一種快速提取水稻活性蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速提取水稻活性蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質是一種復雜的有機化合物。蛋白質是由氨基酸分子呈線性排列所形成，相鄰氨基酸殘基的羧基和氨基通過肽鍵連接在一起。蛋白質的氨基酸序列是由對應基因所編碼。除了遺傳密碼所編碼的20種“標準”氨基酸，在蛋白質中，某些氨基酸殘基還可以被翻譯后修飾而發(fā)生化學結構的變化，從而對蛋白質進行激活或調控。蛋白質是生命的物質基礎，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有水稻的生命水稻蛋白質的變性作用是蛋白質受物理或化學因素的影響，改變其分子內部結構和性質的作用。一般認為蛋白質的二級結構和三級結構有了改變或遭到破壞，都是變性的結果。能使蛋白質變性的化學方法有加強酸、強堿、重金屬鹽、尿素、丙酮等；能使蛋白質變性的物理方法有加熱(高溫)、紫外線及X射線照射、超聲波、劇烈振蕩或攪拌等。
[0003]水稻蛋白質變性會導致生物活性喪失。水稻蛋白質的生物活性是指蛋白質所具有的酶、激素、等生物學功能。生物活性喪失是蛋白質變性的主要特征。有時蛋白質的空間結構只要輕微變化即可引起生物活性的喪失。
[0004]目前，大多數(shù)的水稻蛋白質提取方法多采用丙酮等變性物質對蛋白進行提取，提取到的為水稻變性蛋白質。然而，有些研究需要采用水稻活性的蛋白質才能進行研究。因此，研發(fā)一種快速的提取水稻活性蛋白的方法顯得非常重要。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便、適合大規(guī)模提取實驗的快速提取水稻活性蛋白的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步驟:
O稱取水稻根部樣品，用液氮研磨水稻根部至粉末狀，每Ig粉末加入l-2ml蛋白提取液，在旋渦混合器上震蕩1-1 Omin，混合均勻，然后在4 °C，2000-5000g條件下離心10-30min,取一次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
2)將上述含有一次上清液的離心管，在4°C，10000-20000g條件下離心10_30min，取二次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
3)將上述含有二次上清液的離心管，在4°C，10000-20000g條件下離心10_30min，取三次上清液，所述三次上清液即為水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由終濃度為10-50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)^S濃度100-500 mmol /T, NaCl,終濃度2-5 mmol /I, ]\%012;體積分數(shù)0.1-1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和終濃度1-10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)組成，pH=7_8。
[0006]本發(fā)明所述終濃度是指溶液在蛋白提取液中的濃度，例如所述蛋白提取液由終濃度為 10-50 mmol/L Tris-HCl，終濃度 100-500 mmol/L NaCl，終濃度 2-5 mmol/L MgCl2，體積分數(shù)0.1-1% NP-40和終濃度1-10 mmol/L DTT組成，pH=7_8，是指Tris-HCl在蛋白提取液中的濃度為10-50m mol/L, NaCl在蛋白提取液中的濃度為100_500m mol/L, MgCl2在蛋白提取液中的濃度為2-5m mol/L，NP-40在蛋白提取液中的體積分數(shù)為0.1_1%，DTT在蛋白提取液中的濃度為1-1Om mol/L，蛋白提取液的pH=7-8。
[0007]進一步，所述蛋白提取液由終濃度為20 mmol/L Tris-HCl，終濃度100 mmol/LNaCl，終濃度4 mmol/L MgCl2溶液；體積分數(shù)0.5% NP-40和終濃度5 mmol/L DTT組成，pH=7.5。
[0008]所述NP-40和DTT均購自上海碧云天生物技術有限公司。
[0009]本發(fā)明采用以上技術方案，采用獨有的活性蛋白提取液，能夠快速、便捷地提取到水稻的活性蛋白質。所述的蛋白提取液不含有變性裂解液，只含有NP-40和DTT等非變性裂解液，這些分子不會導致蛋白質變性，因此使得蛋白特別是膜蛋白保持天然狀態(tài)。而變性的裂解液一般是加SDS，還有另外一些強的變性劑，它們能夠使得蛋白完全變性。同時，本發(fā)明在提取過程中保持低溫，因此能方便、快捷地提取到水稻的活性蛋白。本發(fā)明操作流程方便，適合大規(guī)模提取實驗，便于實驗室更好地開展水稻蛋白質組學的相關研究。
【附圖說明】
[0010]圖1為從水稻中提取出的活性蛋白的電泳圖:
泳道I為蛋白質marker，泳道2為水稻活性蛋白。
【具體實施方式】
[0011]一種快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步驟:
1)稱取0.5-2g水稻根部樣品，用液氮研磨水稻根部至粉末狀(研磨至顏色泛白)，每g粉末加入l_2ml蛋白提取液，在旋渦混合器上震蕩Ι-lOmin，混合均勻，然后在4°C，2000-5000g條件下離心10-30min,取一次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
2)將上述含有一次上清液的離心管，在4°C，10000-20000g條件下離心10_30min，取二次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
3)將上述含有二次上清液的離心管，在4°C，10000-20000g條件下離心10_30min，取三次上清液，所述三次上清液即為水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由終濃度為10-50 mmol/L Tris-HCl，終濃度100-500 mmol/L NaCl,終濃度2-5 mmol/L MgCl2溶液；體積分數(shù)0.1-1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和終濃度1-10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)組成，pH=7_8。
[0012]所述NP-40和DTT均購自上海碧云天生物技術有限公司。
[0013]實施例1
