GmEF1?α2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種GmEF1?α2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用。本發(fā)明采用GmEF1?α2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測表明，其在秦艽根受到銀離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨的處理下可作為分析基因表達(dá)時(shí)穩(wěn)定的內(nèi)參使用，為研究秦艽的功能基因以及次生代謝產(chǎn)物——龍膽苦苷代謝途徑的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及GmEFl-a2基因片段作為中藥秦艽根在 不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用。 GmEFI-α2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定 表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥秦艽是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、和血舒筋、利尿等 功效。隨著社會(huì)發(fā)展，市場需求的逐年增大，以及亂采亂挖等原因，致使野生的秦艽資源遭 到極大破壞。自1987年起，秦艽就被我國列為三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生藥材。秦艽的有效成分主要 是以龍膽苦苷（gentiopicroside)為代表的裂環(huán)環(huán)稀醚砲苷類（Secoiridiod glycosides)，還包括猜牙菜苦苷（swertiamarin)、猜牙菜苷（sweroside)等。這些次生代謝 產(chǎn)物有著廣泛的生物藥理性活性，例如健胃、利膽、抗炎、抗真菌、抗組胺等。植物常常會(huì)對 誘導(dǎo)子處理產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)，對中藥秦艽而言，可體現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物的含量升高或 降低，了解誘導(dǎo)子處理后代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，可為生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中優(yōu)化龍膽苦苷 等裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類的代謝途徑，產(chǎn)生更多有效的次生代謝產(chǎn)物提供思路。目前秦艽轉(zhuǎn)錄 組數(shù)據(jù)庫的建立，為挖掘該種中藥材的基因研究提供了大量的數(shù)據(jù)資源。
[0003] 研究基因的表達(dá)有多種方法，而熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)因?yàn)槠淇焖俸涂煽康?定量分析基因表達(dá)研究而被廣泛應(yīng)用。但是，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的準(zhǔn)確性很大程度上依 賴于篩選適合的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。所謂內(nèi)參基因 (Endogenous references gene)即內(nèi)部參照，主要作為檢測目的基因在特定條件下表達(dá)水 平變化的參照物，相當(dāng)于衡量基因表達(dá)的一個(gè)"標(biāo)尺"。常用的內(nèi)參基因應(yīng)該在生物體各類 細(xì)胞中均有表達(dá)，它們是在維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)中時(shí)刻表達(dá)的基因，自身表達(dá)相對穩(wěn)定， 不會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)材料不同而有較大差異，這樣作為一個(gè)"標(biāo)尺"才可靠。然而越來越多的實(shí)驗(yàn) 研究發(fā)現(xiàn)，一些常用的內(nèi)參基因并不是在所有的情況下均穩(wěn)定表達(dá)，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下， 內(nèi)參基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。因此，在選擇使用某一個(gè)內(nèi)參基因時(shí)，應(yīng)首先驗(yàn)證其在特定的 條件下是否能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn) 定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用，所述GmEFl-a2基因片段的核苷酸序列為 ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAG CGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCAT GAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTCo
[0005] 采用上述GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi) 參基因時(shí)，使用的特異性引物為：
[0006] GmEFl-a2-F:5' -ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和
[0007] GmEFl-a2-R：5/ -GACAGGAGCATAGCCATTG-37 〇
[0008] 上述GmEFl_a2基因片段由下述方法克隆得到：
[0009] (1)從秦艽中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成CDNA;
[0010] (2)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中GmEFl-a2基因的核苷酸序列：
