctggaggagtaggtcggatacc(seqidno：1所示)；反向引物序列：cgatcaatgacgcaacaaggca(seqidno：2所示)。一種上述內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證方法，它包括以下步驟：步驟1：在雪里紅甜瓜和風(fēng)味4號(hào)甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，分別選取三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的雪里紅甜瓜和三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的雪里紅甜瓜選取兩株。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的風(fēng)味4號(hào)甜瓜也選取兩株，即一共采集30株雪里紅甜瓜果實(shí)和30株風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)；步驟2：用植物rna提取試劑(植物rna提取試劑plantrnaextractionkit為takara)分別分離以上30株雪里紅甜瓜果實(shí)和30株風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)的總rna，每個(gè)上述總rna均需滿足a260/a280在1.8～2之間以及a260/a230在1.8～2之間表明總rna濃度和質(zhì)量達(dá)標(biāo)(用nanodrop2000檢測(cè)rna的濃度和質(zhì)量，a260/a280和a260/a230的比值)；且每個(gè)上述總rna均需要通過(guò)完整性檢測(cè)(rna的完整性采用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳圖譜28s，18s條帶清晰，表明rna完整性較好)，對(duì)每個(gè)上述總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到對(duì)應(yīng)的每個(gè)cdna(1ul總rna采用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara)試劑盒首先進(jìn)行基因組dna去除，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(兩步法：37℃15min；85℃5s)形成20μl第一鏈cdna。兩個(gè)品種不同處理間樣本分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每一份材料都進(jìn)行重復(fù)，作為備份，-80℃保存)；步驟3：分析雪里紅甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在雪里紅甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風(fēng)味4號(hào)甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別選取如下共有核苷酸序列：melo3c026953t1，核苷酸序列見seqidno：4、melo3c002234t2，核苷酸序列見seqidno：5、melo3c007745t1，核苷酸序列見seqidno：3、melo3c008016t1，核苷酸序列見seqidno：6、melo3c009005t1，核苷酸序列見seqidno：7、melo3c021785t1，核苷酸序列見seqidno：8、melo3c015496t1，核苷酸序列見seqidno：9、melo3c013938t1，核苷酸序列見seqidno：10，cmrpl和cmrps15作為候選內(nèi)參基因；其中，cmrpl和cmrps15為參考文獻(xiàn)中報(bào)道的序列(kong,q.,etal.,assessmentofsuitablereferencegenesforquantitativegeneexpressionstudiesinmelonfruits.frontplantsci,2016.7:p.1178.)；步驟4：將上述8種候選內(nèi)參基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)得到8種對(duì)應(yīng)的引物，(上述8個(gè)候選內(nèi)參在ncbi網(wǎng)站中進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并將每個(gè)引物分別于與雪里紅甜瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風(fēng)味4號(hào)甜瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行blast序列比對(duì))，并保證各個(gè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在80-150bp之間，用上述8種引物均對(duì)每個(gè)cdna進(jìn)行常規(guī)pcr擴(kuò)增(常規(guī)pcr程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，31個(gè)循環(huán)，72℃延伸4min)得到每個(gè)cdna對(duì)應(yīng)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)每個(gè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢驗(yàn)上述每個(gè)引物是否擴(kuò)增出有效的唯一的條帶，cdna條帶為清晰的唯一條帶表明該引物具有特異性，候選內(nèi)參基因的引物序列及擴(kuò)增特征見表1，其擴(kuò)增特異性檢測(cè)結(jié)果見圖1；步驟5：將引物稀釋至不同倍數(shù)后對(duì)所有上述獲得的cdna進(jìn)行qrt-pcr實(shí)驗(yàn)，以引物的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)ct值為縱坐標(biāo)繪制引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到引物的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)；步驟6：采用genorm軟件分析上述候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性(genorm軟件通過(guò)計(jì)算某一基因與其他基因間兩兩比值的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值的平均變異度m作為基因穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)，m值越大，穩(wěn)定性越差，反之，越穩(wěn)定)，表達(dá)最穩(wěn)定的一對(duì)候選內(nèi)參基因是melo3c008016t1，melo3c009005t1，其次是melo3c007745t1，最不穩(wěn)定的是cmrps15；步驟7：對(duì)上述所有候選內(nèi)參基因在每個(gè)樣本中的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)用normfinder軟件計(jì)算基因表達(dá)穩(wěn)定值m，由表2可知根據(jù)得到的所有基因表達(dá)穩(wěn)定值m的到上述所有候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的排列順序依次是：melo3c008016t1﹥melo3c007745t1﹥melo3c009005t1﹥melo3c002234t2﹥melo3c013938t1﹥melo3c021785t1﹥melo3c015496t1﹥cmrpl﹥melo3c026953t1﹥cmprs15；上述樣本為步驟1中采集的30株雪里紅甜瓜和30株風(fēng)味4號(hào)甜瓜；與genorm分析結(jié)果相似，排在前3位的基因均為melo3c008016t1，melo3c007745t1，melo3c009005t1，最不穩(wěn)定的基因均為cmprs15；步驟8：使用bestkeeper軟件計(jì)算所有候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差sd和變異系數(shù)cv，以及各候選內(nèi)參基因間的泊松相關(guān)系數(shù)r，以此來(lái)確定候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)差sd小于1的候選內(nèi)參基因被認(rèn)為是穩(wěn)定表達(dá)的基因，標(biāo)準(zhǔn)差sd越小，變異系數(shù)cv越小，該候選內(nèi)參基因越穩(wěn)定，泊松相關(guān)系數(shù)r值越大的候選內(nèi)參基因越穩(wěn)定；反之，則越不穩(wěn)定，由表3可知，上述所有候選內(nèi)參基因中，melo3c026953t1基因?yàn)樽罘€(wěn)定的候選內(nèi)參，其次是melo3c008016t1、melo3c002234t2、melo3c007745t1和melo3c009005t1；步驟9：利用genorm、normfinder和bestkeeper三個(gè)內(nèi)參篩選軟件綜合分析各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序如表4所示，利用genorm、normfinder和bestkeeper三個(gè)內(nèi)參篩選軟件得到的共同的穩(wěn)定性最好的前四個(gè)的候選內(nèi)參基因依次是melo3c008016t1、melo3c009005t1、melo3c007745t1和melo3c002234t2，共同的穩(wěn)定性最差的前兩個(gè)候選內(nèi)參基因順序依次是cmprs15和cmrpl；步驟10：分析上述所有樣本的蔗糖代謝相關(guān)的基因cmain2和cmsps基因的表達(dá)模式，通過(guò)對(duì)cmain2和cmsps的表達(dá)分析來(lái)驗(yàn)證篩選出的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性；按照上述步驟2中的方法進(jìn)行總rna的分離，第一鏈cdna的合成。由篩選軟件genorm、normfinder和bestkeeper分析結(jié)果得知，melo3c008016t1和melo3c009005t1，melo3c007745t1為比較優(yōu)質(zhì)的內(nèi)參基因，cmrps15是最不穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因；在cmain2和cmsps基因的表達(dá)中，用cmprs15作為內(nèi)參基因時(shí)，表達(dá)量差異幅度較大，可能導(dǎo)致目標(biāo)基因的表達(dá)量估計(jì)不準(zhǔn)，利用單獨(dú)基因melo3c007745t1，2個(gè)基因組合melo3c008016t1和melo3c009005t1，3個(gè)基因組合作melo3c007745t1和melo3c008016t1以及melo3c009005t1為內(nèi)參基因時(shí)表達(dá)量正常，考慮到2個(gè)基因組合melo3c008016t1和melo3c009005t1，3個(gè)基因組合melo3c007745t1和melo3c008016t1以及melo3c009005t1更復(fù)雜，不利于簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作所以確定單獨(dú)基因melo3c007745t1作為篩選得到的最終內(nèi)參基因。