專利名稱：高親和性白細(xì)胞介素－4突變蛋白質(zhì)的制作方法
背景1．發(fā)明領(lǐng)域概括地說(shuō)，本發(fā)明涉及藥物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。更明確一些，本發(fā)明涉及細(xì)胞因子家族的新型變異體，特別是人體白細(xì)胞介素-4(IL-4)。
2．相關(guān)技術(shù)說(shuō)明白細(xì)胞介素-4是一種由活化T細(xì)胞(Howard et al.,J.Exp.Med.155:914(1982))、肥大細(xì)胞(Brown et al.,Cell50:809(1987))及嗜堿粒細(xì)胞(Seder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2835(1991))分泌的15kDa糖蛋白，它在造血及非造血細(xì)胞中調(diào)節(jié)著多種細(xì)胞功能。IL-4的序列已在美國(guó)專利第5,017,691號(hào)中公開(kāi)。白細(xì)胞介素-4(IL-4)是一種多效性細(xì)胞因子，它對(duì)免疫系統(tǒng)、內(nèi)皮、以及那些成纖維細(xì)胞性的細(xì)胞均具有活性?，F(xiàn)已報(bào)道的IL-4體外給藥效果包括，T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖、B細(xì)胞中免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換、刺激內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞表面粘附分子的生成、以及刺激IL-6的釋放。T細(xì)胞中，IL-4在以有絲分裂原預(yù)活化后刺激T細(xì)胞的增殖并下調(diào)IFN-γ的生成。在單核細(xì)胞中，IL-4誘導(dǎo)Ⅱ類MHC分子的表達(dá)、由脂多糖誘導(dǎo)的tPA的釋放、以及CD23的表達(dá)。在內(nèi)皮細(xì)胞(EC)中，IL-4誘導(dǎo)VCAM-1的表達(dá)和IL-6的釋放。IL-4降低ICAM-1的表達(dá)。Maher,DW,et al.，人體白細(xì)胞介素-4一種具有治療應(yīng)用潛力的免疫調(diào)節(jié)劑，Progess in Growth Factor Research,3:43-56(1991)。
鑒于其能夠刺激通過(guò)與IL-2接觸而被活化的T細(xì)胞的增殖這一能力，IL-4治療法一直得以研究應(yīng)用。例如，IL-4在腎癌的動(dòng)物模型中顯示出其抗瘤活性并在小鼠中誘導(dǎo)腫瘤消退(Bosco,M.,et al.，通過(guò)外淋巴注射施于帶有腫瘤的小鼠的低劑量IL-4可抑制不健康、外觀上不產(chǎn)生免疫反應(yīng)的腫瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)一種腫瘤特異免疫記憶，J.Immunol.145:3136-43(1990))。但是，它的毒性限制了在人體中使用的劑量(Margolin,K,et al.，晚期腎癌和惡性黑素瘤中重組人白細(xì)胞介素-4的Ⅱ期研究，Immunotherapy15:147-153(1994))。
目前，對(duì)于IL-4的一般結(jié)構(gòu)和功能以及相關(guān)的具有四個(gè)反向平行α-螺旋結(jié)構(gòu)域(A-D)的單體配體已經(jīng)了解。IL-4的三維結(jié)構(gòu)已被闡明(Powers et al.,Science256:1673(1992))。該蛋白包含四個(gè)左手α-螺旋和兩個(gè)b-折疊。
IL-4的受體至少包含兩條鏈。第一條IL-4R鏈，即IL-4Rα，與IL-2R的b鏈以及生長(zhǎng)因子受體超家族中的其它成員具有相當(dāng)?shù)耐葱?Ldzerda et al.,J.Exp.Med.171:861(1990))。第二條IL-4R鏈已經(jīng)被確認(rèn)，它即為IL-2R鏈，或所謂“共同鏈”γc(Russell et al.,Science262:1877(1993))。這兩個(gè)結(jié)合部位很可能參與一個(gè)順序發(fā)生的兩次結(jié)合作用，從而產(chǎn)生一個(gè)1∶1∶1三元復(fù)合物。IL-4中可能負(fù)責(zé)與IL-4Rα結(jié)合的區(qū)域被認(rèn)為位于螺旋A或C或者同時(shí)在螺旋A和C上，而與gc發(fā)生相互作用的區(qū)域被認(rèn)為位于D螺旋上。本理論認(rèn)為，第一個(gè)結(jié)合作用涉及與主要結(jié)合組份IL-4Rα相接觸的配體。該作用不與任何細(xì)胞信號(hào)活性相關(guān)聯(lián)。第二個(gè)結(jié)合作用在IL-4/IL-4Rα復(fù)合物補(bǔ)充了第二條鏈gc時(shí)發(fā)生。在此第二結(jié)合作用發(fā)生之后，出現(xiàn)信號(hào)，細(xì)胞活性得以建立。當(dāng)由第二區(qū)域(細(xì)胞活性所需)介導(dǎo)的結(jié)合作用被減少或消除時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)野生型IL-4的拮抗作用，但又同時(shí)保持著與IL-4Rα的結(jié)合。當(dāng)所定配體通過(guò)第一和第二區(qū)域在結(jié)構(gòu)上與兩個(gè)受體組份作用時(shí)，便發(fā)生激動(dòng)作用。
關(guān)于IL-4的拮抗物已有文獻(xiàn)報(bào)道。具有拮抗功能的IL-4的突變包括IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)IL-4/Y124D(Kruse,N.,Tony,H.P.,Sedald,W.，單一氨基酸替換引起的人體白細(xì)胞介素-4向一種高親和拮抗物的轉(zhuǎn)化，Embo J.11:3237-44,1992)和一種雙突變蛋白質(zhì)IL-4[R121D/Y124D](Tony,H.,et al.，用于高度有效地抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞中白細(xì)胞介素-4依賴性和白細(xì)胞介素-13依賴性反應(yīng)的人體白細(xì)胞介素-4拮抗物的設(shè)計(jì)，Eur.J.Biochem.225:659-664(1994))。該單一突變蛋白質(zhì)是D螺旋上位置124處酪氨酸被天冬氨酸代替的取代物。該雙突變蛋白質(zhì)是D螺旋上位置121處精氨酸被天冬氨酸代替、位置124處酪氨酸被天冬氨酸代替的取代物。D螺旋上這一部分的變異實(shí)際上與第二結(jié)合區(qū)域中相互作用的變化相關(guān)聯(lián)。
顯示野生型IL-4激動(dòng)性或拮抗性的IL-4突變變異體可能有益于治療與IL-4的某種多效性效果相關(guān)的病癥。例如，IL-4的拮抗物有助于治療那些由于IL-4的產(chǎn)生而加重的病癥，如哮喘、過(guò)敏或其它與炎癥反應(yīng)相關(guān)的病癥。IL-4的激動(dòng)劑可能有益于治療那些IL-4的存在與病勢(shì)的好轉(zhuǎn)或減弱相關(guān)的病癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴性糖尿病等自身免疫疾病。這些自身免疫疾病以T輔助細(xì)胞群1型和2型(Th1,Th2)生成時(shí)的極化現(xiàn)象為特征。不成熟CD4+T細(xì)胞依靠刺激過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞因子分化成Th1或Th2小集團(tuán)。一種IL-4激動(dòng)劑可以理想地將分化轉(zhuǎn)向產(chǎn)生所需的T輔助細(xì)胞，即轉(zhuǎn)向Th2，從而使其具有治療效果。
PCT/US93/03613公開(kāi)了一種IL-4變異體，該變異體在一個(gè)α-螺旋區(qū)域中具有Phe-Leu或Tyr-Leu序列，并在位于最接近Phe-Leu或Tyr-Leu序列的上游或下游處的兩個(gè)氨基酸中，有一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸；該變異體由于一個(gè)中性氨基酸被取代成為帶負(fù)電荷的氨基酸而對(duì)IL-4受體具有更強(qiáng)的親和力。同時(shí)公開(kāi)的還有，IL-4的一個(gè)α-螺旋上Trp-Leu或Phe-Leu被兩個(gè)帶負(fù)電荷的殘基特異性取代導(dǎo)致更強(qiáng)的親和性。該變異體是一種IL-4融合蛋白(具有白喉毒素)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及根據(jù)野生型IL-4編號(hào)的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)在野生型IL-4的A或Cα-螺旋鏈的結(jié)合表面至少包含一個(gè)氨基酸取代，從而使該突變蛋白質(zhì)以至少比天然IL-4更高的親和力與IL-4Rα受體結(jié)合。取代優(yōu)選選自A-螺旋上的位置13和16，以及C-螺旋上的位置81和89。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案是位置13上Thr被取代為Asp的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)。本發(fā)明中也對(duì)藥用組合物、為突變蛋白質(zhì)編碼的氨基酸和多核苷酸序列、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、突變蛋白質(zhì)的抗體、以及治療方法進(jìn)行了說(shuō)明。
本發(fā)明還涉及確定一種突變蛋白質(zhì)與某種受體結(jié)合能力的測(cè)定方法，該方法包括以下步驟第一，將一種受體鏈的結(jié)合部分導(dǎo)入包被有鏈霉親和素的閃蒸平板(FlashPlate)，該受體鏈的結(jié)合部分有一個(gè)能夠被鏈霉親和素結(jié)合的肽末端；第二，將一個(gè)經(jīng)放射性標(biāo)記的天然配體導(dǎo)入閃蒸平板，該天然配體對(duì)受體鏈的結(jié)合部分具有親和性；第三，將對(duì)受體鏈的結(jié)合部分具有親和性的突變蛋白質(zhì)配體導(dǎo)入閃蒸平板；達(dá)到平衡后測(cè)定閃蒸平板發(fā)出的信號(hào)量；最后，計(jì)算突變蛋白質(zhì)配體相對(duì)于天然配體的相對(duì)親和性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本方法使用IL-4Rα受體鏈。
本發(fā)明還涉及根據(jù)野生型IL-4編號(hào)的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)包括(a)野生型IL-4D-螺旋鏈上的兩個(gè)取代R121D和Y124D；(b)在野生型IL-4的A或Cα-螺旋鏈的結(jié)合表面至少有一個(gè)氨基酸取代，從而使該突變蛋白質(zhì)以至少比天然IL-4更高的親和力與IL-4Rα受體結(jié)合。取代選自A-螺旋上的位置13和16，以及C-螺旋上的位置81和89。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案是位置13上Thr被取代為Asp的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)。本發(fā)明中也對(duì)藥用組合物、為突變蛋白質(zhì)編碼的氨基酸和多核苷酸序列、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、突變蛋白質(zhì)的抗體、以及治療方法進(jìn)行了說(shuō)明。
插圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1為IL-4配體/受體結(jié)構(gòu)的示意圖。IL-4是一種四螺旋束蛋白，四個(gè)螺旋在此以端視圖示出(A、B、C和D，分別自N-末端至C-末端)。IL-4受體的主要結(jié)合組份為IL-4Rα，它通過(guò)IL-4的A-和C-螺旋與IL-4配體發(fā)生作用。三元復(fù)合物IL-4/IL-4Rα/IL-4Rγ的形成在靶細(xì)胞中誘發(fā)信號(hào)。
圖2為T(mén)13D-IL-4[R121D/Y124D]競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的X-Y曲線圖。圖中示出了T13D-IL-4[R121D/Y124D]“·”在固相結(jié)合測(cè)定中相對(duì)于IL-4[R121D/Y124D]“o”與125I-IL-4競(jìng)爭(zhēng)的能力。用本測(cè)定方法確定的T13D-IL-4[R121D/Y124D]的Kd為0.28nM,IL-4[R121D/Y124D]的Kd為5.0nM。
