金黃色葡萄球菌的pcr檢測(cè)引物、試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)引物、試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)組合利用金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc基因)、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因(clf A基因)和特異性序列(SmaI序列)，針對(duì)其設(shè)計(jì)特異性引物，開(kāi)發(fā)了金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)引物、試劑盒及檢測(cè)方法；達(dá)到了檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高的技術(shù)效果，并且檢測(cè)耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便，可大大提高檢測(cè)效率，適合快速檢測(cè)的要求，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)工作中。
【專利說(shuō)明】
金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)引物、試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)引物、試劑盒及 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類生活水平的提高，化妝品已逐漸成為人們生活必需品，化妝品中各種營(yíng) 養(yǎng)元素給微生物提供了良好的生存環(huán)境，一旦化妝品中污染微生物，勢(shì)必會(huì)危害人們的身 體健康，尤其是金黃色葡萄球菌的污染，金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬中對(duì)人類致病力最 強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥，其不僅可以感染呼吸道，毒 害消化道，還會(huì)鉆進(jìn)皮膚里誘發(fā)皮炎，因此，我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版）中將金黃色葡 萄球菌列為化妝品常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，要求不得檢出。
[0003] 在檢測(cè)手段上，目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)機(jī)構(gòu)仍主要采用傳統(tǒng)的方法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn) 行檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程一般需要3~5d，且操作煩瑣，已不能滿足微生物快速準(zhǔn)確檢測(cè)的現(xiàn)實(shí)需 要。因此，迫切需要建立新的快速檢測(cè)技術(shù)和方法。PCR技術(shù)以敏感、特異、簡(jiǎn)便和快速等優(yōu) 點(diǎn)被越來(lái)越多地應(yīng)用，而多重PCR方法以準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)廣受研究者關(guān)注。迄今，已有文獻(xiàn) 介紹采用多重PCR方法檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的污染。然而，這些方法大多側(cè)重于耐藥 性相關(guān)基因和毒素基因，并較少應(yīng)用于化妝品樣品的檢測(cè)。因此，建立適合于化妝品中特異 性強(qiáng)且靈敏度高的多重PCR檢測(cè)方法顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明利用金黃色葡萄球菌的特異性鑒別基因及序列，設(shè)計(jì)了其特異性引物，采 用多重PCR技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測(cè)。通過(guò)對(duì)PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化，開(kāi)發(fā)了針對(duì) 化妝品中金黃色葡萄球菌PCR檢測(cè)試劑盒;同時(shí)，結(jié)合前處理技術(shù)，建立了準(zhǔn)確、高效的檢測(cè) 方法。
[0005] 首先，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)引物，所述的PCR檢 測(cè)引物包括一個(gè)或兩個(gè)以上如下所示的引物對(duì)：
[0006] 耐熱核酸酶基因(nuc基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0007] nuc-F:5'-GGGATGGCTATCAGTAA-3'（如SEQ ID N0.1所示），
[0008] nuc-R:5'-TGAATCAGCGTTGTCTT-3'（如SEQ ID 從).2所示）；
[0009] 纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因 （clf A基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0010] clf A-F:5'-CAACTACGGAAGAAACGC-3'（如SEQ ID N0.3所示），
[0011] clf A-R:5'-CTACTGCCGCTAAACTAA-3'（如SEQ ID N0.4所示）；
[0012] 金黃色葡萄球菌特異性序列(SmaI序列)擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0013] SmaI-F:5'-GAAGCACATAAGATAGCGAGAC-3'（如SEQ ID 從).5所示），
[0014] SmaI-R:5'-ATCCAGCATCAGATACGAG-3'0nSEQIDNO.6m*)。
[0015] 其次，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)試劑盒，所述的PCR 檢測(cè)試劑盒包含所述的PCR檢測(cè)引物。
[0016] 所述的PCR檢測(cè)試劑盒還包括含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP和Taq DNA聚合酶。
[0017] 本發(fā)明還提供所述的PCR檢測(cè)引物或PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)金黃色葡萄球菌中的 應(yīng)用。
[0018] 進(jìn)一步的，所述的PCR檢測(cè)引物或PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)化妝品中金黃色葡萄球菌 中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供一種化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0020] a)取待檢測(cè)的化妝品樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌富集培養(yǎng)，然后提取細(xì)菌總DNA;
