、10w/v% 2-疏基乙醇、0? 004w/ v%溴酚藍、0. 125MTris、pH為6. 8)30yL，在95°C下熱處理10分鐘，使用在室溫下冷卻了 的經(jīng)熱變性的蛋白溶液，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳確認條帶。電泳后，將實施例1的凝膠用 OrioleFluorescentGelStain染色，將其他實施例的凝膠用考馬斯亮藍（CBB)染色，將其 結(jié)果示于圖1~圖4。另外，通過用分析軟件ImageLab(Bio_RADLaboratories，Inc.)對 染色后的蛋白的電泳照片進行圖像分析，求出目標蛋白（重組蛛絲蛋白）的純度。其結(jié)果 示于下表4中。作為對照，圖2和圖4中分別也一并示出了實施例2中的使用了大腸桿菌 的溶解物的SDS-PAGE的結(jié)果。其中，Oriole Fluorescent Gel Stain時使用L5yg蛋白、 CBB時使用7 y g蛋白進行電泳。
[0134]表 4
[0136] 圖1中示出了實施例1中得到的蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果。圖1中，LaneM表示分 子量標記物、Lane1表示實施例1中得到的上清液中所含的蛋白。圖1中，用箭頭表示的 為與ADF3Kai-small-M(分子量為約12. 5kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。從圖1和表4確認了， 通過用含有1M的LiCl的DMS0將大腸桿菌溶解，然后將大腸桿菌的溶解物用超純水稀釋， 得到了含有目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-small-M)的上清液。上清液中所含的蛋白中，目 標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-small-M)的純度為60%以上、精制率高。
[0137] 圖2中示出了實施例2~5中得到的蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果。圖2中，LaneM 表不分子量標記物、Lane1表不實施例2的大腸桿菌的溶解物中所含的蛋白、Lane2、3、 4、5分別表示實施例2、3、4、5中得到的上清液中所含的蛋白。圖3中示出了實施例6~8 中得到的蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果。圖3中，LaneM表示分子量標記物、LaneI、II、III 分別表示實施例6、7、8中得到的上清液中所含的蛋白。圖2和圖3中，用箭頭表示的為 與ADF3Kai-NN(分子量為約47. 5kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。從圖2、圖3和表4確認了，通 過用含有〇. 5M的LiCl的DMS0將大腸桿菌溶解，將大腸桿菌的溶解物用各種水系溶劑稀 釋，得到了含有目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)的上清液。另外，當使用水與乙醇的混合 液作為稀釋用溶劑、且稀釋液（大腸桿菌的溶解物與稀釋用溶劑的混合液）中的乙醇濃度 為35質(zhì)量％以下時，與僅使用純水作為稀釋用溶劑時相比，在得到的上清液中所含的蛋白 中，目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)的純度更高。特別是，當稀釋液中的乙醇濃度為10~ 30質(zhì)量％時，在得到的上清液中所含的蛋白中，目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)的純度 更高。另一方面可知，稀釋液中，當乙醇的濃度達到45質(zhì)量％以上時，目標重組蛛絲蛋白 (ADF3Kai-NN)的純度與僅使用純水作為稀釋用溶劑時相比變低。這推測是由于當稀釋液中 的乙醇濃度過高時，目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)發(fā)生凝聚。