圖3為類似的X-Y曲線圖，它描繪了由T13D-IL-4[R121D/Y124D]“o”產(chǎn)生的IL-4的拮抗性。圖中示出了T13D-IL-4[R121D/Y124D]相對(duì)于IL-4[R121D/Y124D]“·”對(duì)IL-4誘發(fā)PHA母細(xì)胞增殖的競(jìng)爭(zhēng)能力。用本測(cè)定方法確定的T13D-IL-4[R121D/Y124D]的IC50為2nM,IL-4[R121D/Y124D]的IC50為13nM。
圖4為sIL-4Rα-STX的氨基酸序列表。
圖5為T(mén)13D-IL-4突變蛋白質(zhì)的組成序列表。
圖6為T(mén)13D-IL-4[R121D/Y124D]突變蛋白質(zhì)的組成序列表。
優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明以下描述的是一些新型突變蛋白質(zhì)以及獲得對(duì)于野生型IL-4受體具有較高親和性的新型IL-4突變蛋白質(zhì)的方法。
以下使用的“野生型IL-4”或“wtIL-4”表示天然或重組的人體白細(xì)胞介素-4。正如美國(guó)專利第5,017,691號(hào)所公開(kāi)的，它具有天然人體IL-4中正常出現(xiàn)的129個(gè)氨基酸序列。該專利在此引入作為參考。
以下使用的“IL-4突變蛋白質(zhì)”表示一種多肽，在此多肽上對(duì)人體成熟白細(xì)胞介素-4蛋白質(zhì)進(jìn)行了特異性氨基酸取代。具體地說(shuō)，對(duì)A-或C-螺旋、或更優(yōu)選的是對(duì)那些組成其結(jié)合表面的氨基酸進(jìn)行了特異性氨基酸取代。A螺旋的結(jié)合表面一般大約位于氨基酸位置5到16之間，而在C螺旋中大約在位置77到89之間。對(duì)于這些螺旋鏈的改變?cè)黾恿怂猛蛔兊鞍踪|(zhì)對(duì)IL-4Rα的親和性。根據(jù)分子附加取代最終性質(zhì)的不同，該突變蛋白質(zhì)可能是wtIL-4的激動(dòng)劑或者拮抗物。
以下使用的“IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)”表示一種多肽，在此多肽上對(duì)人體成熟白細(xì)胞介素-4蛋白質(zhì)進(jìn)行了特異性氨基酸取代。具體地說(shuō)，以下所述的拮抗物突變蛋白質(zhì)至少包含三個(gè)獨(dú)立的取代。成對(duì)取代“IL-4[R121D/Y124D]”存在于以下所含的所有拮抗物突變蛋白質(zhì)之中且涉及D螺旋中主鏈的成對(duì)取代，即R121D(Arg成為Asp)和Y124D(Tyr成為Asp)。此外，在A螺旋或C螺旋的結(jié)合表面上能夠提高突變蛋白質(zhì)對(duì)受體α鏈親和性的位置導(dǎo)入了第三個(gè)取代。除了這些變化之外，最優(yōu)選的IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)具有一個(gè)在其它未取代殘基處與野生型IL-4相同的氨基酸序列。
本發(fā)明中IL-4突變蛋白質(zhì)的特征還包括，天然IL-4多肽鏈的其它殘基的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上氨基酸的插入、缺失、取代和修飾。按照本發(fā)明，任何上述插入、缺失、取代和修飾都應(yīng)該生成一種保持其IL-4相關(guān)活性的IL-4突變蛋白質(zhì)。
在IL-4的其它位置(即那些對(duì)突變蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)具有微小影響的位置)，我們推薦保守性修飾和取代。這種保守性取代包括Dayhoff在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜(The Atlas of Protein Sequence andStructure)5(1978)和Argos在EMBO J.,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，屬于以下各組的氨基酸代表保守性變化-ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；-cys、ser、tyr、thr；-val、ile、leu、met、ala、phe；-lys、arg、his；-phe、tyr、trp、his；和-asp、glu、tyr。
我們也推薦不給位點(diǎn)帶來(lái)額外分子間交叉偶聯(lián)或錯(cuò)誤二硫鍵形成的修飾和取代。例如，已知IL-4在野生型位置3、24、46、65、99和127處有六個(gè)cys殘基，其中一個(gè)或多個(gè)可能參與交叉偶聯(lián)作用。取代的選擇應(yīng)盡可能保持野生型蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
我們使用“根據(jù)野生型IL-4編號(hào)”表示對(duì)于某選定氨基酸中位置的確定，野生型IL-4中該氨基酸通常出現(xiàn)這一位置。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)注意到，在對(duì)IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)引入插入或缺失的地方，當(dāng)根據(jù)野生型IL-4編號(hào)時(shí)，通常出現(xiàn)在位置125的Ser(S)在突變蛋白質(zhì)中可能發(fā)生移位。然而，移動(dòng)后Ser(S)的位置可以很容易地通過(guò)檢查以及其側(cè)翼氨基酸與野生型IL-4中側(cè)翼Ser的相互關(guān)系得到確定。
本發(fā)明的IL-4突變蛋白質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法得到。這些方法包括構(gòu)建一個(gè)為本發(fā)明中IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列，然后在經(jīng)過(guò)適當(dāng)轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)這些DNA序列。這一方法可生成本發(fā)明的重組體突變蛋白質(zhì)。然而，雖然不是最優(yōu)選，本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)也可通過(guò)化學(xué)合成、或化學(xué)合成與重組DNA技術(shù)結(jié)合的方式生成。
在一個(gè)生成本發(fā)明突變蛋白質(zhì)的重組法實(shí)施方案中，DNA序列的構(gòu)建通過(guò)分離或合成一個(gè)為野生型IL-4編碼的DNA序列來(lái)完成，然后將蘇氨酸-13的密碼子通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變改為天冬氨酸的密碼子。這一技術(shù)眾所周知。例如，可參照Mark et al.，人體成纖維細(xì)胞干擾素基因的位點(diǎn)特異性誘變，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:5662-66(1984)；美國(guó)專利第4,588,585號(hào)，在此引入作為參考。
構(gòu)建為本發(fā)明中IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列的另一個(gè)方法是化學(xué)合成。例如，一個(gè)為所需IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的基因可以利用寡聚核苷酸合成儀以化學(xué)方式合成。該寡聚核苷酸根據(jù)所需IL-4突變蛋白質(zhì)的氨基酸序列設(shè)計(jì)，同時(shí)，優(yōu)選選擇用于產(chǎn)生重組突變蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)密碼子。在這方面，遺傳密碼眾所周知是簡(jiǎn)并的-即一個(gè)氨基酸可能由多個(gè)密碼子編碼。例如，Phe(F)由兩個(gè)密碼子編碼，TTC或TTT；Tyr(Y)以TAC或TAT編碼；His(H)以CAC或CAT編碼。Trp(W)以單一密碼子TGG編碼。相應(yīng)地也可以看到，對(duì)于某個(gè)為特定IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列，會(huì)有許多DNA簡(jiǎn)并序列為同一IL-4突變蛋白質(zhì)編碼。例如，可以看到，除了SEQ ID NO:9中表示的突變蛋白質(zhì)T13D-IL-4[R121D/Y124D]的優(yōu)選DNA序列以外，還有許多簡(jiǎn)并DNA序列為所示的IL-4突變蛋白質(zhì)編碼。我們認(rèn)為這些簡(jiǎn)并DNA序列在本發(fā)明范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明文字記述中的“有關(guān)的簡(jiǎn)并變異型”表示所有為某一特定突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列。
本發(fā)明中為IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列，無(wú)論是通過(guò)定點(diǎn)誘變、化學(xué)合成、還是其它方法制備而成，都可能包含或不包含一個(gè)為信號(hào)序列編碼的DNA序列。如果存在，這個(gè)信號(hào)序列應(yīng)該是一個(gè)被選用進(jìn)行IL-4突變蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞所能夠識(shí)別的序列。它可以是原核的、真核的、或是兩者的組合。它也可以是天然IL-4突變蛋白質(zhì)的信號(hào)序列。信號(hào)序列的包含與否取決于IL-4突變蛋白質(zhì)是否需要從產(chǎn)生它的重組細(xì)胞中分泌出來(lái)。如果選定的細(xì)胞是原核的，DNA序列一般優(yōu)選不用于信號(hào)序列的編碼，但是包括一個(gè)指導(dǎo)表達(dá)的N-末端甲硫氨酸。如果選定的細(xì)胞是真核的，一般優(yōu)選有一個(gè)信號(hào)序列被編碼，最優(yōu)選的是使用野生型IL-4的信號(hào)序列。
按照本發(fā)明合成一個(gè)為IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的基因時(shí)，可以利用標(biāo)準(zhǔn)的方法。例如，完整的氨基酸序列可以用于建立一個(gè)反向翻譯基因(back-translated gene)。可以合成一個(gè)包含為IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成幾個(gè)為所需多肽中特定部分編碼的小寡聚核苷酸，然后將它們連接起來(lái)。每個(gè)單獨(dú)的寡聚核苷酸通常包含5′或3′突出端，用于互補(bǔ)裝配。
本發(fā)明中為IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列一旦(通過(guò)合成、定點(diǎn)誘變或其它方法)裝配后，即被插入一個(gè)表達(dá)載體，然后在所需的轉(zhuǎn)化宿主中與適于IL-4突變蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)控制序列有效地連接在一起。適當(dāng)?shù)难b配通過(guò)核苷酸測(cè)序、限制性酶切圖譜、以及在適當(dāng)宿主中一個(gè)具生物活性的多肽的表達(dá)得以確認(rèn)。本領(lǐng)域眾所周知，要想在一個(gè)宿主中得到一個(gè)轉(zhuǎn)染基因的高表達(dá)水平，就必須將這個(gè)基因有效地連接到能夠在所選宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯表達(dá)控制序列上。
表達(dá)控制序列和表達(dá)載體的選擇取決于宿主的選擇?？梢允褂枚喾N不同的表達(dá)宿主/載體組合。譬如，原核宿主的有效表達(dá)載體包括含有來(lái)自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和細(xì)胞肥大病毒的表達(dá)控制序列的載體。細(xì)菌宿主的有效表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒(包括col El、pCR1、pER32z、pMB9以及它們的衍生物)、宿主范圍更廣的質(zhì)粒，如RP4、噬菌體DNAs(如λ噬菌體的多種衍生物，如NM989)、以及其它DNA噬菌體，如MI3和絲狀單鏈DNA噬菌體。酵母細(xì)胞的有效表達(dá)載體包括2m質(zhì)粒及其相關(guān)的衍生物。昆蟲(chóng)細(xì)胞的有效表達(dá)載體包括pVL941。我們推薦使用pFastBacTM1(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。Cate et al.，牛和人體繆勒氏抑制物質(zhì)基因的分離以及人體基因在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，Cell,45,pp.685-98(1986)。
