專利名稱：一種新的水稻內(nèi)參蛋白質(zhì)及其單克隆抗體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適合水稻免疫印記(Western blotting) 研究的內(nèi)參抗體。
背景技術(shù)：
看家基因是指在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的必需基因，這些基因大多負(fù)責(zé)基礎(chǔ)代謝過(guò)程，它們往往呈組成型表達(dá)，所以在進(jìn)行表達(dá)量的相對(duì)比較時(shí)被作為內(nèi)參基因。在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，為了對(duì)不同樣本進(jìn)行比較，需要選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行樣品和實(shí)驗(yàn)過(guò)程的校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以便得到可靠的試驗(yàn)結(jié)果，所以內(nèi)參基因的選擇和使用具有重要意義。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種實(shí)驗(yàn)條件下、在各種類型的組織或細(xì)胞中恒定表達(dá)。然而，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)參基因的恒定表達(dá)都是“有范圍”的，在超出范圍的實(shí)驗(yàn)條件下可能是不適合作為內(nèi)參的，內(nèi)參基因使用不當(dāng)，可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，甚至可能引致錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論，所以對(duì)內(nèi)參基因的進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)，確定合適的使用范圍是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題。在動(dòng)物轉(zhuǎn)錄水平研究中適合不同物種的內(nèi)參基因被篩選出來(lái)人；鼠；牛；狗；馬； 海豚。在植物的RT-PCR分析中，適合不同物種的內(nèi)參基因也被篩選出來(lái)擬南芥、小麥、大麥、大豆、番茄、馬鈴薯、白楊、葡萄、桃子、咖啡、甘蔗。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境反應(yīng)等基礎(chǔ)研究的模式植物。水稻基因組測(cè)序工作的成果極大地推動(dòng)了水稻相關(guān)研究的進(jìn)展，帶動(dòng)了水稻轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，利用水稻全基因組基因芯片調(diào)查了水稻在雜種優(yōu)勢(shì)、逆境、發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)譜，對(duì)特定目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄研究也經(jīng)常使用RT-PCR技術(shù)，在RT-PCR 中，篩選并提出了適合水稻的內(nèi)參基因UBQ5和eEF-la。水稻基因組學(xué)的成果也推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，利用2DE-MASS技術(shù)對(duì)水稻發(fā)育、逆境、愈傷組織分化等進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒別了一系列的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，同時(shí)，隨著水稻功能基因組學(xué)工作的開展，對(duì)水稻蛋白質(zhì)功能的驗(yàn)證和比較研究也日益增加，免疫印跡技術(shù)因其具有靈敏度高、特異性好、 操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)在不同組織中表達(dá)量的重要手段。顯然，在免疫印跡技術(shù)中需要使用內(nèi)參來(lái)標(biāo)定上樣量從而消除實(shí)驗(yàn)誤差。然而有關(guān)醫(yī)學(xué)和動(dòng)物蛋白水平的定量研究中對(duì)內(nèi)參蛋白質(zhì)的研究表明，實(shí)際上常用的內(nèi)參如Actin，GAPDH， Tubulin在蛋白水平的表達(dá)并不穩(wěn)定，這就不可避免的影響對(duì)特定蛋白質(zhì)功能研究的精確性，因此有必要篩選出適合水稻蛋白水平研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)。然而在水稻中并沒(méi)有系統(tǒng)的內(nèi)參蛋白質(zhì)篩選和鑒定工作的相關(guān)報(bào)道。