一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物及試劑盒；首先通過設(shè)計(jì)并篩選得到一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物和探針，所述上游引物、下游引物和探針的序列如SEQ ID NO：1～3所示；利用該引物和探針可特異性擴(kuò)增出來塞內(nèi)加谷病毒，實(shí)時(shí)熒光定量可通過實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，采集熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)CT值來鑒別SVV；利用所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增后即可鑒別SVV，準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高效地進(jìn)行鑒定SVV，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【專利說明】
-種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)黃光定量PCR檢測引物及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)巧光定量 PCR檢測引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 塞內(nèi)加谷病毒(Seneca Valley virus SW)是單股正鏈RNA病毒，是小核糖核酸病 毒科Senecavirus病毒屬的典型代表。其最初被認(rèn)為是PER. C6細(xì)胞培養(yǎng)物中的污染物，隨后 在美國和加拿大的豬群中被分離，2007年在美國一屠宰場的豬群中出現(xiàn)水瘤性疾病臨床癥 狀，約80%的豬出現(xiàn)販足，PCR檢測豬口蹄疫、豬水瘤病、水瘤性口炎和水瘤性疹均為陰性，而 SVV卻為陽性，從而被認(rèn)為是原發(fā)性水瘤性疾病。近期豬塞內(nèi)加谷病毒(SVV)在己西豬群中 的感染與爆發(fā)，證明了豬塞內(nèi)加谷病毒很有可能是豬的原發(fā)性水瘤性疾病病原之一。2015 年我國及己西出現(xiàn)了幾次SVV感染豬群并出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床發(fā)病及死亡癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng) 濟(jì)損失。SVV在臨床上所引起的臨床癥狀與其他一些豬的水泡病極為相似，在臨床和組織病 理學(xué)上很難區(qū)分，運(yùn)就給該病的確診帶來一定難度，其鑒別診斷通常需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技 術(shù)，傳統(tǒng)的檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作方法繁瑣，不利于疾病的及時(shí)診斷治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中塞內(nèi)加谷病毒檢測所存在的上述 缺陷，提供一種特異性檢測塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)巧光定量PCR的引物。
[0004] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含上述檢測引物的試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)的： 一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測引物和探針，所述上游引物、下游引物和探針 的序列如沈Q ID NO: 1~3所示。
[0006] 優(yōu)選地，所述探針的5'端標(biāo)記的是巧光報(bào)告基團(tuán)；3'端標(biāo)記的是澤滅基團(tuán)。
[0007] 更優(yōu)選地，所述巧光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述澤滅基團(tuán)為TAMAR。
[000引本發(fā)明還提供含有所述塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測引物和探針的試劑 盒。
[0009] 優(yōu)選地，所述上游引物、下游引物和探針的濃度為10測。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、巧光染料、陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
[00川更優(yōu)選地，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是從SVV細(xì)胞病毒抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄成 CDNA，再經(jīng)PC時(shí)尋SW-3C基因擴(kuò)增出來，得到與目的片段大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物回收 后，經(jīng)與PMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增含有目的片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCRW及測序鑒定， 證實(shí)已成功地構(gòu)建了 SW重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，命名為PMD19-T-3C，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品待用。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)行巧光定量PCR的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq(P;robe qPCR)(2X)10iiL、10 咖，0.4化上游引物、10 咖，0.4化下游引物、ROX Reference Dye II 巧OX )0.2化、10 yM，0.祉L探針、DNA模板2.0化、d地2〇 6.2化。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)行進(jìn)行巧光定量PCR的反應(yīng)條件為：95 °C 30秒，95 °C 5 秒，60 °C 34秒，40個(gè)循環(huán)。