[0011] TTCTGATAAGCCCTTGCGTCTTCCACTCCAGGATGTCTACAAGATTGGTGGTATCGGTACTGTCCCAGT GGGTAGAGTCGAGACAGGTGTTCTAAAGCCCGGTATGGTAGTCACCTTTGCCCCAAGTGGACTAACGACTGAAGTGA AGTCCGTAGAGATGCATCACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGGCTTCAACGTGAAAAACGTT GCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCAAAGAAGCTGCAAATTTCAC ATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAAATCAGCAATGGCTATGCTCCTGTCCTGGACTGTCACACGTGCC ATATCGCCGTCAAGTTTGCTGAGCTAGTGACAAAGATCGATAGACGATCTGGGAAAGAACTCGAGAAGGAACCAAAG TTCTTAAAGAACGGTGATGCCGGCATCGTGAAGATGATTCCTACTAAACCAATGGTTGTTGAGACCTTCTCTGAGTA CCCACCCCTTGGAAGATTCGCCGTCAGGGACATGCGGCAGACCGTTGCTGTCGGCGTCATCAAGAGCGTTGAGAAGA AGGATCCATCTGGAGCTAAGTTGACCAAGTCTGCAGTTAAAAAAGTTGGGAAGTGATTGGCACTATCATTTAGTTGT TATTGCATTGTGTACAGGTTATAGTTTTAGTTCCCAGAATATTGGGTCTTAGGCTTAGACCTGTATTGTTTTGTGTC CTTCCTTTTCATTTTTCGCATTTTAGTATTCAGGTTCATCAGCATGTTTCCTTTGGGATCATTTTTAAATAAATAAA CTTTCATTTTATCGTTATAATGTC
[0012] 設(shè)計(jì)合成特異性引物：
[0013] GmEFl-a2-F:5' -ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和
[0014] GmEFl-a2-R：5/ -GACAGGAGCATAGCCATTG-37 ；
[0015] (3)以CDNA為模板，利用步驟(2)中的特異性引物，PCR擴(kuò)增GmEFl-a2基因片段，所 述 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:98°(：1〇8、571€38、72°(：1111丨11，30個(gè)循環(huán)，72°(：延長1〇11^11 ;
[0016] (4)電泳檢測步驟(3)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收并純化目的片段，進(jìn)行測序；
[0017] (5)測序所得的序列分別通過NCBI上BLAST比對和BioEdit本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中分 析比較，進(jìn)而確定所得核苷酸序列為上述GmEFl-a2基因片段。
[0018] 本發(fā)明采用GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因， 以熒光定量PCR技術(shù)，通過絕對定量和相對定量分析方法檢測目的基因 GmSLS在秦艽根受銀 離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨處理后，兩種分析方法所體現(xiàn)的 表達(dá)結(jié)果趨勢一致，表明GmEFl-a2基因片段可以作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi) 參基因，為研究秦艽功能基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1是GmEFl_a2基因片段的溶解曲線。
[0020] 圖2是GmSLS基因片段的溶解曲線。
[0021 ]圖3是Ct隨GmSLS基因片段濃度對數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022]圖4是以GmEFl-a2基因片段為內(nèi)參基因分析GmSLS基因片段在秦艽根受到不同誘 導(dǎo)子處理后的相對表達(dá)量柱狀圖。
[0023]圖5是GmSLS基因片段在秦艽根受到不同誘導(dǎo)子處理后的絕對表達(dá)量柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于 這些實(shí)施例。
[0025] 實(shí)施例1
[0026]以GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，GmSLS基 因片段(核苷酸序列為:CACATTCACCATACCATCCAGAAATATGGGAATAAATCAITTACATGGATGGGAAGG ATTCCAAGGGTGAACATTTTAGAGCCAGAACTAGTTAAAGAAATGTTGTTTAACCATGGCAAATTCCAAAAGAATTT TGAGCTCCACAACCCACTTGTTATGCTATTGCTCTCTGGTATTGGAAGT)作為目標(biāo)檢測基因，具體檢測方 法如下：
[0027] 1、提取秦艽總RNA
[0028]分別以銀離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨為誘導(dǎo)子噴施 處理新鮮秦艽，然后將處理后的秦艽根分別放入1.5mL離心管中，用液氮速凍后置于提前去 除RNA酶的研缽中，并在研缽中加入足量的液氮，將樣本研成粉末;采用百泰克生物公司多 糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒并按照說明書提取樣本的總RNA。
[0029] 2、合成秦艽cDNA
[0030] 所得總RNA經(jīng)電泳檢測、測OD值，選質(zhì)量好的總RNA為模板，按照TaKaRa Prime ScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，將合成的cDNA稀釋5倍， 于-20 °C凍存，待用。
[0031] 3、合成內(nèi)參基因的特異性引物
[0032] 上游引物GmEF卜a2-F: 5' -ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和
[0033]
[0034]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0035] 4、合成目標(biāo)檢測基因的特異性引物
[0036] 上游引物GmSLS-F: 5' -CACATTCACCATACCATCC-3';和
[0037] 下游引物GmSLS-R: 5' -ACTTCCAATACCAGAGAGC-3';
[0038]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0039] 5、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0040]以誘導(dǎo)子處理下的秦艽根cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR均采用以下25yL反應(yīng) 體系：超純水 17yL、10XEX Taq PCR buffer 2.5yL、dNTPs 2yL(2.5mM)、上游引物0.25yL(5 4]\〇、下游引物0.25以以5以]\〇』1了39〇.5以1^、〇0嫩2.5以匕？0財(cái)廣增反應(yīng)條件為:98°(：變性1〇8、 57 °C退火30s、72 °C延伸Imin，30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸IOmin。用OMEGA膠回收試劑盒純化所得 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段，進(jìn)行測序，測序所得的序列分別通過在NCBI的BLAST比對和 BioEdit的本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中分析比較，進(jìn)而確定所得核苷酸序列為上述GmEFl-a2基因 片段和GmSLS基因片段。