為此，本發(fā)明人制備了 9個(gè)水稻候選內(nèi)參蛋白質(zhì)的抗體，比較了相應(yīng)蛋白質(zhì)在水稻不同發(fā)育時(shí)期/部位的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熱激90蛋白質(zhì)(Heat shock 90 protein)在參試條件下表現(xiàn)穩(wěn)定性優(yōu)于Actin、GAPDH和Tubulin等，更適合于作為水稻蛋白質(zhì)研究的內(nèi)參，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在白葉枯病抗性反應(yīng)中和晝夜生長(zhǎng)過(guò)程中也沒(méi)有發(fā)生變化，證明了熱激90蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上調(diào)查了熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中的百分含量以及其檢測(cè)的靈敏度，所制備的抗體可供水稻蛋白質(zhì)相關(guān)定性定量研究采用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合水稻免疫印跡研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)及其相應(yīng)的抗體。本發(fā)明的第一個(gè)目的是篩選出一種適合水稻免疫印跡研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)。本發(fā)明選取9個(gè)水稻候選內(nèi)參基因，分別利用原核表達(dá)的蛋白質(zhì)或合成的抗原片段制備了抗體， 用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了相應(yīng)蛋白質(zhì)在水稻10個(gè)時(shí)期/部位的表達(dá)，用geNorm和Microcal Origin軟件對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)穩(wěn)定度進(jìn)行分析，結(jié)果證明，熱激90蛋白質(zhì)在水稻不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的材料中表達(dá)穩(wěn)定，熱激90蛋白質(zhì)在參試條件下表現(xiàn)穩(wěn)定性優(yōu)于ActiruGAPDH 和Tubulin等，更適合作為水稻蛋白質(zhì)研究的內(nèi)參，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)熱激90蛋白質(zhì)在水稻接白葉枯病菌不同時(shí)間和水稻晝夜不同時(shí)間的材料中同樣穩(wěn)定表達(dá)，且水稻熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中的百分含量較高以及其在作為內(nèi)參蛋白時(shí)的檢測(cè)靈敏度高。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能夠分泌抗熱激90蛋白質(zhì)的鼠源單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系(雜交瘤細(xì)胞株為Rice90-31，保藏號(hào)為CGMCC NO. 3986，保藏日期為2010年 07月08號(hào)。保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)。以原核表達(dá)的重組蛋白質(zhì)熱激90 蛋白質(zhì)為免疫原免疫Babl/C小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0融合，得到的雜交瘤細(xì)胞系，經(jīng)鑒定 Rice90-31細(xì)胞株分泌的單克隆抗體特異性，敏感性強(qiáng)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供該單克隆抗體作為在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)其內(nèi)參熱激90蛋白質(zhì)的使用方法。為了驗(yàn)證抗體的特異性和結(jié)合強(qiáng)度，用抗體對(duì)重組抗原進(jìn)行了免疫印跡檢測(cè)；用Rice90-31抗體檢測(cè)梯度稀釋的重組蛋白，以重組蛋白質(zhì)量為自變量，以圖像信號(hào)強(qiáng)度值為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算抗原抗體反應(yīng)的線性范圍；在其線性范圍內(nèi)把梯度稀釋的熱激90重組蛋白和水稻總蛋白一起進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，進(jìn)一步繪制了更精確的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中所占的百分含量；用熱激 90蛋白質(zhì)抗體(Rice90-31)檢測(cè)梯度稀釋的水稻蛋白，計(jì)算出熱激90蛋白質(zhì)抗體在水稻蛋白中的最低下限。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)路線為選取9個(gè)水稻候選內(nèi)參基因，預(yù)測(cè)抗原決定簇，通過(guò)合成多肽或細(xì)菌體外表達(dá)制備抗原，免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞系，進(jìn)而制備單克隆抗體，用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)內(nèi)參基因在水稻10個(gè)時(shí)期/部位的表達(dá)，利用geNorm和Microcal Origin 6. 