親水性重組蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及親水性重組蛋白的提取方法，詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及從表達(dá)親水性指 數(shù)（hydropathyindex)為0以下的重組蛛絲蛋白等親水性重組蛋白的宿主中提取親水性 重組蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，利用基因重組技術(shù)將目標(biāo)外來基因?qū)氪竽c桿菌等宿主的細(xì)胞中、使目 標(biāo)蛋白表達(dá)成為可能，利用該技術(shù)進(jìn)行了各種有用的重組蛋白的生產(chǎn)。蛛絲纖維是高強(qiáng)度 和具有韌性的纖維，由于這樣的特性，蛛絲作為新型原料受到關(guān)注，利用基因重組技術(shù)進(jìn)行 了使作為蛛絲原料的蛛絲蛋白在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中的表達(dá)、回收。通常，使用大腸桿菌 等宿主進(jìn)行重組蛋白的生產(chǎn)時(shí)，通過將菌體破壞來回收目標(biāo)蛋白。例如，專利文獻(xiàn)1中記載 了從宿主細(xì)胞中回收重組蛛絲蛋白的方法。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0004] 專利文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :日本特表2004-503204號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明所要解決的課題
[0007] 專利文獻(xiàn)1中，通過使用甲酸、丙酸等有機(jī)酸使宿主細(xì)胞溶解來回收重組蛛絲蛋 白，但當(dāng)使用甲酸、丙酸等有機(jī)酸時(shí)，存在對(duì)酸沒有耐受性的蛋白易于被分解的問題。
[0008] 本發(fā)明為了解決上述以往的問題，提供一種能夠在不使用有機(jī)酸的情況下從表達(dá) 親水性重組蛛絲蛋白等親水性重組蛋白的宿主中提取親水性重組蛋白的親水性重組蛋白 的提取方法。
[0009] 用于解決課題的手段
[0010] 本發(fā)明涉及一種親水性重組蛋白的提取方法，其是從表達(dá)親水性重組蛋白的宿主 中提取親水性重組蛋白的方法，其特征在于，其包含：向上述表達(dá)親水性重組蛋白的宿主 中添加溶解用溶劑，獲得宿主細(xì)胞的溶解物的溶解物獲取工序，和向通過上述溶解物獲取 工序獲得的上述宿主細(xì)胞的溶解物中添加稀釋用溶劑，然后從得到的稀釋液中將不溶物分 離，從而將含有上述親水性重組蛋白的上清液回收的工序；其中，上述親水性重組蛋白的親 水性指數(shù)為〇以下，上述溶解用溶劑為非質(zhì)子性極性溶劑，上述稀釋用溶劑為水系溶劑。
[0011] 本發(fā)明的親水性重組蛋白的提取方法中，上述溶解用溶劑優(yōu)選為不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的非質(zhì)子性極性溶劑，偶極矩優(yōu)選為3. 0D以上。上述溶解用溶劑更優(yōu)選為選自二甲基亞 砜、N，N-二甲基甲酰胺、和N，N-二甲基乙酰胺中的一種以上的非質(zhì)子性極性溶劑。上述溶 解用溶劑優(yōu)選為在上述非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑。上述稀釋用溶劑優(yōu)選 為選自（1)水、（2)水與乙醇的混合液和（3)水溶性緩沖液中的一種水系溶劑。上述溶解 用溶劑相對(duì)于上述宿主的質(zhì)量以體積（mL)/質(zhì)量（g)比計(jì)優(yōu)選添加0.5倍以上，上述稀釋 用溶劑相對(duì)于上述宿主細(xì)胞的溶解物以體積比計(jì)優(yōu)選添加0. 5倍以上。上述親水性重組蛋 白優(yōu)選為選自重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性蛋白和重組膠原中的一種蛋白。
[0012] 發(fā)明效果
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，通過使用非質(zhì)子性極性溶劑作為溶解用溶劑、使用水系溶劑作為稀 釋用溶劑，用溶解用溶劑將表達(dá)親水性指數(shù)為〇以下的親水性重組蛋白的宿主溶解，向得 到的宿主細(xì)胞的溶解物中添加稀釋用溶劑進(jìn)行稀釋、將不溶物分離，回收上清液，從而能夠 在不使用有機(jī)酸的情況下，簡(jiǎn)便且高效地從宿主提取親水性指數(shù)為〇以下的親水性重組蛋 白。
[0014] 另外，根據(jù)本發(fā)明，通過使用不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非質(zhì)子性極性溶劑，還能夠以更高 的純度獲得親水性指數(shù)為0以下的重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性蛋白、重組膠原等親水性 重組蛋白。另外，根據(jù)本發(fā)明，通過使用在非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑作為 溶解用溶劑，還能夠獲得純度更高的親水性指數(shù)為0以下的重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性 蛋白、重組膠原等親水性重組蛋白。
【附圖說明】