此外，多種表達(dá)控制序列中的任何一種都可用于這些載體。這些有效表達(dá)控制序列包括與前述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相關(guān)的表達(dá)控制序列。例如，有效表達(dá)控制序列的范例包括，SV40或腺病毒的早期和晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、λ噬菌體的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域，如PL、fd衣殼蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子如PhoA、酵母a-接合系統(tǒng)的啟動(dòng)子、桿狀病毒的多角體啟動(dòng)子、以及其它已知的、控制原核或真核細(xì)胞或它們的病毒的基因表達(dá)的序列及其各種組合體。
任何合適的宿主都可用于生成本發(fā)明的IL-4突變蛋白質(zhì)，其中包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物或其它合適的動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系，以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。更具體地講，這些宿主可以包括眾所周知的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、真菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞如Spodoptera frugiperda(SF9)、動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)和小鼠細(xì)胞如NS/O、非洲綠猴細(xì)胞如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BNT10、人體細(xì)胞、以及組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)，我們推薦在培養(yǎng)中使用CHO細(xì)胞和COS7細(xì)胞，特別是使用CHO細(xì)胞系的CHO(DHFR-)。
當(dāng)然應(yīng)該明白，在表達(dá)所述DNA序列時(shí)，不是所有的載體和表達(dá)控制序列都能起到同樣好的作用。也不是所有宿主都對(duì)同一表達(dá)系統(tǒng)起著同樣好的作用。但是，技術(shù)人員無(wú)需試驗(yàn)，在這些載體、表達(dá)控制序列和宿主中做出適當(dāng)?shù)倪x擇。例如，選擇載體時(shí)，必須同時(shí)考慮宿主，因?yàn)檩d體必須在宿主中復(fù)制。載體的拷貝數(shù)量、控制該拷貝數(shù)量的能力、以及被載體編碼的任何其它蛋白質(zhì)，如抗生素標(biāo)記的表達(dá)也應(yīng)該加以考慮。譬如，本發(fā)明中優(yōu)選使用的載體包括那些允許為IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA在拷貝數(shù)量上得以擴(kuò)增的載體。這些可擴(kuò)增型載體在本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知。譬如，它們包括能夠通過(guò)DHFR擴(kuò)增而得到擴(kuò)增的載體(例如參照Kaufman，美國(guó)專利第4,470,461號(hào)，Kaufmanand Sharp，模式二氫葉酸還原酶cDNA基因的構(gòu)建用于有效表達(dá)的信號(hào)分析，Mol.Cell.Biol.,2:1304-19(1982))，或谷氨酰胺合酶(“GS”)擴(kuò)增(例如參照美國(guó)專利第5,122,464號(hào)和歐洲公開(kāi)申請(qǐng)EPO338841)。
選擇表達(dá)控制序列時(shí)，應(yīng)考慮一系列因素。譬如，它們包括序列的相對(duì)強(qiáng)度、它的可控制性、以及它與本發(fā)明中為IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的實(shí)際DNA序列的相容性等。特別在考慮潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)更是如此。宿主選擇應(yīng)考慮它們與所選載體的兼容性、由本發(fā)明中DNA序列編碼的產(chǎn)物的毒性、它們的分泌特征、它們準(zhǔn)確折疊多肽的能力、它們的發(fā)酵或培養(yǎng)要求、以及由DNA序列編碼的產(chǎn)物純化的便利性。
從這些參數(shù)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選出各種載體/表達(dá)控制序列/宿主的組合，這些組合將在發(fā)酵或大規(guī)模動(dòng)物培養(yǎng)時(shí)表達(dá)所需DNA序列，譬如，利用CHO細(xì)胞或COS7細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明得到的IL-4突變蛋白質(zhì)，可根據(jù)用以產(chǎn)生突變蛋白質(zhì)的宿主有機(jī)體的不同而糖基化或非糖基化。如果細(xì)菌被選擇作為宿主，生成的IL-4突變蛋白質(zhì)就會(huì)是非糖基化。與此相反，真核細(xì)胞會(huì)使IL-4突變蛋白質(zhì)糖基化，盡管也許與天然IL-4的糖基化方式不同。
由轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的IL-4突變蛋白質(zhì)可根據(jù)任何適當(dāng)方法得到純化?，F(xiàn)已知有各種方法可以純化IL-4。例如參照美國(guó)專利第5,013,824號(hào)、第5,017,691號(hào)和WO9604306-A2。我們推薦使用免疫親和純化法。例如參照Okamura et al.，人體類成纖維細(xì)胞干擾素免疫吸附柱層析和N-末端氨基酸序列，Biochem,19:3831-35(1980)。
本發(fā)明的IL-4突變蛋白質(zhì)的生物活性，可以通過(guò)本領(lǐng)域中任何已知合適方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定包括在EP-B1-41313中所描述的抗病毒活性的抗體中和、蛋白激酶、寡腺苷酸2,5-A合酶或磷酸二酯酶活性的誘導(dǎo)。測(cè)定還包括免疫調(diào)節(jié)測(cè)定(例如參照美國(guó)專利第4,753,795號(hào))、生長(zhǎng)抑制測(cè)定、T細(xì)胞增殖、IL-6的誘導(dǎo)和內(nèi)皮細(xì)胞中MCP-1的誘導(dǎo)、以及測(cè)定與表達(dá)白細(xì)胞介素-4受體的細(xì)胞的結(jié)合。同時(shí)參照Spits H,Yssel H,Takebe Y,et al.，重組白細(xì)胞介素-4促進(jìn)人體T細(xì)胞的生長(zhǎng)，J.Immunol.139:1142-47(1987)。
本發(fā)明的IL-4突變蛋白質(zhì)的給藥劑量大約與野生型天然或重組IL-4用于治療時(shí)的劑量相同或更大。優(yōu)選給予有效量的IL-4突變蛋白質(zhì)?！坝行Я俊北硎灸軌蚍乐够驕p輕所治療病癥或適應(yīng)癥的嚴(yán)重程度或擴(kuò)散的藥量。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很顯然，IL-4突變蛋白質(zhì)的有效量特別取決于疾病、劑量、IL-4突變蛋白質(zhì)的給藥時(shí)間計(jì)劃、IL-4突變蛋白質(zhì)單獨(dú)使用還是與其它治療藥劑結(jié)合使用、組合物在血清中的半衰期、以及患者的一般健康狀況。
優(yōu)選以包含可藥用載劑的組合物形式給予IL-4突變蛋白質(zhì)?！翱伤幱幂d劑”表示在給藥患者中不引起任何不適當(dāng)作用的載劑。這些可藥用的載劑在本領(lǐng)域中眾所周知。我們推薦pH7.0下使用2％HSA/PBS。
本發(fā)明中的IL-4突變蛋白質(zhì)可以通過(guò)眾所周知的方法配制成藥用組合物。例如，在此作為參考收入的E.W.Martin的Remington′sPharmaceutical Science中描述了合適的制劑。IL-4突變蛋白質(zhì)的藥用組合物可配制成各種類型，包括液體、凝膠體、凍干或其它合適形式。優(yōu)選形式取決于所治療的特殊病癥，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
IL-4突變蛋白質(zhì)的藥用組合物可通過(guò)口服、噴霧、靜脈、肌肉、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射、或其它認(rèn)可的方式給予。優(yōu)選給藥方式取決于所治療的特殊病癥，而且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是很顯然的。IL-4突變蛋白質(zhì)的藥用組合物可以與其它治療藥劑結(jié)合使用。這些藥劑可以作為同一藥用組合物的一部分加入，也可以與IL-4突變蛋白質(zhì)分開(kāi)，同時(shí)或按照任何其它認(rèn)可的時(shí)間計(jì)劃單獨(dú)給予。此外，IL-4突變蛋白質(zhì)的藥用組合物可作為其它療法的添加劑使用。
因此，本發(fā)明提供了治療免疫性疾病、癌癥或腫瘤、異常細(xì)胞生長(zhǎng)、或?qū)θ魏魏线m動(dòng)物進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的組合物和方法，所述動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。如同前面背景一節(jié)所述，IL-4具有多種作用。其中包括T細(xì)胞增殖和T輔助細(xì)胞分化的刺激、人體B-細(xì)胞活化及增殖、以及淋巴因子指導(dǎo)的免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)。對(duì)淋巴系統(tǒng)的作用包括提高B細(xì)胞上MHCⅡ型抗原的表達(dá)(Noelle,R.,et al.，靜止B細(xì)胞Ia抗原表達(dá)的提高B細(xì)胞生長(zhǎng)因子的新作用，PNAS USA,81:6149-53(1984))和CD23的表達(dá)(Kikutani,H.,et al.,人體淋巴細(xì)胞免疫球蛋白受體的分子結(jié)構(gòu)，Cell47:657-61(1986))。由此，IL-4生物學(xué)表明，它在包括哮喘的過(guò)敏癥及過(guò)敏性炎癥疾病的發(fā)病中可能起著重要的作用。T輔助細(xì)胞1型(Th1)和2型(Th2)參與免疫反應(yīng)。受到刺激的Th2細(xì)胞可分泌IL-4，阻止Th1的進(jìn)展。任何與Th2關(guān)聯(lián)的疾病都可以用IL-4拮抗物加以控制，而任何與Th1關(guān)聯(lián)的疾病都可以用IL-4激動(dòng)劑加以控制。
另一個(gè)預(yù)想是將為本發(fā)明中IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的DNA序列用于基因療法應(yīng)用。預(yù)想的IL-4拮抗物基因療法應(yīng)用包括對(duì)那些可能由IL-4引起或加重的現(xiàn)有臨床病癥，如與炎癥相關(guān)的病癥(哮喘)或過(guò)敏癥的治療。激動(dòng)劑的適用癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴性糖尿病等自身免疫病癥。這些自身免疫病癥的特征是T輔助細(xì)胞群體生成時(shí)向著1型T輔助細(xì)胞(Th1)生成的極化。
通過(guò)基因治療的局部施用拮抗物或激動(dòng)劑IL-4突變蛋白質(zhì)可以向靶區(qū)域提供治療性藥劑，同時(shí)也可避免與激動(dòng)劑的非特異性給藥相關(guān)的潛在毒性問(wèn)題。體外和體內(nèi)的基因療法方法都已有所預(yù)想?，F(xiàn)已知有幾種將具有潛在療效的基因轉(zhuǎn)移到特定細(xì)胞群體的方法。例如參照Mulligan，基因療法的基礎(chǔ)科學(xué)，Science,260:926-31(1993)。這些方法包括1)直接基因轉(zhuǎn)移。例如參照Wolff et al.,活體內(nèi)向小鼠肌肉的直接基因轉(zhuǎn)移，Science,247:1465-68(1990)；2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。例如參照Caplen et al.，向囊纖維變性患者鼻上皮的脂質(zhì)體介導(dǎo)CFTR基因轉(zhuǎn)移，Nature Med.3:39-46(1995)；Crystal，作為藥物的基因，Nature Med.1:15-17(1995)；Gao和Huang，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效轉(zhuǎn)染的新型陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，Biochem.Biophys.Res.Comm.,179:280-85(1991)；3)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。例如參照Kay et al.，血友病B的體內(nèi)基因療法IX-因子缺乏犬中的持久局部修正，Science,262:117-19(1993)；Anderson，人體基因療法，Science,256:808-13(1992)。