[0138] 圖4中示出了實施例9~13中得到的蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果。圖4中，LaneM表 示分子量標記物、Lanea表示實施例9的大腸桿菌的溶解物中所含的蛋白、Laneb、c、d、e、 f?分別表示實施例9、10、11、12、13中得到的上清液中所含的蛋白。圖4中，用箭頭表示的為 與ADF3Kai-NN(分子量為約47. 5kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。從圖4和表4確認了，通過用含 有0. 5M的LiCl的DMSO將大腸桿菌溶解，將大腸桿菌的溶解物用各種水系溶劑稀釋，得到 了含有目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)的上清液。另外可知，當稀釋用溶劑為pH為3~9 的50mM的Tris緩沖液時，與使用了純水時同樣地可提取目標重組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)。
[0139] 另外，從表4的實施例1、2、14和15的結(jié)果可知，使用含有無機鹽（LiCl)的DMSO 作為溶解用溶劑時比僅使用不含有無機鹽的DMSO時可提取純度更高的重組蛛絲蛋白 (ADF3Kai-NN)〇
[0140](實施例 16)
[0141] 使用表達ADF4Kai-W蛋白的大腸桿菌的干燥菌體約0.lg，除此以外，與實施例2同 樣地回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液。
[0142] 使用實施例16中得到的含有ADF4Kai_W蛋白的上清液，如上所述地進行 SDS-PAGE。電泳后，將凝膠用考馬斯亮藍（CBB)染色，將其結(jié)果示于圖5中。其中，圖5中 還一并示出了使用了實施例16中的大腸桿菌的溶解物、和回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清 液后的沉淀的SDS-PAGE的結(jié)果。向回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液后的沉淀中添加含 有2M的LiCl的DMSO,在60°C下靜置30分鐘，使用溶解后的溶液進行SDS-PAGE。
[0143] 圖5中，LaneM表不分子量標記物、Lane1表不大腸桿菌的溶解物中所含的蛋白、 Lane2表示上清液中所含的蛋白、Lane3表示沉淀中所含的蛋白。圖5中，用箭頭表示的為 與ADF4Kai-W(分子量為約26. 4kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。從圖5確認了，通過用含有0. 5M 的LiCl的DMSO將大腸桿菌溶解，然后將大腸桿菌的溶解物用純水稀釋，得到了含有目標重 組蛛絲蛋白（ADF4Kai-W)的上清液。
[0144] (實施例 17)
[0145] (1)在表達ADF3Kai_NN蛋白的大腸桿菌的干燥菌體約0.lg中添加lmL含有0.5M 的LiCl的DMS0,使菌體分散，在60°C下靜置30分鐘，得到大腸桿菌的溶解物。
[0146] (2)將得到的大腸桿菌的溶解物用超純水等倍稀釋，用離心分離機（T0MY精工 公司制的"MX-305"）將得到的稀釋液在20°C、11000Xg下離心分離5分鐘，回收含有 ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
[0147](實施例18~21)
[0148] 將大腸桿菌的溶解物用下表5所示的磷酸緩沖液等倍稀釋，除此以外，與實施例 17同樣地回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
[0149] 使用實施例17~21中得到的含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液，如上所述地進行 SDS-PAGE。電泳后，將凝膠用考馬斯亮藍（CBB)染色，將其結(jié)果示于圖6。另外，通過用分析 軟件ImageLab(Bio_RADLaboratories，Inc.)對染色后的蛋白的電泳照片進行圖像分析， 求出目標蛋白（ADF3Kai-NN)的純度。將其結(jié)果示于下表5。其中，圖6中還一并示出使用 了實施例17中的大腸桿菌的溶解物的SDS-PAGE的結(jié)果。
[0150]表 5
[0152] 圖6中示出了實施例17~21中得到的蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果。圖6中，LaneM 表不分子量標記物、Lane1表不實施例17的大腸桿菌的溶解物中所含的蛋白、Lane2、3、 4、5、6分別表示實施例17、18、19、20、21中得到的上清液中所含的蛋白。圖6中，用箭頭表 示的為與ADF3Kai-NN(分子量為約47. 5kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。從圖6和表5可知，當稀 釋用溶劑為pH為3~9的50mM的磷酸鈉緩沖液時，與使用純水時同樣地能夠提取目標重 組蛛絲蛋白（ADF3Kai-NN)。