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明通過設(shè)計(jì)并篩選得到一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測引物和探針，所 述上游引物、下游引物和探針的序列如SEQ ID N0:1~3所示;利用該引物和探針可特異性 擴(kuò)增出來塞內(nèi)加谷病毒，實(shí)時(shí)巧光定量可通過實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR過程中雙鏈DNA巧光染料與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，采集巧光數(shù)據(jù)，根據(jù)CT值來鑒別SVV;利用所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增后即 可鑒別SW，準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可W準(zhǔn)確、快速、高效地進(jìn)行鑒定SVV，有利于在 臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0015] 圖1為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PMD19-T-3C的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0016] 圖2為實(shí)時(shí)巧光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017] 圖3為實(shí)時(shí)巧光定量PCR的靈敏性試驗(yàn)；其中1為1 X IO9Copies/化；2為1 X l〇8copies/iiL;3為 1 X l〇7copies/iiL;4為 1 X l〇6copies/iiL;5為 1 X l〇5copies/iiL;6為 1 X l〇4copies/化;7為 1 X l〇3copies/化;8為 1 X l〇2copies/化;9為 1 X loVopies/化；10為 1 X 10*^cop i e s/化;11為陰性對照。
[001引圖4為實(shí)時(shí)巧光定量PCR的特異性試驗(yàn)，其中1為SVV; 2為FMDV; 3為SVDV; 4為VSV; 5 為PRRSV; 6 為PCV; 7 為PRV; 8 為PK-15 細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對 本發(fā)明的限制。不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改 或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知的常規(guī)方法和技術(shù)，試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到。
[0020] 實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備 一、病毒總RNA的抽提 按Invi化Ogen公司TRIZOL LS Reagent RNA提取試劑盒使用說明書進(jìn)行。在1.5 ml eppendorf管中加入250 yL已分裝好的細(xì)胞繁殖所得的病毒液上清和750 yL TRIZ0L，充分 混勻，室溫放置10 min;加入200 yL的氯仿，劇烈搖動(dòng)15sec，室溫靜置5min，4°C，12000巧m 離屯、15 min;將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml eppendorf管中，加入500 yL異戊醇，充分混勻，室 溫放置10111111，41：，12000巧111離屯、10 111111;棄去上清液，沉淀用冰預(yù)冷的70%乙醇1000化， 輕輕混勻，洗涂一次，4°C ,12000 rpm離屯、10 min;棄去上清液，風(fēng)干；用20 yL DEPC處理的 =蒸水溶解RNA，-80°C保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄。
[0021] 二、引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中SVV-OOl (DQ641257)的3C區(qū)域基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物：上游引物Pl: 5'-ATCCTTTTGCTGCCCATGTG-3'，下游引物P2: 5'-AGAACTCTACCCAACGCCTC-3'，利用該引物 擴(kuò)增3C基因，反應(yīng)體系如下:PremixTaq 2扣L、上游引物Pl化L、下游引物P2化L、模板DNA 化L，最后用dd出0補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積為50化。
[0022] 擴(kuò)增程序?yàn)椋海?)94°C預(yù)變性5min，（2)94°C變性lmin，57°C退火30 s，72°C延伸30 S，共32個(gè)循環(huán)；（3)72°C延伸lOmin。
[0023] 回收PCR產(chǎn)物（參照Omega公司E.Z.N.A. ? Gel Extraction Kit的使用說明書）， 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定為正確的目標(biāo)片段，用于后續(xù)的克隆。
[0024] S、目的基因的克隆 (1)回收產(chǎn)物連接PMD19-T載體 參照pMD ? 19-T VectoH式劑盒說明書，連接反應(yīng)體系為:純化的PCR產(chǎn)物化L、pMD19-T vector 0.扣L、Solution I 2.扣レ最終連接反應(yīng)體系的總體積為化L。將上述反應(yīng)體系混 勻并稍作離屯、后，4°C連接過夜。
[00巧](2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 將（1)的連接產(chǎn)物化L輕輕地加到50化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min;42°C熱休 克90s然后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻2min;加到20化L LB液體培養(yǎng)基中，37°C，ieOrpm振搖培 養(yǎng)45min，使大腸桿菌復(fù)蘇，抗性基因表達(dá);將W上復(fù)蘇的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布AmpVLB固體 培養(yǎng)基平皿，37 °C培養(yǎng)過夜。
[00%] (3)重組子的PCR鑒定與篩選 從(2)過夜培養(yǎng)的平板中挑取S個(gè)單菌落，分別接種于ImL含有10化g/mL Amp+的LB液 體培養(yǎng)基中，37°C，220巧m振搖培養(yǎng)化W上(0D600值0.3~0.4);取菌液進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物 用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測；取20化鑒定陽性的菌液Wl: 100的比例接種到2mL Amp+的 LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，220巧m振搖培養(yǎng)過夜。
[0027] (4)重組質(zhì)粒的提取與鑒定 參照Omega公司E.Z.N.A. ? Plasmid Mini Kit I的說明書，對過夜培養(yǎng)菌液進(jìn)行質(zhì)粒 抽提，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒抽提效果。
[00%]將重組質(zhì)粒抽提產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定結(jié)果見圖1，經(jīng)鑒定陽性的重 組PMD19-T質(zhì)粒送北京奧科生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行核巧酸序列測定。