4)DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這些DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選以Ad-2或Ad-5為基礎(chǔ)的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選以單純皰疹病毒為基礎(chǔ)的載體)、以及細(xì)小病毒(優(yōu)選以“缺陷性”或非自發(fā)性細(xì)小病毒為基礎(chǔ)的載體，更優(yōu)選以腺相關(guān)病毒為基礎(chǔ)的載體，最優(yōu)選以AAV-2為基礎(chǔ)的載體)。例如參照Ali et al.,DNA病毒作為基因療法載體的利用，Gene Therapy,1:367-84(1 994)；在此作為參考收入的美國(guó)專利第4,797,368號(hào)；和在此作為參考收入的美國(guó)專利第5,139,941號(hào)。
對(duì)用于感興趣基因轉(zhuǎn)移的一個(gè)特定載體系統(tǒng)的選擇取決于多種因素。一個(gè)重要的因素是靶細(xì)胞群的性質(zhì)。盡管對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒已有深入研究，而且已用于多種基因療法的應(yīng)用，但是這些載體一般不適合用于非分裂性細(xì)胞的感染。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒似乎具有潛在的致腫瘤性。
腺病毒具有優(yōu)勢(shì)，他們擁有廣泛的宿主范圍，能夠感染靜止或末期分化的細(xì)胞，如神經(jīng)元或肝細(xì)胞，而且似乎基本屬于非致腫瘤性。例如參照Ali et al.，同上，p.367。腺病毒似乎不與宿主基因組整合。因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌旧w外，所以發(fā)生插入誘變的危險(xiǎn)得到大幅度降低。Ali et al.，同上，p.373。
腺相關(guān)病毒顯示出與以腺病毒為基礎(chǔ)的載體相似的優(yōu)點(diǎn)。然而，AAVs顯示了對(duì)人體染色體19的位點(diǎn)特異性整合。Ali et al.，同上，p.377。
根據(jù)這一實(shí)施方案，在診斷時(shí)或診斷后立即向需要的患者提供本發(fā)明IL-4突變蛋白質(zhì)編碼DNA的基因療法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，任何適當(dāng)?shù)?、包含IL-4突變蛋白質(zhì)的DNA的基因治療載體都可以按照這一實(shí)施方案使用。構(gòu)建所述載體的技術(shù)方法已有所知。例如參照Ohno et al.，同上，p.784；Chang et al.，同上p.522。含有IL-4突變蛋白質(zhì)DNA的載體向靶位點(diǎn)的引入，可通過(guò)已知技術(shù)，如Ohno et al.，同上，p.784中所描述的技術(shù)完成。
為了更好地理解本發(fā)明，以下舉出一些例子。這些例子僅用于解釋目的，而不應(yīng)以任何方式被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例概況丙氨酸取代通過(guò)定點(diǎn)誘變引入野生型IL-4序列，取代位置與預(yù)測(cè)位于IL-4A-或C-螺旋表面的殘基相對(duì)應(yīng)(Smith LJ；Redfield C；Boyd J；Lawrence GM；Edwards RG；Smith RA和Dobson CM)，人體白細(xì)胞介素4。四螺旋束蛋白質(zhì)的溶液結(jié)構(gòu)，J.Mol.Biol.,224(4):899-904(1992)。這些殘基很可能介導(dǎo)IL-4與IL-4Rα相互作用(圖1)，丙氨酸取代對(duì)IL-4突變蛋白質(zhì)與IL-4Rα結(jié)合親和性的影響表明，經(jīng)取代的殘基可能參與結(jié)合作用。通過(guò)對(duì)那些丙氨酸取代時(shí)對(duì)親和性產(chǎn)生中等效果的殘基進(jìn)行廣泛的取代，鑒別親和性改善上的差異。組合時(shí)，那些對(duì)親和性有所改善的變異可能綜合提高IL-4(或IL-4相關(guān)肽)對(duì)IL-4Rα的親和性。親和性的提高應(yīng)對(duì)應(yīng)著效價(jià)的提高。
突變蛋白質(zhì)通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生，在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)，純化至同質(zhì)，通過(guò)氨基酸分析進(jìn)行定量，然后利用受體結(jié)合測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)。用于本研究的成熟人體IL-4的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)如以下所示。其中位置1處的His代表成熟多肽的N-末端。A-、C-和D-螺旋分別在其開(kāi)始處標(biāo)明且標(biāo)劃下線。適當(dāng)取代時(shí)能產(chǎn)生高親和性變異體的氨基酸用黑體字表示A:→His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr20 25 30Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe35 40 45Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu50 55 60Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg65 70 75His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu80 85 90Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn95 100 105D: →Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met110 115 120Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser125將本研究中檢出的變異引入一個(gè)已知的人體IL-4的拮抗物變異體，該變異體在D螺旋上包含兩個(gè)取代，即R121D和Y124D(Tony HP,et al.,用于高度有效地抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞中白細(xì)胞介素-4依賴性和白細(xì)胞介素-13依賴性反應(yīng)的人體白細(xì)胞介素-4拮抗物的設(shè)計(jì)，Eur.J.Biochem,225(2):659-65(1994)，該突變蛋白質(zhì)以“IL-4[R121D/Y124D]”命名)。突變蛋白質(zhì)在桿狀病毒系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，純化至同質(zhì)，然后利用固相IL-4Rα受體結(jié)合測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)IL-4Rα親和性改善的生物學(xué)意義在T細(xì)胞增殖測(cè)定中進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由于IL-4[R121D/Y124D]突變蛋白質(zhì)是IL-4的拮抗物，因此，對(duì)IL-4Rα親和性的改善應(yīng)在較高親和性拮抗物突變蛋白中導(dǎo)致較低的IC50值(IC50表示抑制某特定激動(dòng)劑反應(yīng)50％所需的拮抗物濃度)。
實(shí)施例1.突變蛋白質(zhì)的生成。如Kunkel TA、Roberts JD和ZakourRA所述(“無(wú)需表型選擇的、快速和有效的定點(diǎn)誘變”，Methods Enzymol154:367-382(1987))，突變蛋白質(zhì)通過(guò)使用包含所需變異的相應(yīng)密碼子的引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變而產(chǎn)生。簡(jiǎn)單地說(shuō)，是利用同一位點(diǎn)將包含限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XbaⅠ的人體IL-4cDNA，亞克隆至M13噬菌體載體M13mp19(New England Biolabs,Beverly,MA)。野生型IL-4cDNA通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)從一個(gè)來(lái)自mRNA的cDNA庫(kù)中獲得，該mRNA是從經(jīng)過(guò)24小時(shí)佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯(10ng/ml)誘導(dǎo)的人體外周血淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)的。用于IL-4開(kāi)放閱讀框5′端的PCR引物為5′-CGC GGA TCC ATG GGT CTC ACC TCC-3′(SEQ ID NO:2)，用于IL-4開(kāi)放閱讀框的3′端的PCR引物為5′-CGC TCT AGA CTA GCT CGA ACA CTT TGA AT-3′(SEQ ID NO:3)。
限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ(5′端)和XbaⅠ(3′端)被整合入每一寡聚核苷酸，以斜體字表示。使用的PCR條件為94℃下1分鐘、58.7℃下1分鐘及72℃下1分鐘，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。如此得到的正確的IL-4cDNA序列按照生產(chǎn)廠商的說(shuō)明，使用Sequenase測(cè)序試劑盒(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL)進(jìn)行測(cè)序加以確認(rèn)。包含尿苷的單鏈DNA(U-DNA)通過(guò)利用包含IL-4cDNA的M13mp19轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株CJ236(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)而獲得。定點(diǎn)誘變一般使用的引物包含15個(gè)與誘變對(duì)象密碼子的模板U-DNA5′端同源的核苷酸、引入所需改變的核苷酸、以及另外10個(gè)與最后改變的核苷酸模板U-DNA 3′端同源的核苷酸。D螺旋上的突變-Arg-121成為Asp及Tyr-124成為Asp-被引入野生型IL-4序列。命名為IL-4[R121D/Y124D]的該變異體尿苷DNA通過(guò)以上所述方法生成。這些研究中的所有突變體均使用IL-4[R121D/Y124D]模板生成。