0軟件對(duì)看家蛋白質(zhì)的表達(dá)穩(wěn)定度進(jìn)行排序，鑒定出熱激90蛋白質(zhì)適合作為水稻蛋白質(zhì)研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)；進(jìn)一步在水稻白葉枯病抗性反應(yīng)和一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的水稻材料中對(duì)熱激90蛋白質(zhì)的穩(wěn)定程度進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)繪制抗原抗體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算熱激90蛋白質(zhì)占水稻總蛋白的百分含量及在水稻蛋白中的檢測(cè)下限。實(shí)驗(yàn)證明，利用體外表達(dá)的片段蛋白質(zhì)作免疫原得到的鼠源單克隆抗體 Rice90-31(雜交瘤細(xì)胞株名稱Rice90_31，保藏號(hào)為CGMCC NO. 3986)能夠特異的識(shí)別重組抗原和水稻蛋白，在實(shí)驗(yàn)中的使用效價(jià)是1 10000-1 20000 ；用Rice90-31抗體檢測(cè)梯度稀釋的重組蛋白，以重組蛋白質(zhì)量為自變量，以圖像信號(hào)強(qiáng)度值為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，熱激90抗原蛋白質(zhì)量在0. 41-8. 2ng范圍內(nèi)時(shí)與圖像信號(hào)強(qiáng)度呈線性關(guān)系；在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)將一系列梯度稀釋的重組蛋白和水稻總蛋白一起進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，進(jìn)一步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中的百分含量大約是0. 12%;用Rice90-31抗體檢測(cè)梯度稀釋的水稻蛋白，發(fā)現(xiàn)Rice90-31抗體在水稻蛋白中的最低下限大約是0. Mng。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及其有益效果本發(fā)明提供的水稻熱激90蛋白質(zhì)在水稻不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的材料中表達(dá)穩(wěn)定，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)熱激90蛋白質(zhì)在水稻接白葉枯病菌不同時(shí)間的材料和水稻晝夜不同時(shí)間的材料中同樣穩(wěn)定表達(dá)，該水稻內(nèi)參蛋白質(zhì)可以是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)根據(jù)序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸序列預(yù)測(cè)出的相應(yīng)抗原片段序列SEQ ID NO 2 ；上述適合水稻免疫印跡研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)熱激90的編碼基因，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，其核苷酸序SEQ ID NO 3的核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID NO :1序列中任意連續(xù)14個(gè)氨基酸的相似性大于80%的多肽片段；本發(fā)明獲得的雜交瘤Rice90-31(細(xì)胞株名稱Rice90_31，保藏號(hào)為CGMCC NO. 3986)分泌產(chǎn)生的單克隆抗體Rice90-31，不僅與重組的熱激90蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的特異性和敏感性，而且與水稻中的天然蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的特異性和敏感性。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明中雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體可應(yīng)用于蛋白免疫印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，其特異性和靈敏度高，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。此外，在對(duì)水稻的研究中，本發(fā)明的雜交瘤分泌的單克隆抗體Rice90-31 (細(xì)胞株名稱Rice90_31，保藏號(hào)為CGMCC NO. 3986) 可應(yīng)用于水稻蛋白質(zhì)水平的科學(xué)研究中，也可以用于免疫共沉淀、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白芯片、免疫組化及細(xì)胞定位等實(shí)驗(yàn)中，此外還可能用于其它植物的相關(guān)研究。通過(guò)試驗(yàn)證明本發(fā)明的雜交瘤分泌的單克隆抗體效價(jià)滴度高，檢測(cè)效率高，且具有很好的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明所述的內(nèi)參基因熱激90抗原決定簇片段的蛋白質(zhì)體外純化結(jié)果。圖2是本發(fā)明所述的內(nèi)參蛋白質(zhì)熱激90在水稻不同組織的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。