專利名稱：：使用轉基因麥芽種生產(chǎn)酒精性飲料的改進工藝的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)酒精性飲料特別是啤酒和威斯忌的工藝。
背景技術：
：酒精性飲料例如啤酒可由發(fā)芽的和/或未發(fā)芽的大麥谷粒生產(chǎn)。麥芽和酵母一起提供啤酒的風味和色澤，而且麥芽是作為可發(fā)酵的糖和酶的來源。麥芽是否用于釀造工藝取決于啤酒的類型和生產(chǎn)啤酒的國家。例如，在非洲國家沒有使用麥芽的傳統(tǒng)。最近RC.Hoseney(谷類食物世界(CerealFoodsWorld)，39(9)，675-679，1994)描述了制備麥芽(malting)及釀造的一般工藝。制備麥芽是指大麥谷粒受控干燥之后的受控發(fā)芽的過程。谷粒轉化為麥芽要通過連續(xù)的步驟浸潤，萌發(fā)，生長和干燥焙烤。在這方面，萌發(fā)步驟的重要性在于獲得一系列能夠改變胚乳的酶的表達。這種改變產(chǎn)生了可發(fā)酵的碳水化合物。制備麥芽過程之后的干燥/加熱步驟產(chǎn)生風味與色澤，這歸因于非酶促的褐色化(美拉德)發(fā)應。制備麥芽過程是啤酒生產(chǎn)工藝中一個非常復雜和花費大的步驟?？闪信e幾個制備麥芽過程的不利方面-麥芽中酶的水平可變而導致不可預測的結果，-萌發(fā)過程中并不是每個所需的酶活性都產(chǎn)生或產(chǎn)生足夠量，這就需要添加酶，-產(chǎn)生優(yōu)質風味與色澤所需的條件可能對麥芽中的酶活性有害，-其過程花費昂貴，-萌發(fā)過程中有10-20％的重量損失，這是由于呼吸作用和小根的生長(小根在清洗麥芽時被除去)，-由于不利的氣候條件并不是在任何所需的地方都可以生產(chǎn)麥芽，-因為麥芽中存在的蛋白酶使蛋白質溶解，使用麥芽可導致膠體不穩(wěn)定，-產(chǎn)生生物胺類(食品科學雜志(J.FoodScience)59(5)，1104-1107，1994)，從而導致例如組胺中毒。傳統(tǒng)上，麥芽是可發(fā)酵碳水化合物與酶的唯一來源，在很多國家至今仍然如此。但是，現(xiàn)在越來越多的啤酒生產(chǎn)使用其它來源的碳水化合物而非麥芽和/或大麥，即實際上任何淀粉原料或液化的/降解的淀粉，也即所謂的輔劑。由于麥芽不但作為可發(fā)酵碳水化合物的一個來源，而且是酶的一個來源，所以當用未發(fā)芽的大麥和/或輔劑代替超過大約50％的麥芽時應加入另外來源的酶。制備麥芽時在風味和色澤與酶活性之間存在折衷。只有在相對高溫下充分長的時間的烘烤才能生產(chǎn)出來提供高品質風味與深顏色的麥芽。這些都是對酶活性有害的條件。這樣從好幾個方面來看有必要添加外源的酶。在此問題上，有時使用微生物酶已成為一個普通的措施。例如，為了釀制啤酒，谷粒與/或發(fā)芽的谷粒被液化和糖化以產(chǎn)生可發(fā)酵的糖。通過使用由例如US4,285,975或US5,180,669所描述的熱穩(wěn)定的α-淀粉酶可改進液化步驟。同時使用蛋白酶來增加麥芽汁中自由可得的氮量而改進發(fā)酵。除了淀粉以外，谷物谷粒中還存在其它多糖如β-葡聚糖(Henry，R.J.等.J.Sci.FoodAgric.361243-1253，1985)。存在于麥芽中的β-葡聚糖酶在釀造過程中不夠熱穩(wěn)定而無法保持活性。這些β-葡聚糖非常粘稠而使麥芽汁與啤酒產(chǎn)生過濾問題。這就是之所以在釀造過程中微生物的β-葡聚糖酶被廣泛使用的原因。非淀粉多糖也包括戊聚糖，最近它的結構已被廣泛的研究(Gruppen，H.等，碳水化合物研究(Carbohydr，Res.)233，45-64，1992)，尤其是那些在大麥與麥芽中的(Vietor，R.J.等，碳水化合物研究254，245-255，1994)。據(jù)稱一種來自Penicilliumemersonii的戊聚糖酶能在釀造過程中改進可發(fā)酵糖的生產(chǎn)與提取(GB2,150,933)。也在WO94/14965中提到使用木聚糖酶B提高麥芽汁質量。盡管在這一領域中已取得一些進展，仍需要用酶制劑釀造啤酒的方法。