引物按生產(chǎn)廠商規(guī)定的步驟用T4多核苷酸激酶(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)進(jìn)行磷酸化。然后將磷酸化的引物與U-DNA模板退火，然后用T7 DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)按照生產(chǎn)廠商(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)說(shuō)明的步驟延長(zhǎng)。大腸桿菌菌株DH5aTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的細(xì)胞用5微升反應(yīng)混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后置于含有0.7％瓊脂的“LB培養(yǎng)基”中。37℃下溫育后，從每一誘變反應(yīng)中取出三個(gè)單獨(dú)的噬斑轉(zhuǎn)入2毫升“LB培養(yǎng)液”，將其擴(kuò)增，然后在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。單鏈DNA按生產(chǎn)廠商規(guī)定用M13純化試劑盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)進(jìn)行分離，包含所需變異的克隆按生產(chǎn)廠商規(guī)定的步驟，使用Sequenase測(cè)序試劑盒(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL)進(jìn)行單鏈DNA測(cè)序加以確認(rèn)。與包含正確IL-4變異序列的噬斑相對(duì)應(yīng)的復(fù)制型DNA(雙鏈型M13噬菌體)用Qiagen質(zhì)粒Miniprep試劑盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)進(jìn)行分離。IL-4突變蛋白質(zhì)cDNA用BamHⅠ和XbaⅠ從純化后的復(fù)制型DNA中分離出來(lái)，然后亞克隆至質(zhì)粒載體pFastBacTM1(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。亞克隆之后，重組桿狀病毒DNA(以下稱Bacmid)按照生產(chǎn)廠商說(shuō)明的步驟，通過(guò)將包含突變蛋白質(zhì)cDNA的pFastBacTM1轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH10BacTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)而生成。突變蛋白質(zhì)在Spodopterafruipperda(Sf)9細(xì)胞中使用Bac-to-Bac‰(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。所有昆蟲(chóng)細(xì)胞的溫育都在28℃下進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，2毫升Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)使用CellFECTINTM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)而被5微升重組Bacmid轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染60小時(shí)后收集上清液，該上清液在Grace溶液中用于感染100-200毫升的1×106Sf9細(xì)胞/毫升培養(yǎng)物(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)。按照生產(chǎn)廠商規(guī)定的步驟，感染48-60小時(shí)后，使用帶GSA轉(zhuǎn)頭的SorvallRC-5B離心機(jī)(Dupont Instrument Co.,Wilmington,DE)在5000rpm下離心10分鐘，收集上清液后測(cè)定病毒效價(jià)(通常所獲測(cè)定值＞1×108噬斑形成單位/毫升)。對(duì)于蛋白質(zhì)的生成，將2-3×106Sf9細(xì)胞/毫升在500毫升SF900Ⅱ溶液(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中感染，感染復(fù)數(shù)為4-10。感染60-72小時(shí)后，使用帶GSA轉(zhuǎn)頭的SorvallRC-5B離心機(jī)(Dupont Instrument Co.,Wilmington,DE)在5000rpm下離心10分鐘，收集上清液后用0.2μM無(wú)菌過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾。
實(shí)施例2.突變蛋白質(zhì)的純化。抗人體IL-4單克隆抗體C400.1和C400.17以重組人體IL-4(Genzyme Diagnostics,Cambridge,MA)為免疫原，按照標(biāo)準(zhǔn)方法從小鼠中生成，該單克隆抗體作為腹水生成、純化并按生產(chǎn)廠商規(guī)定的步驟偶聯(lián)到被CNBr活化的Sepharose瓊脂糖上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。將由Sf9細(xì)胞經(jīng)含有各自IL-4突變蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒感染產(chǎn)生的Sf9細(xì)胞上清液裝入1毫升抗IL-4 MAb偶聯(lián)Sepharose瓊脂糖柱內(nèi)，用pH8.3的100mM NaHCO3和500mM NaCl沖洗，之后水洗除去鹽份。然后用8個(gè)柱體積的100mM甘氨酸、pH3.0進(jìn)行洗脫。級(jí)份用裝有0.1體積1M、pH8.0三羥甲基氨基甲烷(Tris)的硅化小瓶收集。突變蛋白質(zhì)使用Dynamax-300C18柱(Rainin Instrument Co.,Woburn,MA)和梯度為0-100％的緩沖液A到B(緩沖液A，水；緩沖液B，乙酸腈，0.1％三氟乙酸)，經(jīng)反相層析進(jìn)一步提純。級(jí)份用SDS-PAGE評(píng)定，包含突變蛋白質(zhì)的級(jí)份冷凍干燥、儲(chǔ)藏，重新懸浮于無(wú)菌磷酸緩沖鹽水(PBS；l0mM NaPO4,137mM NaCl,pH7.6)中后進(jìn)行測(cè)定。如在SDS-PAGE(銀染色)中所觀察到的，如此提純的突變蛋白質(zhì)通常為單帶，定量測(cè)定利用氨基酸分析進(jìn)行(通常準(zhǔn)確度＞90％)。
實(shí)施例3.受體結(jié)合測(cè)定。為了確定取代對(duì)IL-4突變蛋白質(zhì)與IL-4Rα結(jié)合能力的影響(Ldzerda,R L.,et al.,人體白細(xì)胞介素4受體賦予生物反應(yīng)性并定義新的受體超家族，J.Exp.Med.171:861-873(1990))，我們?cè)O(shè)計(jì)了固相受體結(jié)合測(cè)定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，突變蛋白質(zhì)的親和性以它們從結(jié)合于固相表面的IL-4Rα中置換出放射性標(biāo)記IL-4的能力進(jìn)行測(cè)定。圖2示出了相應(yīng)于IL-4[R121D/Y124D],T13D-IL-4[R121D/Y124D]在固相受體結(jié)合測(cè)定中與125Ⅰ-IL-4競(jìng)爭(zhēng)的能力。測(cè)定規(guī)劃使用包被有鏈霉親和素的96孔FlashPlate(DupontNEN,Boston,MA)進(jìn)行，即IL-4Rα的胞外區(qū)域通過(guò)一個(gè)被加入IL-4Rα胞外區(qū)域能與鏈霉親和素結(jié)合的肽標(biāo)記結(jié)合于平板。閃蒸平板包含一個(gè)滲入平板塑料內(nèi)的閃爍體，該閃爍體具有一種性質(zhì)，即只有那些非常接近平板表面的放射性標(biāo)記化合物會(huì)激發(fā)閃爍。將含有放射性標(biāo)記IL-4和IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)的樣品加入每個(gè)孔，溫育至平衡。因?yàn)槲唇Y(jié)合的放射性標(biāo)記化合物不引發(fā)閃爍信號(hào)，所以在測(cè)定結(jié)合于每一孔中的放射活性之前無(wú)需經(jīng)過(guò)沖洗步驟。因此，所測(cè)定的放射活性代表了結(jié)合于IL-4Rα的放射性標(biāo)記IL-4。同時(shí)，經(jīng)過(guò)考慮所加入的未經(jīng)放射性標(biāo)記的IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)的量，可以計(jì)算出未經(jīng)放射性標(biāo)記的IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)對(duì)IL-4Rα的親和性。每一測(cè)定中的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)與每一突變蛋白質(zhì)同時(shí)測(cè)定IL-4[R121D/Y124D]親和性得以建立。由此能夠獲得親和性的特定相對(duì)測(cè)定值，從而能夠?qū)我蝗〈鷮?duì)IL-4Rα親和性的影響進(jìn)行評(píng)估。
IL-4Rα胞外區(qū)域利用PCR從Jurkat細(xì)胞lgt11文庫(kù)(StratageneCloning Systems,La Jolla,CA)獲得。用于分離IL-4Rα胞外區(qū)域的IL-4Rα開(kāi)放閱讀框5′端的PCR引物為5′GGC ATG GAT CCA TGG GGT GGC TTT GCT CTG G3′(SEQID NO:4)；用于IL-4Rα胞外區(qū)3′端的開(kāi)放閱讀框的PCR引物為5′AAG CCG CTA GCG CTG TGC TGC TCG AAG GGC 3′(SEQ ID NO:5)。使用的PCR條件為94℃下1分鐘，65.8℃下1分鐘，72℃下1分鐘，共進(jìn)行三十個(gè)循環(huán)。生成的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Eco47Ⅲ消化，然后亞克隆至pBluescript載體((Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)。該載體以同樣的酶進(jìn)行消化，該載體包含具有與序列Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:6)相應(yīng)的密碼子的DNA。據(jù)報(bào)道，該序列與鏈霉親和素結(jié)合(SchmidtTG和Skerra,A.,用于功能性Ig Fv片段檢出及純化的C-末端親和性肽的隨機(jī)肽文庫(kù)輔助工程，Protein Eng.6(1):109-122(1992))。如此產(chǎn)生的IL-4Rα胞外區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO:7，它在胞外區(qū)域的C-末端為肽序列Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:6)編碼，并命名為sIL-4Rα-STX(位置1處的Met為成熟IL-4Rα的N-末端)。
sIL-4Rα-STX蛋白質(zhì)使用桿狀病毒系統(tǒng)以與IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)同樣的方法生成，通過(guò)已經(jīng)介紹的IL-4偶聯(lián)基質(zhì)親和層析進(jìn)行純化(Kruse N,et al.，“人體白細(xì)胞介素4的兩個(gè)獨(dú)特的功能位點(diǎn)通過(guò)受體結(jié)合或受體活化損傷的變異體得以確認(rèn)?！盓MBO J.,12(13)p5121-9(1993))，然后儲(chǔ)存于PBS。IL-4基質(zhì)的生成按照生產(chǎn)廠商(Pharmacia,Uppsala,Sweden)指定的步驟，通過(guò)將大腸桿菌中產(chǎn)生的IL-4偶聯(lián)到CNBr Sepharose4B上進(jìn)行。用100微升在100mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.1％BSA、pH7.0中的2微克/毫升的sIL-4Rα-STX包被已經(jīng)包被有鏈霉親和素的FlashPlate(DuPont NEN,Boston,MA),20℃下進(jìn)行2小時(shí)，用pH7.6的PBS、0.1％BSA沖洗后，與200pM125Ⅰ-IL-4(DuPont NEN,Boston,MA)以及各種不同濃度的IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)一起，于100微升PBS和0.1％BSA中培養(yǎng)1.5小時(shí)，一式四組，pH7.6，溫度為20℃。測(cè)定至少重復(fù)兩次。IL-4[R121D/Y124D]作為內(nèi)在參照與同一FlashPlate中的每種突變蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行滴定。結(jié)合的放射性活性用TopCount閃爍計(jì)數(shù)器(Packard Instrument Co.,Meriden,CT)測(cè)量，Kd值用配體程序計(jì)算(Munson,P.J.和Rodbard,D.，“配體結(jié)合數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)化分析”。Meth.Enzymol.,92p543-576(1983))。其中Kd值誤差為2-20％,以％CV表示。結(jié)果通過(guò)從每一測(cè)定平板獲得的數(shù)據(jù)以Kd值突變蛋白質(zhì)/Kd值IL-4[R121D/Y124D]比率表示。所測(cè)Kd值的差異顯示出各個(gè)突變蛋白質(zhì)對(duì)IL-4Rα親和性的相對(duì)提高(即突變蛋白質(zhì)Kd值/IL-4[R121D/Y124D]Kd值＜1)或各個(gè)突變蛋白質(zhì)對(duì)IL-4Rα親和性的相對(duì)降低(即突變蛋白質(zhì)Kd值/IL-4[R121D/Y124D]Kd值＞1)。