[0015] 圖1為表示實(shí)施例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)的結(jié) 果的照片。
[0016] 圖2為表示實(shí)施例2~5中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照 片。
[0017] 圖3為表示實(shí)施例6~8中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照 片。
[0018] 圖4為表示實(shí)施例9~13中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照 片。
[0019] 圖5為表示實(shí)施例16中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照片。
[0020] 圖6為表示實(shí)施例17~21中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的 照片。
[0021] 圖7為表示實(shí)施例22中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照片。
[0022] 圖8為表示實(shí)施例23~26中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的 照片。
[0023] 圖9為表示實(shí)施例28中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照片。
[0024] 圖10為表示比較例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照片。
[0025] 圖11A為表示實(shí)施例32中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照 片，圖11B為表示實(shí)施例33中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明中，蛋白的親水性指數(shù)（hydropathyindex)是如下算出的數(shù)值。首先，求 出蛋白中存在的氨基酸的親水性指數(shù)的總和。接著，用該總和除以蛋白中的氨基酸殘基數(shù) 求出平均值，將算出的平均值作為蛋白的親水性指數(shù)。其中，關(guān)于氨基酸的親水性指數(shù)，使 用公知的指標(biāo)（Hydropathyindex:Kyte，J. &Doolittle，R.F. (1982)Asimplemethodfor displayingthehydropathiccharacterofaprotein.J.Mol.Biol. 157,105-132. )〇 具 體而言，各氨基酸的親水性指數(shù)（下文也記為HI)如下表1所示。
[0027]表 1
[0029]本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)：通過在表達(dá)親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白的宿主中添 加非質(zhì)子性極性溶劑、使宿主細(xì)胞溶解，然后在得到的宿主細(xì)胞的溶解物中添加水等水系 溶劑進(jìn)行稀釋，能夠?qū)⒂H水性指數(shù)為〇以下的親水性重組蛋白通過上清液回收，從而完成 了本發(fā)明。即發(fā)現(xiàn)了，通過將宿主細(xì)胞用非質(zhì)子性極性溶劑溶解，能夠獲得親水性指數(shù)為0 以下的親水性重組蛋白溶解在非質(zhì)子性極性溶劑中而成的溶解物，當(dāng)在該溶解物中添加水 等水系溶劑時(shí)，親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白不發(fā)生凝聚、而除親水性指數(shù)為0以 下的親水性重組蛋白以外的大部分蛋白發(fā)生凝聚，從而完成了本發(fā)明。下文中，在沒有特別 說明的情況下，親水性蛋白是指親水性指數(shù)為0以下的親水性蛋白。另外，下文中，在沒有 特別說明的情況下，重組蛋白是指親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白。
[0030] 上述非質(zhì)子性極性溶劑沒有特別限定，從降低夾雜物的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選純度為 90%以上、更優(yōu)選為95%以上。上述非質(zhì)子性極性溶劑優(yōu)選為不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非質(zhì)子性 極性溶劑。當(dāng)使用不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非質(zhì)子性極性溶劑時(shí)，能夠以更高的純度提取重組蛛 絲蛋白、重組節(jié)肢彈性蛋白、重組膠原等親水性重組蛋白。作為不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非質(zhì)子性 極性溶劑，可列舉出二甲基亞砜（DMS0)、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)和N，N-二甲基乙酰胺 (DMA)等。