[0021] b)以步驟a)中提取的細(xì)菌總DNA為模板，利用所述的PCR檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0022] c)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分析化妝品樣品中是否存在金黃色葡萄球菌。
[0023]優(yōu)選，所述的步驟a)的富集培養(yǎng)是利用SCDLP增菌液進(jìn)行富集培養(yǎng)，所述的SCDLP 增菌液每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、葡萄糖2.5g、組氨酸5g、硫乙醇酸鈉 lg、卵 磷脂2g和吐溫-80 IOg，余量為蒸餾水，pH7.2~7.3。
[0024]優(yōu)選，所述的步驟b)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:濃度為IpgAiL~IOOngAiL的DNA模 板IyL、含Mg2+的10 X緩沖溶液IOmM、dNTP 0.2mM、Taq DNA聚合酶1.0 U、所述的PCR檢測(cè)引物 中的引物對(duì)的上下游引物各〇 . 5μΜ，加 CldH2O至總體積為25yL;所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件 為:95°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 5〇8、48°(：退火4〇8、72°(：延伸11^113〇8，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°(：延 伸lOmin。
[0025] 本發(fā)明所建立的針對(duì)化妝品中金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)引物和PCR檢測(cè)試 劑盒及檢測(cè)方法通過(guò)組合金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc基因）、纖維蛋白原結(jié)合蛋 白基因 （clf A基因）和金黃色葡萄球菌特異性序列（SmaI序列）作為目標(biāo)基因或序列，具有 檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、沒(méi)有引物二聚體形成等優(yōu)勢(shì)，三對(duì)引物擴(kuò)增金黃色葡萄球菌DNA 的靈敏度均為1.35pg/yL。
[0026] 本發(fā)明提供的針對(duì)化妝品中金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)方法還具備檢測(cè)操作 簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、設(shè)備要求低等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比可大大節(jié)省檢測(cè)成本和時(shí)間，提高 檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性，具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用前景，同時(shí)本發(fā)明的檢測(cè)方法中在SCDLP增菌液 的配方中加入了組氨酸、巰基乙醇酸鈉，能更有效的中和化妝品中的防腐劑，縮短增菌時(shí) 間。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1是金黃色葡萄球菌單重PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1-3是采用nuc 基因擴(kuò)增用引物對(duì)分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC6538P和金黃色 葡萄球菌CMCC26003的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，4-6是采用SmaI序列擴(kuò)增用引物對(duì)分別對(duì)金 黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC6538P和金黃色葡萄球菌CMCC26003的總DNA 進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，7-9是采用clf A基因擴(kuò)增用引物對(duì)分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC6538、金 黃色葡萄球菌ATCC6538P和金黃色葡萄球菌CMCC26003的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。
[0028]圖2是nuc基因擴(kuò)增用引物對(duì)PCR擴(kuò)增污染菌株結(jié)果，其中，M代表DNA marker，l代 表大腸桿菌Escherichia coli，2代表銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，3代表沃氏 葡萄球菌Staphylococcus warneri，4代表腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophytics，5 代表弗氏朽1檬酸桿菌Citrobacter freundii，6代表惡臭假單胞菌Pseudomonas putida，7 代表肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，8代表粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens。
[0029] 圖3是SmaI序列擴(kuò)增用引物對(duì)PCR擴(kuò)增污染菌株結(jié)果，其中M代表DNA marker，1-8 代表的污染菌株樣品同圖2。
[0030] 圖4是clf A基因擴(kuò)增用引物對(duì)PCR擴(kuò)增污染菌株結(jié)果，其中M代表DNA marker，1-8 代表的污染菌株樣品同圖2。
[0031] 圖5是nuc基因擴(kuò)增用引物對(duì)靈敏度擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1-7依次分 別代表濃度為 134 · 82ng/yL、13 · 48ng/yL、1 · 35ng/yL、134 · 82pg/yL、13 · 48pg/yL、1 · 35pg/yL 和0.13pg/yL的DNA模板，8代表陽(yáng)性對(duì)照，9代表陰性對(duì)照。
[0032]圖6是clf A基因擴(kuò)增用引物對(duì)靈敏度擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1-9代表 的擴(kuò)增樣品同圖5。
[0033]圖7是SmaI序列擴(kuò)增用引物對(duì)靈敏度擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1-9代表 的擴(kuò)增樣品同圖5。
[0034]圖8是金黃色葡萄球菌多重PCR靈敏度擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1-9代表 的擴(kuò)增樣品同圖5。