[0029] 實(shí)施例2引物與化qMan探針的設(shè)計(jì)與篩選 根據(jù)SW基因序列中的3C保守片段設(shè)計(jì)特異引物和化qMan探針，由華大公司合成，引物 和探針序列見表1，探針的5'端標(biāo)記的巧光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3'端標(biāo)記的澤滅基團(tuán)為TAMRA。
[0030]由表1中的引物和探針，對SW進(jìn)行PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn):其他3對引物有出現(xiàn)非特異性擴(kuò) 增或引物二聚體，不符合實(shí)驗(yàn)要求，因此只有引物1和引物2可W作為特異性擴(kuò)增檢測SVV的 引物。
[0031 ]實(shí)施例3巧光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 對引物濃度、探針濃度和退火溫度條件最優(yōu)化，Real-Time PCR 20化反應(yīng)體系為 Premix Ex 化9(?'〇66 qPCR)(2X)10 化，各特異性上、下游引物（10 yM)各0.4 化，ROX Reference Dye IK50X)0.2 化，巧光探針（10 yM)0.8 化，DNA模板2.0 yL，d地2〇 6.2 y L。最佳反應(yīng)條件為:95°C 30 s，95°C 5 s，60°C 34 s，40個(gè)循環(huán)。
[00創(chuàng)巧憶標(biāo)準(zhǔn)重組陽性質(zhì)粒的0D26日皿和0028日皿值及其比值，計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算成拷 貝數(shù)，W雙蒸水10倍系列稀釋成7個(gè)梯度（IO8~103copiesAiL)DW此為模板，建立20化反應(yīng) 體系，根據(jù)優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系，在ABI 7500型巧光定量PCR儀上擴(kuò)增，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 2。結(jié)果，擴(kuò)增曲線與Ct值之間的線性關(guān)系緊密，相關(guān)系數(shù)(R2)可達(dá)0.999。
[0033] 實(shí)施例4實(shí)時(shí)巧光定量PCR的靈敏性試驗(yàn) 8^陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量？03(1 X 10<^~1 X IO9CopiesAiL,共10個(gè)梯度，W確定它們的檢出下限。結(jié)果，WPMD19-T-3C標(biāo)準(zhǔn)品為模板，巧 光定量PCR的檢出下限為lXl〇2 copies/化(圖3)。
[0034] 實(shí)施例5實(shí)時(shí)巧光定量PCR的特異性試驗(yàn) W SVV、FMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PCV、PRV、陽 DV 和正常 PK-15 細(xì)胞的 cDNA 或 DNA 為模板，應(yīng) 用所建立的實(shí)施例3優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該 PCR擴(kuò)增只有SW呈陽性（圖4)。
[0035] 實(shí)施例6實(shí)時(shí)巧光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 將SVV的陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行IO9、IO7、I 〇5 cop i eSAiL共3個(gè)梯度為模板，進(jìn)行組內(nèi)和組 間重復(fù)性檢驗(yàn)，每個(gè)梯度都要重復(fù)5次，共做3次反應(yīng)。對SVV所建立起來的方法進(jìn)行PMD19- T-3C標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒重復(fù)性檢驗(yàn)。結(jié)果表2所示:組內(nèi)和組間的變異系數(shù)(CV)均小于0.96%。
[0036] 實(shí)施例7試劑盒的組成 按照下列組成配制用于檢測豬塞內(nèi)加谷病毒的試劑盒：1〇咖引物1、1〇測引物2、10 y M探針、ROX Reference Dye 11(50X )、Premix Ex !"agCProbe qPCR)(2X )。
[0037] 該試劑盒的一種反應(yīng)體系可W為:Premix Ex Taq(P;robe qPCR)(2X )10化、10 Ji M，0.4化引物l、10i^M，0.4化引物2、R0XReferenceDyeII(50X)0.2化、10i^M，0.如L探 針、DNA模板2.化L、d地2〇 6.化L，反應(yīng)總體積為20化。
[0038] 利用該試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR的反應(yīng)條件為:95°C 30秒，95°C 5秒，60°C 34秒，40個(gè)循環(huán)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物和探針，其特征在于，所述上游引物、 下游引物和探針的序列如SEQ ID NO: 1~3所不。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物和探針，其特征在于， 所述探針的5'端標(biāo)記的是熒光報(bào)告基團(tuán)；3'端標(biāo)記的是淬滅基團(tuán)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物和探針，其特征在于， 所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述淬滅基團(tuán)為TAMAR。4. 含有權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述塞內(nèi)加谷病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物和探針的試 劑盒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探針的濃度 為10 μΜ。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、熒光 染料、陽性標(biāo)準(zhǔn)品。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為PMD19-T-3C。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR的反應(yīng)體 系為：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)10yL、10 μΜ，0·4μL上游引物、10 μΜ，0·4μL下游引 物、ROX Reference Dye 11(50 X )0.2yL、10 μΜ，0·8μL探針、DNA模板2.OyUddH2O 6.2yL〇9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR的反應(yīng)條 件為:95°C 30秒，95°C 5秒，60°C 34秒，40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK105925728SQ201610379248
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】馬靜云, 趙曉亞, 陳桂華, 伍綺文
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)