一種分層包裝帶指示劑的直接實(shí)時(shí)定量熒光pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種分層包裝帶指示劑的直接實(shí)時(shí)定量熒 光PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)是一種根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù) 制性質(zhì)而設(shè)計(jì)的體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的技術(shù)。PCR反應(yīng)體系主要由核酸引物、4種 dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反應(yīng)緩沖液體系組成。自美國(guó)Cetus公司人類遺傳室Kary Mullis及其同事于1985年發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來(lái)，PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)就被快速 開(kāi)發(fā)出來(lái)，并在多種核酸檢測(cè)中得到了廣泛的運(yùn)用。尤其是病毒或其他病原體的檢測(cè)，當(dāng)知 道待檢病原某一特定基因片段時(shí)，即可利用特異性的引物對(duì)樣品中微量的目標(biāo)DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使其達(dá)到檢測(cè)量，通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)，即可確定病原體的存在與否。
[0003] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用DNA擴(kuò)增過(guò)程中 熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方 法。與普通的PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn) 確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了PCR的定量分析。
[0004] 目前，無(wú)論臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)還是疫情處理，傳染病病原的核酸熒光PCR檢測(cè)技術(shù)， 均需經(jīng)過(guò)核酸提取或純化過(guò)程，該過(guò)程需要專門的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和相應(yīng)設(shè)備，實(shí)驗(yàn)操作人員 需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)；另外，這樣的操作增加了實(shí)驗(yàn)操作步驟，并延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，增加了污染的 幾率。同時(shí)，DNA聚合酶與PCR反應(yīng)試劑的混合接觸，也會(huì)導(dǎo)致其活性的降低，從而降低實(shí)時(shí) 熒光定量PCR的敏感性。
[0005]因此，需要找到一種試劑穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)實(shí)時(shí)定量熒光PCR過(guò)程中核酸提取操作復(fù)雜，容 易產(chǎn)生污染，且PCR靈敏度低的缺點(diǎn)，提供了一種試劑穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確的直接 實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0008] -種分層包裝帶指示劑的直接實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，將熱啟動(dòng)DNA聚合酶和PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液各自分層包裝在PCR擴(kuò)增管內(nèi)，使用時(shí)加入核酸裂解液和待測(cè)樣品，進(jìn)行實(shí)時(shí)定 量熒光PCR。
[0009]本發(fā)明技術(shù)方案的具體實(shí)施步驟為：
[0010] 1)用熔點(diǎn)為50°C~55°C的石蠟油混合物包被熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，并置于PCR擴(kuò) 增管管底；
[0011 ] 2)混合引物、探針、TriS堿、氯化鎂、氯化鉀、石綠和dNTP，制得焚光PCR擴(kuò)增試劑于 石蠟油混合物上層；
[0012] 3)用熔點(diǎn)為40°C~45°C的石蠟油封閉所述熒光PCR擴(kuò)增試劑于步驟1)的PCR擴(kuò)增 管內(nèi)；
[0013] 4)石蠟油冷凝后，加入核酸裂解試劑和待測(cè)樣品；
[0014] 5)檢測(cè)樣品。
[0015]在本發(fā)明的技術(shù)方案中，發(fā)明人采用分層包裝的方法將熱啟動(dòng)DNA聚合酶和PCR擴(kuò) 增反應(yīng)液分別用石蠟油混合物包被，使二者彼此分開(kāi)而不混合，以此保證聚合酶的活性，防 止聚合酶因直接與PCR擴(kuò)增反應(yīng)液混合而導(dǎo)致的活性降低。
[0016]作為優(yōu)選，所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。