圖3是本發(fā)明所述的內(nèi)參蛋白質(zhì)熱激90在白葉枯病抗病反應(yīng)和晝夜生長(zhǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果。圖4是本發(fā)明所述的熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中百分含量的檢測(cè)結(jié)果。圖5是本發(fā)明所述的熱激90蛋白質(zhì)抗體Rice90-31對(duì)重組抗原的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。圖6是本發(fā)明所述的熱激90蛋白質(zhì)抗體Rice90-31檢測(cè)重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法均為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用的常規(guī)方法。生物材料和水稻材料水稻cDNA文庫(kù)、pET30a_GST表達(dá)載體、大腸桿菌ER2566和DH5a菌株等由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶BamH I.Xho I、T4DNA Ligase、Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自TAKARA。在水稻材料93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica)苗期(地上部、地下部)、分蘗期(莖、葉)、 孕穗期(劍葉、幼穗)、開花期(劍葉、穗子)、成熟期(劍葉、穗子)共5個(gè)時(shí)期10個(gè)部位分別取材；水稻晝夜生長(zhǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的材料取自93-11，以中午12點(diǎn)為起點(diǎn)，每4小時(shí)取樣一次；水稻轉(zhuǎn)基因系4021-3是將c-Myc tagged XA21轉(zhuǎn)化TP309而獲得的帶有純合XA21 基因的轉(zhuǎn)基因材料，4021-3接種親合小種PR6后在Oh、lh, 2h，4h，8h，Id, 3d和5d取材，所有水稻材料經(jīng)液氮速凍后，保存于-70°C備用。實(shí)施例1、內(nèi)參基因熱激90抗原決定簇預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì)為了制備針對(duì)熱激90蛋白質(zhì)的特異抗體，用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件對(duì)熱激90基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原決定簇的預(yù)測(cè)，選出抗原決定簇峰值較高的片段后，用BLASTP對(duì)水稻蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行唯一性檢測(cè)后選出目標(biāo)片段。根據(jù)TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)公布的熱激90基因(SEQ ID NO 1)的片段序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物(下劃線是外加的酶切位點(diǎn))HS90-F 5' -CGGGATCCTTCGCCTTCCAGGCCGAGAT-3’HS90-R 5' -CCGCTCGAGCTCCTCAAGGTATTCCAGCTGA-3’實(shí)施例2、內(nèi)參基因熱激90的克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)純化 以水稻cDNA文庫(kù)質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與pET30a_GST表達(dá)載體分別用BamH I和)(h0 I雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組子送北京華大基因研究中心測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌ER2566，按1 100的比例將過(guò)夜菌轉(zhuǎn)接至100mlLB+Kan50+l %葡萄糖液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 6 0. 8，加入0. lmol/L的IPTG，37°C震蕩培養(yǎng)3小時(shí)，收菌后超聲破碎，用Ni柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化， SDS-PAGE分離后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熱激90蛋白質(zhì)(SEQ ID NO. 3)的純度在90%以上，濃度約為 1-1. 5mg/mL，可以滿足制備抗體的要求(圖1)。實(shí)施例3、水稻不同發(fā)育時(shí)期熱激90蛋白質(zhì)的表達(dá)分析選取水稻93-11不同發(fā)育階段和不同部位的組織，液氮充分研磨新鮮水稻材料至粉末狀，分裝到預(yù)冷離心管中，每300 μ L粉末加入800 μ L蛋白裂解液(62. 5mmol/L pH7. 4 Tris · Cl，10% 甘油，2% SDS，20mmol/L NaF,2mmol/L EDTA，lmmol/L PMSF, 5 % β -巰基乙醇)，迅速混勻并置于冰上。