上述技術(shù)方案的步驟1中，試驗(yàn)材料為雪里紅和風(fēng)味4號(hào)，果實(shí)成熟時(shí)雪里紅沒(méi)有酸味，風(fēng)味4號(hào)具有獨(dú)特的酸甜味。在武漢市黃陂區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)園武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院作物科學(xué)研究所塑料溫室內(nèi)進(jìn)行栽種。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。重復(fù)內(nèi)每個(gè)品種種植60株。于授粉后15、20、25、30、35天，選取長(zhǎng)勢(shì)相近的植株，采摘果實(shí)樣品。每個(gè)點(diǎn)取三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取兩株。選取長(zhǎng)勢(shì)相近的植株，取內(nèi)層果肉。切成小塊，液氮速凍，-80℃保存。上述技術(shù)方案的步驟5中，qrt-pcr采用transstarttmtopgreenqpcrsupermix(天根生化科技有限公司)作為熒光染料，試驗(yàn)采用12μl上樣體系，包括2μl模板(100ng)，前后引物各2μl(5nmol)，6μl的2×transstarttopgreenqpcrsupermix。qrt-pcr在roche480實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，pcr循環(huán)如下：在56℃這一步采集熒光。最終的cp(crossingpoint)值包括了所有樣本的生物學(xué)重復(fù)及技術(shù)重復(fù)。分析引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算引物擴(kuò)增效率(e)。通過(guò)混合樣品cdna以5倍的濃度梯度依次稀釋5個(gè)濃度(450，90，18，3.6和0.72ng/ul)，進(jìn)行qrt-pcr，運(yùn)用擴(kuò)增效率的計(jì)算公式e＝(10-1//slope-1)×100進(jìn)行計(jì)算。上述技術(shù)方案的步驟10中，在不同內(nèi)參基因條件下，“風(fēng)味4號(hào)”和“雪里紅”的表達(dá)量有一定差別(圖2～圖5)。在發(fā)育初期，“風(fēng)味4號(hào)”中cmain2的表達(dá)量比較高，從20d開始表達(dá)下調(diào)；“雪里紅”中cmain2的表達(dá)變化略有差異，但變化趨勢(shì)與“風(fēng)味4號(hào)”基本一致，初期表達(dá)量比較高，在成熟期表達(dá)量很低。而cmsps1基因在“風(fēng)味4號(hào)”和“雪里紅”中的表達(dá)量變化呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，開始先緩慢上升之后在成熟前至峰值時(shí)又開始回落，這與蔗糖積累開始較慢之后開始加快在然后在成熟前又開始減慢的變化趨勢(shì)大體相同的。表1候選內(nèi)參基因的引物序列及qrt-pcr的擴(kuò)增特征序列表seqidno：1是melo3c007745t1引物的正向引物序列。序列表seqidno：2是melo3c007745t1引物的反向引物序列。序列表seqidno：3是melo3c007745t1基因的核苷酸序列。表2用normfinder計(jì)算的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值及排序穩(wěn)定性排序基因名稱穩(wěn)定值(m)1melo3c008016t10.0172melo3c007745t10.0203melo3c009005t10.0224melo3c002234t20.0245melo3c013938t10.0276melo3c021785t10.0357melo3c015496t10.0408cmrpl0.0449melo3c026953t10.04510cmprs150.047表3bestkeeper軟件分析10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性表4利用genorm，normfinder，bestkeeper綜合分析結(jié)果本說(shuō)明書未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。<110>武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院作物科學(xué)研究所<120>用于甜瓜果實(shí)基因pcr表達(dá)分析的內(nèi)參基因及該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證方法<211>23bp<212>cdna<213>melo3c007745t1引物的正向引物序列<400>1tctggaggagtaggtcggatacc<210>2<211>23bp<212>cdna<213>melo3c007745t1引物的反向引物序列<400>2cgatcaatgacgcaacaaggca<210>3<211>1508bp<212>cdna<213>melo3c007745t1基因的核苷酸序列<400>3ccaagaaggcccaatactttggacgctgttagttatccagtttaacggttacagttataaactactagatcggataaaagtcgcgcgtaaatcattgaattaatcggggttttcccctccacttcgaagtccaactctttcccattcaccgtgtgaagtcaaatctgtcttcacttccattttctattctgaaggatggacctatgtcccccttcccatgtctgagtacaaaccctagattcttgaactgtctacactctaaaacgatgtcgcttcctttccaatccctttcactcacttcaccttcttcttcaacattgtgcttttccacccttttttctagaaatccgagcgtgtctcttggattcccccctagccgtttcccgaacaccctgcatttccaaattcttgattacaagtttcgaagcccttttaattttggttccatcgatgcccatcagttctgtcctcgagtttctacttctggaggagtaggtcggatacccggtggtggtggtggtggtggtggtgatttcgatatcgattctttactttcagctgccgagttgttttgccttgttgcgtcattgatcggttctgttggttttgctttgaattgcgcgaaaaccaggtctaagagcgtgttcttggcggtgtttggtgatggggttctcgttggcgcgattttatttctggttgctggggttgcgattggtgcttggattcgtaggcggcagtggaatcgagtttttcgagagacagtgaagggcgttttagaggtgaatttgatggaaaagactaacaagcttgaggaggatttgaggagctcggcaacgctaattcgagttttgtcgaggcagctggagaagttagggattaggtttagagttactcgaaaggctctgaagaagcccgttgaggagactgcagctttagctcaaaagacttccgaggccacccgagcattagcagttcggggagatattttggagaaggagcttgctgaaatccagaaggttttactagctatgcaggaacaacaacaaaagcaacttgaattgattctagcaataggaaagtcaggaaagatgtgggaaagcagacaggagcatagtggaggacaaagtcatattgggaggcatgatctgattgatgaacgcttaaatcgaaaggaagtccaggacgtttgagctgtttgaagaaacgaatggagatagcttaggattcttttgttacaaattaggatagtaattgttgcataacgacagaatagaagaatgggatgtaattttgtggcagtttaaactttggcatttatcatgcttgatacttcttgccagaaaagatttttggtttccataatgtgcaatttaacgagaaatgaacgttgcaccaagagaaagtgtaaagcggcaggggaattgtaatgggagaaatgtatttgttatggtcattgggttaatgtaataaacattctgcttaaccattttaattttgattttcgttgt<210>4<211>622bp<212>cdna<213>melo3c026953t1基因的核苷酸序列<400>4atggagtcgtgtctgcccctttctgttccaggaaggcagcagaaactacagttcacatttggatgccaagtggtcttgccccccgagagttttctgacacttcggcttccatttgtctatggggtgcaacttgaggatggaagttttcaccctcttaaccctcttcaacatcaacctgaagcgactgcatggattattgggggcacaacattgcagatcctgtcaaagtctggcaatctagatgagggatctcaaacataatcagaatttttttaaacattggaagcttgatctgtatgacctgcatctgtgaagggtttcagtcattcaataaaaaagagatgcacgcatattttaccaggttcatcaaagtgttgatatctcaagcaatgactggggatgtaaaatgtgaagtgtctatctggatacttcctctttggtggttatcgcaatggtacgcatacaataaatacccagtgactgtgagctgcttcttccagactggatgagaccagcctattaagctgtttccagcctccagggaggattttgtattgatccatcaatctactgttaccagagtcttgacagttgatccttgactcattagcaaagaggggag<210>5<211>2118bp<212>cdna<213>melo3c002234t2基因的核苷酸序列<400>5gagctcaacaagggcgccataccatagattcaatgacttccaaagataattgtagatacgagcttcgtactgcaattcgtcagctcagtgatcgttgtctttactctgcttctaaatgggcagcagagcaattggtgggtatcgagcaagatccagctaagttcacaccttcaaacaccaggtttcaacgtggaagttcaagtattcgtcgaagatttcattcaaatgagggtagttcaactccaattgctggcatttcttatgtttctacgccagtgatggaggaggatgaagttgtggatggtgatttttaccttctggccaaatcatactttgattgtcgtgaatacaagagggctgctcatgttcttcgagagcaaaatggaaagaaatccgtgttcttgcggctgtatgctctttatctggctggtgaaaagcggaaagaagaagaggtagtagaacttgaaggatcattgggtaaaagcgatgctgtaaatcaagagctggtttcactggaaagggaattatcaacccttagaaaaaatggcatgattgacccctttggactgtacttgtatggactcgtactcaaacaaaaaggcagtgaaaatcttgctcgtacagctcttgtggagtcggtgaacagctatcctt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