實(shí)施例4.1°T細(xì)胞增殖測(cè)定。原代T細(xì)胞來(lái)自正常捐獻(xiàn)者的新鮮血液，使用Ficoll-PaquePlus(Pharmacia,Uppsala,Sweden)離心提純，提純方法基本按照Kruse,N.,Tony,H.P.和Sebald,W.所述，“單一氨基酸替換引起的人IL-4向一種高親和性拮抗物的轉(zhuǎn)化”,Embo J.,11:3237-44(1992)。提純的外周血單核細(xì)胞與10微克/毫升植物凝血素(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)溫育7天，離心收集，然后用RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)清洗。5×104活化T細(xì)胞/孔(PHA-母細(xì)胞)在96孔平板中與不同量的IL-4或突變蛋白質(zhì)一起置于RPMI培養(yǎng)基中溫育48小時(shí)，溫度為37℃。該RPMI培養(yǎng)基包含10％胎牛血清、10mM HEPES,pH7.5、2mM L-谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素G、以及100微克/毫升硫酸鏈霉素。以1μCi3H-胸苷(Dupont NEN,Boston,MA)/孔進(jìn)行6小時(shí)脈沖處理后收集。放射活性用TopCount閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定(Packard Instrument Co.,Meriden,CT)。
實(shí)施例5.丙氨酸取代對(duì)IL-4與IL-4Rα親和性的影響。丙氨酸取代IL-4A-和C-螺旋表面暴露殘基對(duì)IL-4與IL-4Rα親和性的影響示于表Ⅰ。
表Ⅰ．IL-4A-和C-螺旋表面暴露殘基丙氨酸掃描結(jié)果。*
*所有突變均附加于IL-4[R121D/Y124D]主鏈。由于丙氨酸取代一般不引起蛋白質(zhì)折疊的結(jié)構(gòu)變化，因此對(duì)活性的影響，在此為對(duì)親和性的影響可以認(rèn)為是由于被取代側(cè)鏈的喪失而引起的(Cunningham,B.C.,Wells,J.A.，通過(guò)丙氨酸掃描誘變進(jìn)行的hGH受體相互作用的高分辨率表位定位，Science244(4908):1081-5(1989))。丙氨酸取代引起的親和性上微小的變化(如大約2倍)表示殘基/被取代位置不參與相互作用，而大的影響(如大于100倍)則表示殘基/被取代位置對(duì)相互作用至關(guān)重要(Lowman HB,et al.，“通過(guò)單價(jià)噬菌體顯示選擇高親和性結(jié)合蛋白”。Biochemistry30(45)p10832-8(1991))。Lowman等(出處同前)發(fā)現(xiàn)，除最敏感的殘基外，這些由于丙氨酸取代而在結(jié)合中顯示中等作用的殘基也參與所研究的相互作用。
將這些結(jié)論與IL-4的A-和C-螺旋丙氨酸掃描結(jié)果結(jié)合考慮，IL-4與IL-4Rα相互作用中最關(guān)鍵的殘基是Glu-9和Arg-88。中等作用的殘基可能包括Ile-5＞Asn-89＞Lys-84-Arg-81＞Thr-13-Gln-78-Arg-85-Lys-77；可能不參與相互作用的殘基包括Gln-8、Ile-11、Lys-12、Asn-15、His-74、Phe-82和Trp-91。鑒于其在被丙氨酸取代時(shí)顯示出的親和性的提高，Ser-16可能存在于IL-4與IL-4Rα間形成的介面上或介面內(nèi)。這些結(jié)果明確表示出IL-4上與IL-4Rα結(jié)合時(shí)可能的結(jié)合表面。從IL-4結(jié)構(gòu)上講，該表面由IL-4A-和C-螺旋的相鄰部分組成(Smith LJ,et al.,人體白細(xì)胞介素4。四螺旋束蛋白的溶液結(jié)構(gòu)，J.Mol.Biol.224(4):899-904(1992))，而且在每一螺旋上延伸約三個(gè)螺旋回轉(zhuǎn)，即在A螺旋上的位置5至16，和C螺旋上的位置77至89。與IL-4受體α接觸可能性最大的殘基在A螺旋上為Ile-5、Glu-9、Thr-13和Ser-16，在C螺旋上為L(zhǎng)ys-77、Gln-78、Arg-81、Lys-84、Arg-85、Arg-88和Asn-89。從結(jié)構(gòu)上看，相互作用的關(guān)鍵中心似乎由殘基Glu-9、Arg-88和Asn-89組成，當(dāng)其中一個(gè)從分子的這一部分移去時(shí)，所觀察到的丙氨酸影響通常會(huì)降低。因此，這一分析說(shuō)明了IL-4與IL-4Rα作用的結(jié)合表面。
實(shí)施例6．選定位置上的取代突變蛋白質(zhì)。前面一個(gè)生長(zhǎng)激素的分析中，發(fā)現(xiàn)了能夠改善生長(zhǎng)激素對(duì)其受體親和性的殘基取代，這些殘基在被丙氨酸取代時(shí)對(duì)親和性起著中等作用(Lowman HB,et al.，“通過(guò)單價(jià)噬菌體顯示選擇高親和性結(jié)合蛋白質(zhì)”，Biochemistry30(45)p10832-8(1991))。此外還發(fā)現(xiàn)，一個(gè)可改善親和性的特定殘基的取代性質(zhì)是不可預(yù)測(cè)的。因此，在本分析中向各靶位置引入了所有無(wú)內(nèi)在結(jié)構(gòu)影響(即除Cys、Gly、Pro以外)或容易進(jìn)行氧化反應(yīng)(即除Met以外)的取代。
表Ⅱ．靶殘基以及其取代。*
*所有突變均附加于IL-4[R121D/Y124D]主鏈。因此，在進(jìn)一步取代分析中排除了半胱氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。如果殘基在被丙氨酸取代時(shí)顯示的親和性下降在5至80倍，或者顯示任何親和性的提高，它們則被選擇用于進(jìn)一步分析。這一范圍是根據(jù)Lowman等(出處同前)所得結(jié)果選擇的。此外，鑒于所觀察到的丙氨酸取代引起的親和性的提高，Ser-16被選擇用于進(jìn)一步分析，因?yàn)檫@表明了該位置的其它取代也可能導(dǎo)致親和性的改善。
實(shí)施例7．引起對(duì)IL-4Rα親和性改善的取代。在A-和C-螺旋中單獨(dú)位置上包含取代的突變蛋白質(zhì)與IL-4[R121D/Y124D]主鏈組合而生成。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定同時(shí)將每一突變蛋白質(zhì)與IL-4[R121D/Y124D]進(jìn)行了平行比較，從而得到了每一取代對(duì)于某特定突變蛋白質(zhì)與IL-4Rα親和性的影響的直接比較和結(jié)論。
所有引起親和性改善的取代如表Ⅲ所示。“KdIL-4[R121D/Y124D]/Kd突變蛋白質(zhì)”比率表示每一取代引起的親和性的相對(duì)提高。
表Ⅲ．
大多數(shù)取代是有害的，或者對(duì)IL-4Rα親和性沒(méi)有影響(數(shù)據(jù)未示出)。但是，有幾個(gè)取代確實(shí)改善了親和性，其中最明顯的是Asp對(duì)Thr-13的取代，該取代對(duì)IL-4Rα親和性的改善高達(dá)18倍，令人驚奇(圖2)。氨基酸Ser-16在本分析中非常特殊，大多數(shù)的取代在此位置上都引起了親和性適度的提高。在其它突變蛋白質(zhì)以及其相關(guān)親和性上也獲得了類似的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合曲線(數(shù)據(jù)未示出)。
親和性的改善是相對(duì)親本蛋白質(zhì)IL-4[R121D/Y124D]而言的?？梢灶A(yù)見(jiàn)，將這些取代結(jié)合在一個(gè)蛋白質(zhì)中可能會(huì)引起親和性的綜合提高。例如，[T13D/N89I]-IL-4[R121D/Y124D]可能生成一種比IL-4[R121D/Y124D]親和性高出36倍的突變蛋白質(zhì)。
在適當(dāng)?shù)娜〈淮_定時(shí)，殘基Thr-13和Ser-16對(duì)親和性產(chǎn)生最佳改善。這可能表明，其它在丙氨酸取代時(shí)產(chǎn)生與突變蛋白質(zhì)T13A或S16相似作用(分別為降低6.4倍和提高2.5倍)的殘基，在取代適當(dāng)時(shí)也很可能產(chǎn)生較高親和性的IL-4變異體。在當(dāng)前一系列被丙氨酸取代的殘基中，它們包括Ile-11、Lys-77、Gln-78、Lys-84和Arg-85。
在已有廣泛研究的生長(zhǎng)激素中，引起親和性提高的單一取代在1.5-5倍之間(Lowman HB；Wells JA，“通過(guò)單價(jià)噬菌體顯示產(chǎn)生的人體生長(zhǎng)激素的親和性成熟”。J.Mol.Biol.234(3)p564-78(1993))。但是，大幅改善活性(人體IL-3(Olins PO,et al.，人體白細(xì)胞介素-3的飽和誘變，J.Biol.Chem.270(40):23754-60(1995))或親和性(人體睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)(SaggioⅠ,et al.,具有提高的生物效價(jià)及受體選擇性的CNTF變異體表明了受體相互作用的功能位點(diǎn)，EMBO J.14(13):3045-54(1995)))的取代最近已被確認(rèn)。對(duì)于IL-3，一個(gè)變異在體外增加生物活性近26倍；對(duì)于CNTF，單一取代提高親和性近32倍。對(duì)于文獻(xiàn)中的其它細(xì)胞因子，大多數(shù)取代一般對(duì)親和性/活性無(wú)影響或?qū)е缕鋯适АＲ虼?，任何特定取代?duì)親和性和/或活性的絕對(duì)影響是不可預(yù)測(cè)的。
實(shí)施例8．T13D取代對(duì)生物活性的影響。IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)IL-4[R121D/Y124D]是IL-4的拮抗物(Tony,HP,Shen BJ,ReuschP和Sebald W，“用于高度有效地抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞中白細(xì)胞介素-4依賴性和白細(xì)胞介素-13依賴性反應(yīng)的人體白細(xì)胞介素-4拮抗物的設(shè)計(jì)”，Eur.J.Biochem.,225(2):659-65(1994))，由于它對(duì)IL-4活性無(wú)刺激能力，故在本研究中用作“基線”肽。由于它能與IL-4Rα結(jié)合，但又不以信號(hào)反應(yīng)方式涉及gc，從而能夠阻止IL-4與其同源受體復(fù)合體的結(jié)合，所以，該拮抗物突變蛋白質(zhì)被認(rèn)為是一種拮抗物。因此，IL-4[R121D/Y124D](IL-4拮抗物)的生物學(xué)效應(yīng)和它與IL-4Rα的相互作用是獨(dú)立的，該相互作用以親和性測(cè)量。
為了證明受體親和性與生物效價(jià)相關(guān)，我們對(duì)突變蛋白質(zhì)T13D-IL-4[R121D/Y124D]抑制IL-4誘導(dǎo)的PHA-母細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)(圖3)。觀察到的相對(duì)于IL-4[R121D/Y124D]的IC50(50％抑制時(shí)的濃度)大致與觀察到的受體親和性相對(duì)變化成比例。
總之，盡管T13D-IL-4[R121D/Y124D]以較高的親和性與IL-4Rα結(jié)合，它仍是一種IL-4拮抗物。T13D-IL-4[R121D/Y124D]相對(duì)于IL-4[R121D/Y124D]的IC50大致與這兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)Kd值成比例(如同固相結(jié)合測(cè)定中所測(cè)量的):T13D-IL-4[R121D/Y124D]的Kd值比IL-4[121D/Y124D]的Kd值約低18倍(分別為0.28nM對(duì)5.0nM)；T13D-IL-4[R121D/Y124D]的IC50值比IL-4[R121D/Y124D]的IC50值約低5-10倍(分別為2nM對(duì)13nM)。相對(duì)影響中特定的數(shù)值差別可能是每一測(cè)定的特殊條件的結(jié)果固相結(jié)合測(cè)定中20℃下培養(yǎng)1.5小時(shí)對(duì)增殖測(cè)定中37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。本研究中評(píng)價(jià)的、在生物測(cè)定中與IL-4競(jìng)爭(zhēng)的其它突變蛋白質(zhì)的能力也與其相對(duì)IL-4[R121D/Y124D]的Kd值成比例(數(shù)據(jù)未示出)。這些結(jié)果表明，與IL-4Rα的結(jié)合是一個(gè)與IL-4受體活化分開(kāi)的獨(dú)立過(guò)程，受體的活化需要IL-4Rα的異源雙體化以及至少一個(gè)其它亞基(如gc)。因此，對(duì)IL-4A-和C-螺旋的修飾調(diào)節(jié)著IL-4對(duì)IL-4Rα的親和性，同時(shí)也均衡地調(diào)節(jié)著所述突變蛋白質(zhì)在生物環(huán)境中拮抗IL-4的能力。鑒于IL-4與其受體相互作用的機(jī)制，這種親和性影響也能表示為從IL-4衍生出的激動(dòng)肽的能力的提高。