Vortex 4-5次，在冰水混合物中孵育10分鐘，4°C，12000r/ min離心15分鐘，取上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，_70°C保存，用Bradford法測(cè)定樣品水稻總蛋白含量，每個(gè)樣品上樣5yg水稻總蛋白，將水稻總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分離， 電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，用制備的熱激90蛋白質(zhì)抗體室溫孵育3小時(shí)， TTBS(2mmol/L ρΗ7· 6 Tris 'Cl, 13. 6mmol/LNaCl,0. 1 % Tween-20)洗膜 3 次，每次 5min，之后加入羊抗兔二抗(中衫金橋)室溫孵育1小時(shí)，TTBS洗膜3次，每次5分鐘，加ECL Plus 檢測(cè)液檢測(cè)(普利萊公司)，暗室中對(duì)X光片曝光，免疫印跡可檢測(cè)到與預(yù)期分子量(94KD) 不符的條帶(圖2)，其表觀分子量為80KD，分析可能是由于不同轉(zhuǎn)錄本造成的，熱激90蛋白質(zhì)在水稻的不同組織中都表達(dá)且表達(dá)量極為相近，因此可以作為水稻蛋白水平研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)。實(shí)施例4、水稻內(nèi)參熱激90蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性為了進(jìn)一步驗(yàn)證熱激90蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，分別檢測(cè)熱激90蛋白質(zhì)在水稻4021-3 接白葉枯病菌不同時(shí)間的材料和水稻93-11 —晝夜不同時(shí)間的材料中的表達(dá)。提取水稻總蛋白(步驟同上)，用Bradford法測(cè)定樣品水稻總蛋白含量，等量上樣水稻總蛋白，將水稻總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，用制備的熱激 90 蛋白質(zhì)抗體(Rice90-31)室溫孵育 3 小時(shí)，TTBS(2mmol/L ρΗ7· 6 Tris · Cl, 13. 6mmol/ LNaCl,0. 1% Tween-20)洗膜3次，每次5分鐘，之后加入羊抗兔二抗(中衫金橋)室溫孵育1小時(shí)，TTBS洗膜3次，每次5分鐘，加ECL Plus檢測(cè)液檢測(cè)(普利萊公司)，暗室中對(duì) X光片曝光，結(jié)果表明熱激90蛋白質(zhì)在兩種參試材料中均恒定表達(dá)(圖3)。實(shí)施例5、內(nèi)參蛋白質(zhì)熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中百分含量根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在其線性范圍內(nèi)把一系列梯度稀釋的熱激90重組蛋白(10. 24ng, 5. 12ng, 2. 56ng，1. 28ng，0. 64ng)和水稻總蛋白(0. 74ng, 1. 48ng) 一起進(jìn)行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉封閉，用制備的熱激90蛋白質(zhì)抗體(Rice90-31)室溫孵育 3h，TTBS(2mmol/L pH7. 6 TrisCl, 13. 6mmol/L NaCl,0. 1 % Tween-20)洗膜3次，每次5分鐘，之后加入羊抗兔二抗(中衫金橋)室溫孵育lh，TTBS洗膜3次，每次5分鐘，加ECL Plus檢測(cè)液檢測(cè)(普利萊公司)，暗室中對(duì)X光片曝光，結(jié)果表明水稻中熱激90蛋白質(zhì)的條帶亮度介于梯度稀釋的熱激90重組蛋白條帶亮度之間(圖 4)，用ImageMaster 2DPlatinum軟件，對(duì)免疫印跡圖像信號(hào)采集，獲得每個(gè)條帶的信號(hào)值， 以熱激90重組蛋白質(zhì)量為自變量，以圖像信號(hào)強(qiáng)度值為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算內(nèi)參熱激90蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中的百分含量大約是0. 12%。實(shí)施例6、熱激90蛋白質(zhì)單克隆抗體制備及抗體鑒定將實(shí)施例1中純化的熱激90融合蛋白質(zhì)常規(guī)免疫4-6周齡雌性Balb/c小鼠3只； 第3次加強(qiáng)免疫后7天眼眶取血測(cè)效價(jià)，達(dá)要求者尾靜脈沖擊免疫待用。將sp2/0細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來(lái)，然后吸入到50ml滅過(guò)菌的離心管中，將新鮮切下的小鼠脾臟放到細(xì)胞篩上碾碎，再吸入到裝sp2/0的離心管中離心(1500rad/min，5分鐘)。將裝有離心好的、且混勻的細(xì)胞的離心管放入溫水中，加入Iml的PEG1500的，緩慢的攪動(dòng)細(xì)胞。在溫水中靜置 1分鐘。IOml的無(wú)血清的IMDM離心(1000rad/min，5分鐘)。加入IOml的血清小心的將細(xì)胞吹打起來(lái)，并倒入胸腺細(xì)胞，加入25ml滅菌的半固體培養(yǎng)基充分混勻。然后均勻的倒入 20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入孵箱中培養(yǎng)。融合后7-10天觀察克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中，根據(jù)情況轉(zhuǎn)移入96孔板中培養(yǎng)。