[0041] 6、熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0042] 以不同誘導(dǎo)子處理下秦艽根的cDNA為模板，使用RocheLightCyder? 96系統(tǒng)，根據(jù) Takera公司的SYBR?P：remixExTaqTMΠ 試劑盒說明書，反應(yīng)體系為20μL，其中2X SuperReal PreMix Plus SYBR Premix Ex Taq II(2X)(Tli RNaseH Plus)10yL，上、下游 引物各0.8μLΧ?0μπιο1/υ，cDNA 2yL( 10ng/yL)，用超純水定容至20yL。熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò) 增采用兩步法，即在95°C預(yù)變性30s后，運(yùn)行40個(gè)循環(huán) ：95°C10s、60°C30S，再運(yùn)行溶解曲線 (95°Clmin，60°Clmin，60°C-95°C，每30s升高0.5°C收集一次熒光。），得到GmEFl-a2基因片 段和GmSLS基因片段的溶解曲線及閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。由圖1~2可見，溶解曲線為單一峰，說 明GmEFl-a2基因片段和GmSLS基因片段的上、下游引物均具有特異性。
[0043] 7、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0044] 將步驟5所得GmSLS基因片段進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成5個(gè)濃度梯度，然后分別作 為模板，采用GmSLS基因片段的上、下游引物按照步驟6的方法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反 應(yīng)，得到Ct隨GmSLS基因片段濃度的對數(shù)為變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程 為y = -3.8760X+39.8(相關(guān)系數(shù)R2 = 1.00)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(slope)即可得到GmSLS基 因片段的擴(kuò)增效率E= (10(_1/sl°pe)-1) X 100% = 81 %，說明引物的擴(kuò)增效率高。
[0045] 8、GmSLS基因的相對表達(dá)量
[0046] 根據(jù)公式:相對表達(dá)量= 2^ΛΛα，其中Δ ACt=(待測組目的基因 Ct值-待測組內(nèi)參 基因 Ct值)-(對照組目的基因 Ct值-對照組內(nèi)參基因 Ct值），計(jì)算GmSLS基因片段的相對表達(dá) 量。結(jié)果見圖4。
[0047] 9、GmSLS基因的絕對表達(dá)量
[0048]根據(jù)步驟7得到的Ct隨GmSLS基因片段濃度的對數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過熒光實(shí)時(shí) 定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得秦艽根受到不同誘導(dǎo)子處理后GmSLS基因片段的Ct，以步驟7中標(biāo)準(zhǔn) 曲線的擬合方程y = -3.8760X+39.8，計(jì)算GmSLS基因片段在秦艽根受誘導(dǎo)子處理后準(zhǔn)確的 基因拷貝數(shù)，即GmSLS基因的絕對表達(dá)量，結(jié)果見圖5。
[0049] 對比圖4和圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，在引入GmEFl-a2作為內(nèi)參基因，GmSLS基因的絕對 定量結(jié)果和相對定量結(jié)果表現(xiàn)趨勢基本一致，說明本發(fā)明GmEFl_a2基因片段可以作為秦艽 根在受到不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下引入的內(nèi)參基因。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng) 用，所述 GmEFl-a2 基因片段的核苷酸序列為 ACGAGGCTCTACAGGAGGCACTTCCTGGTGACAATGTCGG CTTCAACGTGAAAAACGTTGCAGTTAAGGATCTAAAGCGTGGTTATGTAGCATCTAACTCAAAAGACGACCCTGCCA AAGAAGCTGCAAATTTCACATCTCAGGTGATCATCATGAACCATCCAGGTCAMTCAGCMTGGCTATGCTCCTGTC。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定 表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用，其特征在于:所述GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處 理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的特異性引物為： GmEFl-a2-F:5'-ACGAGGCTCTACAGGAGG-3';和 GmEFl-c^U' -GACAGGAGCATAGCCATTG-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的GmEFl-a2基因片段作為秦艽根在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下 穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用，其特征在于:所述的誘導(dǎo)子包括銀離子、銅離子、水楊酸、花生 四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨的任意一種。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086219SQ201610702010
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月22日
【發(fā)明人】王喆之, 何懿菡, 宋雙紅, 李燾
【申請人】陜西師范大學(xué)