一種快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步驟:
1)稱取Ig水稻根部樣品，用液氮研磨水稻根部至粉末狀(研磨至顏色泛白)，每g粉末加入Iml蛋白提取液，在旋渦混合器上震蕩5min，混合均勻，然后在4°C，4000g條件下離心15min，取一次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
2)將上述含有一次上清液的離心管，在4°C，20000g條件下離心30min，取二次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
3)將上述含有二次上清液的離心管，在4°C，20000g條件下離心lOmin，取三次上清液，所述三次上清液即為水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由終濃度為20 mmol/L Tris-HCl，終濃度100mmol/L NaCl，終濃度4mmol/L MgCl2溶液；體積分數(shù)0.5%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和終濃度5 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)組成，ρΗ=7.5。
[0014]所述ΝΡ-40和DTT均購自上海碧云天生物技術有限公司。
[0015]實施例2
一種快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步驟:
1)稱取0.5g水稻根部樣品，用液氮研磨水稻根部至粉末狀(研磨至顏色泛白)，每g粉末加入Iml蛋白提取液，在旋渦混合器上震蕩lmin，混合均勻，然后在4°C，2000g條件下離心30min，取一次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
2)將上述含有一次上清液的離心管，在4°C，1000g條件下離心30min，取二次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
3)將上述含有二次上清液的離心管，在4°C，1000g條件下離心30min，取三次上清液，所述三次上清液即為水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由終濃度為10 mmol/L Tris-HCl，終濃度300 mmol/L NaCl，終濃度2mmol/L MgCl2溶液；體積分數(shù)0.1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和終濃度I mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)組成，pH=7。
[0016]所述NP-40和DTT均購自上海碧云天生物技術有限公司。
[0017]實施例3
一種快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步驟:
1)稱取2g水稻根部樣品，用液氮研磨水稻根部至粉末狀(研磨至顏色泛白)，每g粉末加入2ml蛋白提取液，在旋渦混合器上震蕩lOmin，混合均勻，然后在4°C，5000g條件下離心lOmin，取一次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
2)將上述含有一次上清液的離心管，在4°C，20000g條件下離心lOmin，取二次上清液到無菌的1.5ml離心管中；
3)將上述含有二次上清液的離心管，在4°C，20000g條件下離心lOmin，取三次上清液，所述三次上清液即為水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由終濃度為50 mmol/L Tris-HCl，終濃度500 mmol/L NaCl，終濃度5mmol/L MgCl2溶液；體積分數(shù)1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和終濃度10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)組成，pH=8。
[0018]所述NP-40和DTT均購自上海碧云天生物技術有限公司。
[0019]按照實施例1的方法提取的水稻活性蛋白電泳圖見圖1，泳道I為Fermentas公司未預染蛋白Marker SM0431，泳道2為實施例1的方法提取的水稻活性蛋白。從圖1可以看出，本方法能夠方便、快捷地提取到水稻活性蛋白。
【主權項】
1.一種快速提取水稻活性蛋白的方法，其特征在于:其包括以下步驟: 1)稱取水稻根部，用液氮研磨水稻根部至粉末狀，每克粉末加入l-2ml蛋白提取液，在旋渦混合器上震蕩Ι-lOmin，然后在4°C，2000-5000g條件下離心10_30min，取一次上清液到無菌的離心管中； 2)將上述含有一次上清液的離心管，在4°C，10000-20000g條件下離心10_30min，取二次上清液到無菌的離心管中； 3)將上述含有二次上清液的離心管，在4°C，10000-20000g條件下離心10_30min，取三次上清液，所述三次上清液即為水稻活性蛋白； 所述蛋白提取液由終濃度為10-50 mmol/L Tris-HCl，終濃度100-500 mmol/L NaCl,終濃度 2-5 mmol/L MgCl2，體積分數(shù) 0.1-1% NP-40 和終濃度 1-10 mmol/L DTT 組成，pH=7-8。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種快速提取水稻活性蛋白的方法，其特征在于:所述蛋白提取液由終濃度為 20 mmol/L Tris-HCl，終濃度 100 mmol/L NaCl，終濃度 4 mmol/L MgCl2溶液，體積分數(shù)0.5% NP-40和終濃度5 mmol/L DTT組成，pH=7.5。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取水稻活性蛋白的方法，采用獨有的活性蛋白提取液，所述的蛋白提取液不含有變性裂解液，只含有NP-40和DTT等非變性裂解液，不會導致蛋白質變性，因此使得蛋白特別是膜蛋白保持天然狀態(tài),同時，本發(fā)明在提取過程中保持低溫，因此能方便、快捷地提取到水稻的活性蛋白。本發(fā)明操作流程方便，適合大規(guī)模提取實驗，便于實驗室更好地開展水稻蛋白質組學的相關研究。
【IPC分類】C07K1-14
【公開號】CN104558099
【申請?zhí)枴緾N201410835022
【發(fā)明人】王清水, 余彥
【申請人】福建師范大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月29日