用重組抗原熱激90蛋白作為抗原用間接Elisa的方法篩選陽(yáng)性克隆。所得陽(yáng)性克隆用XXX試劑盒鑒定抗體的亞類，選取合適的細(xì)胞株制備腹水，純化抗體。得到的抗體分別對(duì)重組抗原進(jìn)行了免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)(步驟同實(shí)施例2)(圖5)，結(jié)果表明，所制備的Rice90-31抗體能正確、特異的識(shí)別重組抗原，抗體使用濃度在1 10000-1 20000之間，證明抗體可用。實(shí)施例7、熱激90蛋白質(zhì)抗原抗體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢測(cè)靈敏度的確定用Rice90-31抗體對(duì)梯度稀釋的重組蛋白進(jìn)行免疫印跡(Western blotting)分析(步驟同實(shí)施例2)，用ImageMaster 2D Platinum軟件，對(duì)免疫印跡圖像信號(hào)采集，獲得每個(gè)條帶的信號(hào)值，以重組蛋白質(zhì)量為自變量，以圖像信號(hào)強(qiáng)度值為因變量，把蛋白質(zhì)量和圖像信號(hào)強(qiáng)度值分別取Lg值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明熱激90蛋白質(zhì)抗原蛋白質(zhì)量在0. 41 8. 2ng范圍內(nèi)時(shí)與圖像信號(hào)強(qiáng)度呈線性關(guān)系(圖6)。用熱激90蛋白質(zhì)抗體(Rice90-31)對(duì)水稻總蛋白梯度稀釋的樣品進(jìn)行免疫印跡分析(步驟同上)，可以確定 Rice90-31抗體在水稻蛋白質(zhì)中的最低檢測(cè)下限大約為0. Mng。
權(quán)利要求
1.一種水稻熱激90蛋白質(zhì)Head Shock 90 ftOtein，其特征在于所述蛋白質(zhì)能夠作為水稻的內(nèi)參蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的內(nèi)參蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有下述氨基酸殘基序列之1)序列表中的SEQID NO 1 ；2)序列表中SEQID NO :1的氨基酸序列中任意連續(xù)14個(gè)(或以上)氨基酸的多肽片段；3)與序列表中SEQID NO :1序列中任意連續(xù)14個(gè)氨基酸的相似性大于80%的多肽片段；
3.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為序列表中SEQID No 2的核苷酸序列。
4.一種單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體是由保藏日為2010年7月8日，保藏號(hào)為CGMCC NO. 3986的雜交瘤細(xì)胞系Rice90_31所分泌產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的用途，其在水稻蛋白免疫印跡研究中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的用途，其包括使權(quán)利要求4的單克隆抗體與生物樣品接觸。
7.含有權(quán)利要求4所述的免疫印跡試劑，其特征在于檢測(cè)水稻樣品中的蛋白質(zhì)。
8.保藏日為2010年7月8日，保藏號(hào)為CGMCCNO. 3986的小鼠雜交瘤細(xì)胞系 Rice90-31。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適合水稻免疫印跡研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)水稻熱激90蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在水稻不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的材料，水稻接白葉枯病菌不同時(shí)間的材料和水稻晝夜不同時(shí)間的材料中均穩(wěn)定表達(dá)，可以作為水稻免疫印跡研究的內(nèi)參蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了水稻熱激90蛋白質(zhì)相應(yīng)的單克隆抗體，利用體外表達(dá)的片段蛋白質(zhì)作免疫原免疫Balb/c小鼠，得到的雜交瘤XXX分泌得Rice90-31單克隆抗體。該抗體能夠特異的識(shí)別重組蛋白質(zhì)和水稻天然蛋白質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中的使用效價(jià)是1∶10000-1∶20000；本發(fā)明制備的Rice90-31單克隆抗體的線性檢測(cè)范圍是0.41-8.2ng，在水稻蛋白中的最低下限大約是0.24ng；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出HSP蛋白質(zhì)在水稻總蛋白中的百分含量大約是0.12％。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102464706SQ201010531838
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者劉國(guó)振, 劉斯奇, 史曉儒, 吳 琳, 尹長(zhǎng)城, 李曉明, 潘秦, 白輝, 韋漢福 申請(qǐng)人:北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司