[0153] (實施例 22)
[0154] 使用表達Flag92-short2-UU蛋白的大腸桿菌的干燥菌體約0.lg，除此以外，與實 施例2同樣地回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液。
[0155] 使用實施例22中得到的含有Flag92-short2_UU蛋白的上清液，如上所述地進行 SDS-PAGE。電泳后，將凝膠用考馬斯亮藍（CBB)染色，將其結(jié)果示于圖7。其中，圖7中還 一并示出使用了實施例22中的大腸桿菌的溶解物、和回收含有Flag92-short2-UU蛋白的 上清液后的沉淀的SDS-PAGE的結(jié)果。通過在回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液后 的沉淀中添加含有2M的LiCl的DMSO,在60°C下靜置30分鐘，使用該溶解后的溶液進行 SDS-PAGE〇
[0156] 圖7中，LaneM表不分子量標記物、Lane1表不大腸桿菌的溶解物中所含的蛋白、 Lane2表示上清液中所含的蛋白、Lane3表示沉淀中所含的蛋白。圖7中，用箭頭表示的 為與Flag92-short2-UU(分子量為約36. 9kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。從圖7確認了，通過用 含有0. 5M的LiCl的DMSO將大腸桿菌溶解，然后將大腸桿菌的溶解物用純水稀釋，能夠得 到含有目標重組蛛絲蛋白（Flag92-short2-UU)的上清液。
[0157] (實施例 23)
[0158] (1)在表達ADF3Kai-small_M蛋白的大腸桿菌的干燥菌體約0.lg中添加lmL含有 1M的LiCl的DMSO,使菌體分散，在60°C下溶解40分鐘，得到大腸桿菌的溶解物。
[0159] (2)將得到的大腸桿菌的溶解物用超純水等倍稀釋，用離心分離機（TOMY精工 公司制的"MX-305"）將得到的稀釋液在20°C、11000Xg下離心分離5分鐘，回收含有 ADF3Kai-small_M蛋白的上清液。
[0160] (實施例 24)
[0161] 代替含有1M的LiCl的DMSO,使用含有1M的LiCl的DMF，除此以外，與實施例23 同樣地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
[0162] (實施例 25)
[0163] 代替含有1M的LiCl的DMS0,使用含有1M的LiCl的DMA，除此以外，與實施例23 同樣地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
[0164] (實施例 26)
[0165] 代替含有1M的LiCl的DMS0,使用含有1M的LiCl的NMP，除此以外，與實施例23 同樣地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
[0166] 使用實施例23~26中得到的含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液，如上所述地 進行SDS-PAGE。電泳后，將凝膠用OrioleFluorescentGelStain染色，將其結(jié)果示于圖 8。另外，通過用分析軟件ImageLab(Bio_RADLaboratories，Inc.)對染色后的蛋白的電泳 照片進行圖像分析，求出上清液中的ADF3Kai-small-M蛋白的純度。將其結(jié)果示于下表6。
[0167] 圖8中，下部分的SDS-PAGE結(jié)果為使用了含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液的 SDS-PAGE結(jié)果，上部分的SDS-PAGE結(jié)果為使用了對應(yīng)的大腸桿菌的溶解物的SDS-PAGE的 結(jié)果。圖8中，LaneM表示分子量標記物、Lane1、2、3、4分別對應(yīng)于實施例23、24、25、26。 圖8中，用箭頭表示的為與ADF3Kai-small-M(分子量為約12. 5kDa)對應(yīng)的蛋白的條帶。
[0168] 表 6
[0170] 從圖8和表6可知，使用DMSO、DMF、DMA作為溶解用溶劑時，目標親水性重組蛋白 的純度高。而使用NMP作為溶解用溶劑時，目標親水性蛋白（重組蛋白）的純度低。當使 用不具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非質(zhì)子性極性溶劑作為溶解用溶劑時，能夠從表達HI為0以下的親水 性重組蛋白的宿主細胞中以高純度提取重組蛋白（HI為0以下）。
[0171](實施例 27)