發(fā)明概述本發(fā)明公開了一種用于酒精性飲料如啤酒生產(chǎn)的工藝，其中加入了酶的混合物，該混合物至少包括一種內切-β(1，4)-木聚糖酶，一種阿拉伯呋喃糖苷酶，一種α-淀粉酶，一種內切蛋白酶和一種β-(1，3；1，4)-葡聚糖酶，任選地，也包括了一種糖化淀粉酶和/或一種外肽酶。優(yōu)選地，以轉基因種子的形式提供啤酒生產(chǎn)工藝中所需的酶。本發(fā)明進一步公開了表達啤酒生產(chǎn)工藝中所需酶的轉基因種子。發(fā)明描述我們現(xiàn)在已驚異地發(fā)現(xiàn)釀造工藝可在如權利要求的酶混合物存在下進行，而只用少量的麥芽。該過程已被用來生產(chǎn)一種經(jīng)典的麥芽啤酒，但它同樣可被用于任何以麥芽提供酶活性的工藝中。所用的酶選自一些釀造工藝所必需的酶。它們選自淀粉裂解酶類、纖維素分解酶類、半纖維素分解酶類和蛋白質裂解酶類中。淀粉裂解酶類包括一些酶如α-淀粉酶、糖化淀粉酶、淀粉葡萄糖苷糖、外切淀粉酶、支鏈淀粉酶。纖維素分解酶類包括這樣一些酶如β-1，4-內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡葡糖苷酶。半纖維素分解酶類包括這樣一些酶如β-1，3-1，4-葡聚糖酶、木聚糖酶、內切阿拉伯糖膠酶(endo-arabinanase)、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶、阿魏酸酯酶。蛋白質裂解酶類包括這樣一些酶如外肽酶和內肽酶(也稱蛋白酶)在這個方面，選擇一種特定的淀粉裂解酶、纖維素分解酶、半纖維素分解酶或蛋白裂解酶對于本發(fā)明并不關鍵。除此之外，酶的選擇應使酶的特性(如pH和溫度范圍)與釀造工藝中特定的環(huán)境相符合。大量編碼淀粉裂解酶、纖維素分解酶、半纖維素分解酶和蛋白質裂解酶的基因對于熟練技術人員來說都是可獲得的。編碼目的酶的基因可以從任何來源，如植物、動物和微生物中獲得。優(yōu)選地，基因從微生物來源中獲得。內切β-(1，4)-木聚糖酶可從黑曲霉(Aspergillusniger)的培養(yǎng)物中獲得(EP0463706)。阿拉伯呋喃糖苷酶可以同工酶A或同工酶B(EP0506190)或者阿拉伯木聚糖水解酶(EP0730653)的形式從黑曲霉培養(yǎng)物中獲得。熱穩(wěn)定的淀粉酶可從地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)(WO91/14772，WO92/05259)中得到，并且，例如，可依商品名BrewersAmyliqThermostable(B.A.T.S.)在市場上買到。熱穩(wěn)定淀粉酶的活性以TAU單位來表示。內切蛋白酶可從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中得到，并且也可依商品名Brewersprotease(+)從市場上買到，它的活性以PC單位表示。從相同細菌中也可得到內切β-(1，3；1，4)-葡聚糖酶(Hofemeister等，基因(Gene)49，177，1996)，它也可依商品名FiltraseL3000(+)從市場上買到。葡聚糖酶的活性以BGLU單位表示。任選的糖化淀粉酶同樣可從市場上買到(商品名為BrewerFermex來自米曲霉(Aspergillusoryzae)的淀粉酶，其活性以FAU單位表示)，但它也可從Penicilliumemersonii的純培養(yǎng)物中得到(可獲自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)保藏號為ATCC16479)。任選的外肽酶可來自于醬油曲霉(Aspergillusojae)的純培養(yǎng)物，該菌株已于1996年2月12日保藏于真菌菌種保藏中心)(CBS)，Oosterstraat1，Baarn，荷蘭，保藏號CBS209.96(A.Sojae(DS8351)?，F(xiàn)在已知對啤酒生產(chǎn)必需的酶活性有，能將胚乳中淀粉轉化為可發(fā)酵糖的α和β-淀粉酶，能將蛋白質降解為作為酵母營養(yǎng)的可溶性氮化合物的蛋白酶，和能將大麥β-1，3-1，4葡聚糖和木聚糖分別水解為寡糖從而減少粘度并提高可過濾性的β-葡聚糖酶和木聚糖酶。