[0031] 另外，上述非質(zhì)子性極性溶劑的偶極矩優(yōu)選為3. 0D以上。偶極矩被用作表示分子 的極性強(qiáng)度的指標(biāo)，偶極矩越大則極性強(qiáng)度也越大。通常，偶極矩為3. 0D以上的分子的極 性強(qiáng)，當(dāng)溶解蛋白等具有極性的化合物時(shí)，極性大的溶劑是有效的。下表2中記載了基于講 談社Scientific公司出版的溶劑手冊(cè)（2007年）的各種有機(jī)化合物（有機(jī)溶劑）的偶極 矩。作為偶極矩為3.0D以上的非質(zhì)子性極性溶劑，可列舉出二甲基亞砜（DMSO)、N，N-二甲 基甲酰胺（〇1^)、1^二甲基乙酰胺（0嫩)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮（010)、^甲基-2-吡 咯烷酮（NMP)、乙腈等。
[0032]表2
[0034] 從重組蛋白的提取純度高的觀點(diǎn)出發(fā)，上述非質(zhì)子性極性溶劑更優(yōu)選偶極矩為 3. 0D以上且不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步優(yōu)選為選自二甲基亞砜（DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)和N，N-二甲基乙酰胺（DMA)中的一種以上的非質(zhì)子性極性溶劑。
[0035] 上述溶解用溶劑優(yōu)選為在非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑。當(dāng)在非質(zhì) 子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽時(shí)，能夠獲得純度更高的重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性蛋白、重 組膠原等親水性重組蛋白，因此優(yōu)選。上述無機(jī)鹽沒有特別限定，從提高重組蛋白的純度的 觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為堿金屬鹵化物、堿土類金屬鹵化物、堿土類金屬硝酸鹽和硫氰酸鹽中的至 少一種。作為上述堿金屬鹵化物，優(yōu)選使用例如LiCl、LiBr等。作為上述堿土類金屬鹵化 物，優(yōu)選使用例如〇&(：12等。作為上述堿土類金屬硝酸鹽，優(yōu)選使用例如Ca(N03)2等。作為 上述硫氰酸鹽，優(yōu)選使用例如NaSCN等。
[0036] 當(dāng)上述溶解用溶劑為在非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑時(shí)，沒有特別 限定，從提高重組蛋白的純度的觀點(diǎn)出發(fā)，無機(jī)鹽的濃度優(yōu)選為〇. 1M以上、更優(yōu)選為0. 25M 以上、進(jìn)一步優(yōu)選為0. 5M以上。另外，上述溶解用溶劑中，無機(jī)鹽的濃度的上限沒有特別限 定，優(yōu)選為飽和狀態(tài)以下，例如可以為2. 5M以下。
[0037] 上述溶解用溶劑的添加量只要是能夠溶解上述宿主的量即可，沒有特別限定，從 提高溶解性的觀點(diǎn)出發(fā)，相對(duì)于上述宿主（細(xì)胞）的質(zhì)量以體積（mL)/質(zhì)量（g)比計(jì)優(yōu)選 為0. 5倍以上、更優(yōu)選為0. 75倍以上、進(jìn)一步優(yōu)選為1倍以上。另外，從操作的簡(jiǎn)便性出發(fā)， 上述溶解用溶劑的添加量相對(duì)于上述宿主的質(zhì)量以體積（mL)/質(zhì)量（g)比計(jì)優(yōu)選為10倍 以下、更優(yōu)選為6倍以下、進(jìn)一步優(yōu)選為4倍以下。上述宿主（細(xì)胞）可以為干燥的狀態(tài)、 也可以為濕的狀態(tài)。
[0038] 將上述溶解用溶劑添加到宿主中、獲得宿主細(xì)胞的溶解物的溶解物獲取工序沒 有特別限定，從重組蛋白的溶解性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在20°C以上的條件下進(jìn)行、更優(yōu)選在 45°C以上的條件下進(jìn)行、進(jìn)一步優(yōu)選在50°C以上的條件下進(jìn)行。另外，從抑制重組蛋白分解 的觀點(diǎn)出發(fā)，上述溶解物獲取工序優(yōu)選在100°C以下的條件下進(jìn)行、更優(yōu)選在95°C以下的 條件下進(jìn)行。另外，上述溶解物獲取工序沒有特別限定，例如優(yōu)選進(jìn)行10~300分鐘、更優(yōu) 選進(jìn)行30~180分鐘。在向通過溶解物獲取工序得到的宿主細(xì)胞的溶解物中添加稀釋用 溶劑之前，可以將不溶物分離。不溶物的分離只要能夠?qū)⒊两滴铮畚铮┓蛛x即可，沒有 特別限定。從操作的簡(jiǎn)便性出發(fā)，優(yōu)選通過利用過濾的分離和/或離心分離來進(jìn)行。利用 過濾的分離例如可以使用濾紙、過濾膜等來進(jìn)行。離心分離的條件沒有特別限定。例如可 以在室溫（20±5°C)、8000Xg~15000Xg下進(jìn)行5~20分鐘。上述不溶物的分離可以進(jìn) 行2次以上。
[0039] 上述稀釋用溶劑為水系溶劑。本發(fā)明中，水系溶劑是指包含水的溶劑，可列舉出例 如水、水與水混和性有機(jī)溶劑的混合液、水溶性緩沖液、酸性水溶液、堿性水溶液等。作為酸 性水溶液，可列舉出甲酸、乙酸、稀鹽酸等酸性水溶液；作為堿性水溶液，可列舉出氫氧化鈉 水溶液、氫氧化鈣水溶液等堿性水溶液。作為水混和性有機(jī)溶劑，只要是能夠與水混合的有 機(jī)溶劑即可，可以使用公知的有機(jī)溶劑。具體而言，可列舉出甲醇、乙醇等醇類。
[0040] 上述稀釋用溶