[0017] 作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括引物、探針、Tris堿、氯化鎂、氯化鉀和dNTP。
[0018]作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明人利用石蠟油混合物對(duì)所述熱啟動(dòng) DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行分層包裝。作為優(yōu)選，所述石蠟油混合物包括石蠟油和樹(shù) 月旨。更優(yōu)選地，所述石蠟油為優(yōu)質(zhì)石蠟油，所述樹(shù)脂為安息香。
[0019]作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述石蠟油混合物的熔點(diǎn)不低于40°C。同 時(shí)，調(diào)節(jié)石蠟油和樹(shù)脂的混合比例將石蠟油混合物配制成熔點(diǎn)為50°C~55°C和40°C~45°C 的石蠟油混合物。所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶通過(guò)熔點(diǎn)為50°C~55°C的石蠟油混合物被包裝在 PCR擴(kuò)增管底部，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液通過(guò)熔點(diǎn)為40°C~45°C的石蠟油混合物被包裝在熱啟 動(dòng)DNA聚合酶的上部。將熱啟動(dòng)DNA聚合酶和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液分別用不同熔點(diǎn)的石蠟油混合 物包被，可以使PCR反應(yīng)試劑在加熱時(shí)首先釋放并與已裂解好的樣品充分混合，且此時(shí)不會(huì) 影響聚合酶的活性，防止聚合酶因直接與PCR擴(kuò)增反應(yīng)液混合而導(dǎo)致的活性降低。待加熱至 72°C時(shí)，聚合酶充分釋放，并與液體充分混合，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
[0020] 為了便于觀察石蠟油的分層包裝的效果，作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有指示劑。更優(yōu)選地，所述指示劑選自溴酚藍(lán)、石綠、甲基紅、甲基 橙、羅丹名、溴甲酚綠、品紅、二甲酚橙、二苯胺或剛果紅中的一種。
[0021] 同時(shí)作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸裂解液中也含有指示劑，且 PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的指示劑與核酸裂解液中的指示劑不同。這樣不僅能夠保證石蠟油混合 物的分層包裝效果，同時(shí)也可保證樣品加入的準(zhǔn)確性，防止多加、錯(cuò)加、漏加。
[0022]更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述指示劑的加入量低于O.Olwt%。
[0023]在本發(fā)明中，所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶的用量和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中各個(gè)組分的比例可 以根據(jù)需要設(shè)置。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶濃度為2.5 ~3.5U/yL;所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中包含濃度為30~50nmolAxL的上下游引物和10~30nmol/ yL的探針、10 ~30nmolAiL的Tris堿、10 ~30mmolAiL氯化鎂、100 ~200mmolAiL氯化鉀、150 ~250umolAiL的dNTP和不多于O.OOlwt%的石綠指示劑。
[0024]在本發(fā)明中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的包裝方法為:將20~30yL所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液 加入到包裝好的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的上部，加入15~25yL熔點(diǎn)為40~45°C的石蠟油混合物， 來(lái)封閉PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。
[0025]在所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包裝完成后，在其上方加入核酸裂解液。得到的含有熱啟動(dòng) DNA聚合酶、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和核酸裂解液的PCR擴(kuò)增管可立即使用也可封裝后冷藏保存。
[0026]作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸裂解液由0.2~0.4N氫氧化鈉、 0.3~0.6M氯化鉀、0.01~0·05%Ν-月桂酰肌氨酸鈉、5mMEDTA、0.3~0.6MTris-HCL和1~ 2%曲通X-100組成。
[0027]更優(yōu)選地，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸裂解液由0.3N氫氧化鈉、 0.45M氯化鉀、0.03%N-月桂酰肌氨酸鈉、0.45MTris-HCL、5mMEDTA和1%曲通X-100組成。