本發(fā)明的理論也可適用于其它細(xì)胞因子。最明確的目標(biāo)為IL-13，因?yàn)镮L-13受體復(fù)合體也利用IL-4Rα(Zurawski S.M.,et al.，人體白細(xì)胞介素-4受體的主要結(jié)合亞基也是白細(xì)胞介素-13受體的組分，J.Biol.Chem.270:13869-78(1995))。因此，通過(guò)引起IL-13A-和C-螺旋的突變使其更接近IL-4，應(yīng)會(huì)帶來(lái)對(duì)IL-4Rα親和性的提高。
這兩種白細(xì)胞介素的序列對(duì)比，能夠確認(rèn)類似于靶變異位點(diǎn)的位置，如IL-4中的Thr13。這兩種白細(xì)胞介素的結(jié)合表面在以下表Ⅳ中進(jìn)行了比較。
表ⅣIL-4A-和C-螺旋與IL-13序列的比較*
*序列對(duì)比摘自Bamborough,P.,Duncan,D.，和Richards,W.G.，“白細(xì)胞介素-13三維結(jié)構(gòu)的預(yù)想模型”，Protein Engineering,7,pp.1007-82(1994)
根據(jù)該序列對(duì)比，丙氨酸掃描所確認(rèn)的、介導(dǎo)與IL-4Rα相互作用的最關(guān)鍵的IL-4殘基Glu-9和Arg-88與IL-13中相應(yīng)殘基同樣以黑體字表示。如同前面所提到的，IL-13在其受體復(fù)合體中使用IL-4Rα鏈(Zurawski S.M.,et al.，同上)。因此，通過(guò)改變IL-13A-和C-螺旋使其更接近IL-4，應(yīng)會(huì)帶來(lái)對(duì)IL-4Rα結(jié)合親和性的提高。此外，用已知能夠提高IL-4對(duì)IL-4Rα親和性的殘基取代等效位置上的IL-13殘基(以雙下線標(biāo)記所示IL-4和IL-13的位置)也應(yīng)帶來(lái)IL-13對(duì)其受體復(fù)合體親和性的提高，以及相應(yīng)效價(jià)的提高。
序列。本發(fā)明包括以下生物序列SEQ ID NO:1氨基酸序列，成熟人體IL-4；SEQ ID NO:2核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:3核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:4核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:5核苷酸序列，PCR引物；SEQ ID NO:6結(jié)合鏈霉親和素的肽標(biāo)記的氨基酸序列；SEQ ID NO:7sIL-4Rα-STX的氨基酸序列；SEQ ID NO:8T13D-IL-4的氨基酸、核苷酸序列；以及SEQ ID NO:9T13D-IL-4[R121D/Y124D]的氨基酸、核苷酸序列。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于該領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在此說(shuō)明的概念及實(shí)驗(yàn)方法適用于其它利用異源多體受體系統(tǒng)的細(xì)胞因子，尤其是IL-2及其相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-7、IL-9、IL-10、IL-13和IL-15)、α干擾素和γ干擾素。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Shanafelt,Armen；Greve,Jeffrey；Roczniak,Steven(ⅱ)發(fā)明題目高親和性IL-4突變蛋白質(zhì)(ⅲ)序列數(shù)9(ⅳ)通信地址(A)收件人Bayer Corporation,Pharmaceutical Division(B)街道400Morgan Lane(C)城市West Haven(D)州CT(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼06516-4175(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸軟盤(pán)，1.44Mb儲(chǔ)存容量(B)電腦IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS v.6.30(D)軟件Word用于Windows6.0(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/687,803(B)申請(qǐng)日1996年7月19日(ⅶ)律師/代理人信息(A)姓名Huw R.Jones(B)注冊(cè)號(hào)33,916(C)參考/案卷號(hào)WH5020(ⅷ)電信信息(A)電話(203)812-2317(B)傳真(203)812-5492(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度129(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(A)說(shuō)明人體白細(xì)胞介素-4蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:1:His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr20 25 30Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe35 40 45Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu50 55 60Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg65 70 75His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu80 85 90Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn95 100 105Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met110 115 120Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser125(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說(shuō)明5′PCR引物，IL-4(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:2:
CGCGGATCCA TGGGTCTCAC CTCC24(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說(shuō)明3′PCR引物，IL-4(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:3:
CGCTCTAGAC TAGCTCGAAC ACTTTGAAT29(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說(shuō)明5′PCR引物，IL-4Rα(ED)(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:4:
GGCATGGATC CATGGGGTGG CTTTGCTCTG G31(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說(shuō)明3′PCR引物，IL-4Rα(ED)(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:5:
AAGCCGCTAG CGCTGTGCTG CTCGAAGGGC30(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(A)說(shuō)明結(jié)合鏈霉親和素的標(biāo)記(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)
(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:6:
Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly101 5 10(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度197(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(A)說(shuō)明sIL-4Rα-STX(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:7:Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser1 5 10 15Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser20 25 30Thr Glu Leu Arg Leu Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met35 40 45Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala50 55 60Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His65 70 75Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val80 85 90Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp95 100 105Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser110 115 120Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu125 130 135Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile140 145 150Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr155 160 165Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr170 175 180Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe185 190 195G1y Gly 197(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度462(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說(shuō)明IL-4/T13D(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:8:ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 45Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu1 5 10 15GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC 90Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr20 25 30TTA CAG GAG ATC ATC AAA GAT TTG AAC AGC CTC ACA GAG CAG AAG 135Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys35 40 45ACT CTG TGC ACC GAG TTG ACC GTA ACA GAC ATC TTT GCT GCC TCC 180Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser50 55 60AAG AAC ACA