[0035]圖9是實(shí)施例2檢測(cè)的化妝品中金黃色葡萄球菌多重PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M代表DNA marker，1代表保濕乳，2代表化妝水，3代表面霜，4代表潔面膏，5代表爽膚水，6代表粉底液， 7代表陽(yáng)性對(duì)照，8代表陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0037] 實(shí)施例1:用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的多重PCR引物的篩選和確定
[0038] 1、引物設(shè)計(jì)
[0039] 通過(guò)查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)篩選用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的候選檢測(cè)目標(biāo)基因或序 列，然后對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，經(jīng)過(guò)分析，本研究選擇了耐熱核酸酶基因 (nuc基因）、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因 （clf A基因）和特異性序列(SmaI序列)作為特異性檢 測(cè)目標(biāo)序列。
[0040] 分別對(duì)上述的檢測(cè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出了特異性高的3 對(duì)引物如下：
[0041] 耐熱核酸酶基因(nuc基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0042] nuc-F:5，-GGGATGGCTATCAGTAA-3,（如SEQ ID N0.1所示），
[0043] nuc-R:5，-TGAATCAGCGTTGTCTT-3,（如SEQ ID 從).2所示）；
[0044] 纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因 （clf A基因）擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0045] clf A-F:5'-CAACTACGGAAGAAACGC-3'（如SEQ ID N0.3所示），
[0046] clf A-R:5，-CTACTGCCGCTAAACTAA-3,（如SEQ ID N0.4所示）；
[0047] 金黃色葡萄球菌特異性序列(SmaI序列)擴(kuò)增用引物對(duì)：
[0048] SmaI-F:5，-GAAGCACATAAGATAGCGAGAC-3,（如SEQ ID 從).5所示），
[0049] SmaI-R:5'-ATCCAGCATCAGATACGAG-3'0nSEQIDNO.6m*)。
[0050] 2、單重PCR特異性實(shí)驗(yàn)
[0051]分別采用合成好的金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc基因）擴(kuò)增用引物對(duì)、特 異性序列(SmaI序列)擴(kuò)增用引物對(duì)和纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因 （clf A基因）擴(kuò)增用引物對(duì) 分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC6538P和金黃色葡萄球菌CMCC26003 的總DNA進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，用nuc基因擴(kuò)增用引物對(duì)分別擴(kuò)增上述3種金黃色葡 萄球菌總DNA均得到618bp的特異性片段，用SmaI序列擴(kuò)增用引物對(duì)分別擴(kuò)增上述3種金黃 色葡萄球菌總DNA均得到822bp的特異性片段，用clf A基因擴(kuò)增用引物對(duì)分別擴(kuò)增上述3種 金黃色葡萄球菌總DNA均得到348bp的特異性片段，結(jié)果擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致（圖1 )，分 別用上述三對(duì)引物擴(kuò)增從污染化妝品中分離出的8株污染菌株(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、 沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌、惡臭假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷 氏菌)的細(xì)菌總DNA，結(jié)果均未擴(kuò)增出條帶（圖2-4)，說(shuō)明上述三對(duì)引物對(duì)金黃色葡萄球菌有 良好的檢測(cè)特異性和準(zhǔn)確性。
[0052] 3、單重和多重PCR檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0053]以不同濃度的金黃色葡萄球菌ATCC6538DNA模板對(duì)上述三對(duì)引物的單重和多重 PCR檢測(cè)靈敏度進(jìn)行測(cè)試，其中金黃色葡萄球菌ATCC6538DNA模板濃度分別為134.82ngAiL、 13 · 48ng/yL、1 · 35ng/yL、134 · 82pg/yL、13 · 48pg/yL、1 · 35pg/yL和 0 · 13pg/yL，結(jié)果采用耐熱 核酸酶基因 (nuc基因）、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因 （clf A基因）和特異性序列(SmaI序列)擴(kuò) 增用引物對(duì)擴(kuò)增的靈敏度均為1.35pgAxL(圖5-7)，采用上述三對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增上述不同濃 度金黃色葡萄球菌ATCC6538DNA模板，多重PCR檢測(cè)靈敏度也為1.35pg/yL(圖8)。
[0054]實(shí)施例2:化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)
[0055]某公司送檢的六個(gè)不同類型化妝品樣品，分別為保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽 膚水和粉底液，采用《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007版）中微生物檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)微 生物污染，進(jìn)行人工隨機(jī)致病菌污染，保濕乳中加入金黃色葡萄球菌ATCC 6538，化妝水中 加入金黃色葡萄球菌ATCC 6538和大腸桿菌ATCC 8039,面霜中加入金黃色葡萄球菌 ATCC6538和銅綠假單胞菌ATCC 9027,潔面膏中加入大腸桿菌ATCC 8039,爽膚水中加入銅 綠假單胞菌ATCC 9027,粉底液中加入大腸桿菌ATCC 8039和銅綠假單胞菌ATCC 9027,控制 加入上述致病菌污染后各樣品的菌懸液的終濃度為102cfu/mL，由此制備得到各化妝品的 人工污染樣品。
[0056] 進(jìn)行樣品前處理：
[0057] (1)分別取IOg化妝品的人工污染樣品，加入90mL S⑶LP增菌液中，充分混勻；陰性 對(duì)照為IOOmL S⑶LP增菌液，陽(yáng)性對(duì)照為加入了金黃色葡萄球菌ATCC6538的IOOmL S⑶LP增 菌液(終濃度為102cfu/mL)，各組置于37°C振蕩培養(yǎng)箱中150rpm培養(yǎng)6h;