[0028]本發(fā)明中所述核酸裂解液可根據(jù)需要任意設(shè)置。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方式中，所述核酸裂解液的加入量為15~25yL，更優(yōu)選地為20yL。
[0029] 作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在加入核酸裂解液和待測(cè)樣品后對(duì)所述 PCR擴(kuò)增管37°C加熱5min，然后在72°C條件下加熱30s，500rpm離心后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光 PCR〇
[0030]更具體地，利用本發(fā)明的直接實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)行PCR定量檢測(cè)，包括如 下步驟：
[0031] 1)將15~25yL待測(cè)樣本加入到含有熱啟動(dòng)DNA聚合酶、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和核酸裂解 液的PCR擴(kuò)增管中，輕輕搖勻；
[0032] 2)將上述PCR擴(kuò)增管放置在具有制冷功能的干熱器上運(yùn)行37°C，5min; 72°C，30s， 然后將管內(nèi)分層試劑顛倒混勻，500rpm水平離心30秒鐘。
[0033] 3)將所得PCR擴(kuò)增管放置于PCR儀中，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。
[0034]為了更好的裂解樣品，可以在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前低速離心PCR擴(kuò)增管，以減少管壁和 管蓋上黏附的核酸裂解液，從而充分裂解樣品，所述低速離心的轉(zhuǎn)速可以為100~500rpm/ min〇
[0035] 在本發(fā)明中，發(fā)明人利用熔點(diǎn)為40°C~45°C和50°C~55°C的石蠟油混合物將分別 將熱啟動(dòng)DNA聚合酶、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和核酸裂解液隔離，以此保證熱啟動(dòng)DNA聚合酶不會(huì)因 與PCR反應(yīng)液混合而導(dǎo)致的活性降低。同時(shí)，核酸裂解液位于混合物的上層，加入待檢樣品 后，在具有制冷功能的干熱器上運(yùn)行37°C，5min。此步驟不僅可以保證核酸裂解液在37°C環(huán) 境下可以與待檢樣品充分混合，且能加快裂解效率，實(shí)現(xiàn)樣品核酸的徹底裂解和釋放。同時(shí) 在37°C環(huán)境下不會(huì)影響PCR反應(yīng)試劑與熱啟動(dòng)DNA聚合酶的保存狀態(tài)及活性，實(shí)現(xiàn)一管內(nèi)的 不同反應(yīng)。在具有制冷功能的干熱器上運(yùn)行72°C，30s步驟中，可以使熱啟動(dòng)DNA聚合酶、PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液、已經(jīng)釋放出的核酸充分混勻，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供保證。在干熱器進(jìn)行 石蠟油的融化程序后，將管內(nèi)分層試劑顛倒混勻，500rpm離心30秒鐘，直接進(jìn)行熒光PCR擴(kuò) 增。
[0036]作為優(yōu)選，所述待測(cè)樣品包括但不限于培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)菌、血清、血漿、唾液、尿液 或胸腹水等，優(yōu)選為血清或血漿。所述待測(cè)樣品體積為15~25yL，優(yōu)選地為20yL，所述樣品 加入核酸裂解液后，輕輕晃動(dòng)使其與檢測(cè)樣本充分混勻。
[0037] 本發(fā)明適用的檢測(cè)項(xiàng)目包括乙肝病毒、CMV、EBV等DNA病毒及人血清、血漿基因組 核酸檢測(cè)。
[0038]本發(fā)明中的實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)條件可根據(jù)需要設(shè)置。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?37°C，2min; 95°C，lOmin;然后以95°C，10s和61°C，45s 進(jìn)行45~50個(gè)循環(huán)。在61°C檢測(cè)焚光信號(hào)。
[0039]本發(fā)明的有益效果為：
[0040]本發(fā)明的直接實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，將熱啟動(dòng)DNA聚合酶、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和核 酸裂解液分別采用不同熔點(diǎn)梯度的石蠟油進(jìn)行分割。此方法不僅可以使熱啟動(dòng)DNA酶與PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液所處環(huán)境相互獨(dú)立，保證熱啟動(dòng)DNA聚合酶的活性，同時(shí)為核酸裂解液和待檢樣 品的充分反應(yīng)提供了一個(gè)獨(dú)立的環(huán)境以保證待檢樣品中的核酸充分釋放。同時(shí)，采用不同 顏色的指示劑對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和核酸裂解液進(jìn)行區(qū)分，保證石蠟油分割的有效性以及后 續(xù)血清/血漿等樣本加入充分混勻的可靠性。試劑預(yù)先制備包裝后，用戶只需將采集的血 清、血漿、唾液、尿液或胸腹水等微量樣本直接加到PC