ACT GAG AAG GAA ACC TTC TGC AGG GCT GCG ACT GTG 225Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val65 70 75CTC CGG CAG TTC TAC AGC CAC CAT GAG AAG GAC ACT CGC TGC CTG 270Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu80 85 90GGT GCG ACT GCA CAG CAG TTC CAC AGG CAC AAG CAG CTG ATC CGA 315Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg95 100 105TTC CTG AAA CGG CTC GAC AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG 360Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu110 115 120AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC 405Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn125 130 135TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC ATG AGA GAG AAA TAT TCA AAG 450Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys140 145 150TGT TCG AGC TAG 462Cys Ser Ser End(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度462(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(A)說(shuō)明IL-4/T13D[R121D/Y124D](ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義鏈無(wú)(ⅹⅰ)序列說(shuō)明SEQ ID NO:9:ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 45Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu1 5 10 15GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC 90Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr20 25 30TTA CAG GAG ATC ATC AAA GAT TTG AAC AGC CTC ACA GAG CAG AAG 135Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys35 40 45ACT CTG TGC ACC GAG TTG ACC GTA ACA GAC ATC TTT GCT GCC TCC 180Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser50 55 60AAG AAC ACA ACT GAG AAG GAA ACC TTC TGC AGG GCT GCG ACT GTG 225Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val65 70 75CTC CGG CAG TTC TAC AGC CAC CAT GAG AAG GAC ACT CGC TGC CTG 270Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu80 85 90GGT GCG ACT GCA CAG CAG TTC CAC AGG CAC AAG CAG CTG ATC CGA 315Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg95 100 105TTC CTG AAA CGG CTC GAC AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG 360Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu110 115 120AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC 405Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn125 130 135TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC ATG GAC GAG AAA GAC TCA AAG 450Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys140 145 150TGT TCG AGC TAG 462Cys Ser Ser End
權(quán)利要求
1．一種根據(jù)野生型IL-4編號(hào)的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)在所說(shuō)的野生型IL-4的A或Cα-螺旋鏈的結(jié)合表面至少包含一個(gè)氨基酸取代，從而使該突變蛋白質(zhì)以至少比天然IL-4更高的親和力與IL-4Rα受體結(jié)合。
2．權(quán)利要求1所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，其中所述取代選自A-螺旋上的位置13和16、以及C-螺旋上的位置81和89。
3．權(quán)利要求2所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，其中所述的位置13上的取代為T(mén)hr成為Asp。
4．一種藥用組合物，該組合物包含權(quán)利要求1所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)與一種可藥用的載劑。
5．一個(gè)為權(quán)利要求1所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)編碼的氨基酸序列。
6．權(quán)利要求1所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)由氨基酸序列SEQ ID NO:8編碼。
7．一種經(jīng)純化、分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列為權(quán)利要求1所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)編碼。
8．一種被權(quán)利要求7所述的經(jīng)純化、分離的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9．權(quán)利要求3所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)由DNA序列SEQ ID NO:9或其可穩(wěn)定雜交的相關(guān)變異體編碼。
10．一種能夠表達(dá)權(quán)利要求9所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
11．一種為所需人體提供治療的方法，該方法包括給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求4所述的組合物。
12．一種確定某種突變蛋白質(zhì)與其受體結(jié)合能力的測(cè)定方法，該方法包括如下步驟(a)向包被有鏈霉親和素的FlashPlate引入一個(gè)受體鏈的結(jié)合部分，該受體鏈的結(jié)合部分具有一個(gè)能夠被鏈霉親和素結(jié)合的標(biāo)記肽；(b)向所述FlashPlate引入一個(gè)對(duì)所述受體鏈的結(jié)合部分具有親和性的放射性標(biāo)記天然配體；(c)向所述FlashPlate引入一個(gè)對(duì)所述受體鏈的結(jié)合部分具有親和性的突變蛋白質(zhì)配體；(d)達(dá)到平衡后測(cè)量FlashPlate發(fā)出的信號(hào)量；以及(e)計(jì)算突變蛋白質(zhì)配體相對(duì)于天然配體的相對(duì)親和性。
13．權(quán)利要求12所述的方法，其中所述受體鏈為IL-4Rα。
14．權(quán)利要求12所述的方法，其中所述肽標(biāo)記包括SEQ ID NO:6或其相關(guān)簡(jiǎn)并變異體。
15．權(quán)利要求12所述的方法，其中所述肽標(biāo)記已從受體鏈中除去，且受體鏈已被生物素化。
16．權(quán)利要求12所述的方法，其中所述受體鏈的結(jié)合部分由SEQ IDNO:7或其相關(guān)簡(jiǎn)并變異體編碼。
17．一種根據(jù)野生型IL-4編號(hào)的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)，其中所述突變蛋白質(zhì)包括(a)在所述野生型IL-4的D-螺旋上具有取代R121D和Y124D；和(b)在所述野生型IL-4的A-或C-α螺旋結(jié)合表面上具有至少一個(gè)氨基酸取代，從而使所述突變蛋白質(zhì)以至少比天然IL-4更高的親和性與IL-4Rα受體結(jié)合。
18．權(quán)利要求17所述的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)，其中所述取代選自A-螺旋上的位置13和16、以及C-螺旋上的位置81和89。
19．權(quán)利要求18所述的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)，其中所述位置13上的取代為T(mén)hr成為Asp。
20．一種藥用組合物，該組合物包含權(quán)利要求17所述的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)與一種可藥用的載劑。
21．一個(gè)為權(quán)利要求17所述的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)編碼的氨基酸序列。
22．權(quán)利要求17所述的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)由氨基酸序列SEQ ID NO:9編碼。
23．一種經(jīng)純化、分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列為權(quán)利要求17所述的重組人體IL-4拮抗物突變蛋白質(zhì)編碼。
24．一種被權(quán)利要求23所述的經(jīng)純化、分離的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
25．權(quán)利要求19所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)由DNA序列SEQ ID NO:9或其可穩(wěn)定雜交的相關(guān)變異體編碼。
26．一種能夠表達(dá)權(quán)利要求26所述的重組人體IL-4突變蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
27．一種為所需人體提供治療的方法，該方法包括給予藥學(xué)有效量的權(quán)利要求20所述的組合物。
全文摘要
一種根據(jù)野生型IL－4編號(hào)的重組人體IL－4突變蛋白質(zhì),該突變蛋白質(zhì)在野生型IL－4的A或Cα－螺旋鏈的結(jié)合表面至少包含一個(gè)氨基酸取代,從而使該突變蛋白質(zhì)以至少比天然IL－4更高的親和力與IL－4Rα受體結(jié)合。取代更優(yōu)選選自由A－螺旋上的位置13和16、以及C－螺旋上的位置81和89組成的位置。更優(yōu)選的實(shí)施方案是位置13上Thr被取代為Asp的重組人體IL－4突變蛋白質(zhì)。本發(fā)明中也對(duì)藥用組合物、為突變蛋白質(zhì)編碼的氨基酸和多核苷酸序列、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、突變蛋白質(zhì)的抗體、以及治療方法等進(jìn)行了說(shuō)明。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1230223SQ97197959
公開(kāi)日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1997年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月19日
發(fā)明者J·格雷維, A·B·沙納菲爾特, S·洛克茲尼爾克 申請(qǐng)人:美國(guó)拜爾公司