[0058] 所述的SCDLP增菌液的配方為：每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、葡萄糖 2.5g、組氨酸5g、硫乙醇酸鈉 lg、卵磷脂2g和吐溫-80 10g，余量為蒸餾水，將各組分混合均 勻，調(diào)ρΗ7·2~7.3，121°C高壓滅菌20min。
[0059] (2)基因組DNA提取:取上述振蕩培養(yǎng)后的增菌液各10ml，離心收集菌體，用生理鹽 水洗滌3次，采用Magen細(xì)菌DNA提取試劑盒提取六個(gè)化妝品的人工污染樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng) 性對(duì)照中的細(xì)菌基因組DNA，采用BioSpec-nano超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，于-20°C保存 備用。
[0060] 采用本發(fā)明的多重PCR引物對(duì)化妝品的人工污染樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照中金 黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)優(yōu)化后的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:濃度為lpg/yL~100ng/yL 的DNA模板IyL，10 X緩沖溶液(含Mg2+) IOmM，dNTP 0.2mM，Taq DNA聚合酶1.0 U，本發(fā)明中的 三組引物對(duì)各0.5μΜ，加 CldH2O至總體積為25yL;反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min; 94°C變性 5〇8、48°(：退火4〇8、72°(：延伸1111丨113〇8，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇11^11。
[00611 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果：
[0062] 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5yL用1 %瓊脂糖凝膠（含染色劑Gold view)在120v電壓下電泳 30min，然后置于Bio-Red凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果（圖9)。
[0063]結(jié)果表明，污染有金黃色葡萄球菌的化妝品樣品（保濕乳、化妝水、面霜)均能檢出 各基因相應(yīng)條帶，而沒(méi)有加入金黃色葡萄球菌的化妝品樣品（潔面膏、爽膚水和粉底液)未 出現(xiàn)條帶，說(shuō)明本發(fā)明的金黃色葡萄球菌多重PCR檢測(cè)引物能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出污染化妝品 中的金黃色葡萄球菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)引物，其特征在于，所述的PCR檢測(cè)引物包 括一個(gè)或兩個(gè)以上如下所示的引物對(duì)： nuc基因擴(kuò)增用引物對(duì)： nuc-F:5 '-GGGATGGCTATCAGTAA-3 '， nuc-R:5，-TGAATCAGCGTTGTCTT-3，； elf A基因擴(kuò)增用引物對(duì)： elf A-F:5 '-CAACTACGGAAGAAACGC-3 '， elf A-R:5 '-CTACTGCCGCTAAACTAA-3 '； Smal序列擴(kuò)增用引物對(duì)： Smal-F:5，-GAAGCACATAAGATAGCGAGAC-3，， Smal-R:5 '-ATCCAGCATCAGATACGAG-3 '。2. -種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的PCR檢測(cè)試劑 盒包含權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的PCR檢測(cè)試劑盒還包括含 Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP和Taq DNA聚合酶。4. 權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)引物或權(quán)利要求2或3所述的PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)金黃色 葡萄球菌中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，是在檢測(cè)化妝品中金黃色葡萄球菌中的應(yīng) 用。6. -種化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： a) 取待檢測(cè)的化妝品樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌富集培養(yǎng)，然后提取細(xì)菌總DNA; b) 以步驟a)中提取的細(xì)菌總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； c) 檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分析化妝品樣品中是否存在金黃色葡萄球菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟a)的富集培養(yǎng)是利用 S⑶LP增菌液進(jìn)行富集培養(yǎng)，所述的SCDLP增菌液每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、 葡萄糖2.5g、組氨酸5g、硫乙醇酸鈉 lg、卵磷脂2g和吐溫-80 10g，余量為蒸餾水，pH7.2~ 7.3。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟b)的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系 為：濃度為lpg/VL~lOOng/yL的DNA模板lyL、含Mg 2+的 10X 緩沖溶液 10mM、dNTP 0.2mM、Taq DNA聚合酶1.0U、所述的PCR檢測(cè)引物中的引物對(duì)的上下游引物各0.5μΜ，加 ddH20至總體積 為25yL;所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min;94°C變性5〇8、48°(：退火4〇8、72 1€ 延伸lmin30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
【文檔編號(hào)】C12Q1/14GK106086218SQ201610688165
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月18日 公開(kāi)號(hào)201610688165.1, CN 106086218 A, CN 106086218A, CN 201610688165, CN-A-106086218, CN106086218 A, CN106086218A, CN201610688165, CN201610688165.1
【發(fā)明人】文霞, 楊秀茳, 謝小保, 孫廷麗, 李彩玲
【申請(qǐng)人】廣東省微生物研究所