這樣，若要從外源即微生物來源提供所有必需的酶，至少需加5種不同的酶。雖然可用一種微生物生產(chǎn)所有的酶，但需要采用不同的發(fā)酵條件以獲得所有酶的最佳生產(chǎn)。通過使用微生物來源的酶，可以克服前面提到的制備麥芽過程中的一些缺點。但是，使用微生物作為酶的來源也有它的缺點-要求至少一種微生物的一系列不同發(fā)酵反應以得到足夠量的每種酶。-酶制劑可能包含不需要的附帶活性，-消費者不喜歡除植物原料、水、酵母外的其它添加物，-在室溫下保存時，酶制劑的有限的穩(wěn)定性。在工業(yè)上的酶促工藝中酶含量提高的轉基因種子的普遍使用在國際專利申請WO91/14772中已有描述。在工業(yè)生產(chǎn)過程中直接使用含有酶的種子避免了必須先提取和/或分離酶。種子可作為酶的一種穩(wěn)定的易于貯存的形式。對于一個特定的酶，β-1，3-1，4葡聚糖酶，其在大麥種子中的表達已被描述為外源性添加的另一種替代方法。東德專利申請DD275704公開了一種表達載體的構建方法，其使芽孢桿菌的β-葡聚糖酶在大麥中進行種子特異性表達。但是，那時還不知道有效轉化大麥的方法。使用表達芽孢桿菌β-葡聚糖酶的種子，可以更大量的谷粒取代麥芽而不產(chǎn)生嚴重的過濾問題，但是，在啤酒釀造工藝中必需的其它酶活性仍需從麥芽中獲得或從外源添加。Mannonen等(1993)建議在大麥種子中整合入真菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶。用這種方法，通過在種子中表達β-1，3-1，4-葡聚糖酶改進釀造工藝，因為該酶有比內源性的大麥酶更高的熱穩(wěn)定性。但在這種情況中，目的是使種子經(jīng)過正常的制備麥芽過程。而且在這種情況中，啤酒釀造工藝中必需的其它酶活性也仍需從麥芽中獲得或從外源性添加。在本發(fā)明的優(yōu)選工藝中，釀造工藝中必需的酶在轉基因種子中表達。如此制備的表達該必需酶的轉基因種子反過來用于啤酒釀造工藝。這樣，減少了麥芽的用量，而且避免了添加外源的微生物的酶。表達啤酒釀制工藝中必需酶的轉基因種子通用名為轉基因麥芽種(MaltSeed)。能夠在其種子中產(chǎn)生目的酶的植物的種類包括，其谷?；騺碜怨攘５漠a(chǎn)物有在啤酒釀制過程中被使用歷史的種類。但是在啤酒釀造工藝中不常用到的植物種類也可被用作表達目的酶的轉基因種子的來源，特別是在僅需加入少量該轉基因種子到釀造工藝中的情況下。符合這些標準的植物種類有例如，大麥、玉米、水稻、小麥、高粱、小米、燕麥、木薯等。編碼目的酶的基因是通過使用在植物或植物種子中有功能的調控序列在植物中表達的。這些調控序列包括啟動子序列、終止子序列和任選地，轉錄增強子序列。使用啟動子序列可導致在整個植物中基因的組成性表達。另外，可使用有指導基因在植物種子中表達的活性的啟動子序列。此外，目的酶的表達可被直接定向于特定細胞區(qū)間，如胞質溶膠、內質網(wǎng)、囊泡、蛋白體或者使用特異性靶向序列直接定向到細胞外空間。特定的細胞區(qū)間或細胞外空間的選擇取決于目的酶的性質并應選為產(chǎn)生該酶的最適環(huán)境。例如，目的酶應該表達在種子成熟過程中使該蛋白質最穩(wěn)定的環(huán)境中。另外，目的酶應表達在這樣一個環(huán)境中，其中酶的表達不會抑制必需的植物代謝過程或對植物或種子活力產(chǎn)生有害影響。為了能夠在植物細胞中得以表達，編碼所選酶的DNA序列通常與調控序列一起提供以使其可被宿主的生化機制所識別并使開放閱讀框在宿主中被轉錄和翻譯。它通常包含一個轉錄起始區(qū)域，該區(qū)域可適當?shù)貋碜匀魏文茉谥参锛毎斜磉_的基因，它還應包含一個用于核糖體識別并附著的翻譯起始區(qū)。在真核植物細胞中，這樣一個表達盒通常還包括位于該閱讀框下游的轉錄終止區(qū)域，以使轉錄終止并使初級轉錄產(chǎn)物多聚腺苷酸化。另外，還可調整密碼子的使用使其成為所選宿主植物可接受的密碼子。DNA構建體在植物細胞中表達的原則已普遍地被本領域熟練技術人員所理解并且可表達的嵌合DNA構建體的構建已成為常規(guī)實驗。一種特定類型的復制子能將它自身、或其自身的一部分轉移到另一種宿主細胞中，例如植物細胞，籍此將根據(jù)本發(fā)明編碼的酶的閱讀框共轉移到該植物細胞中。具有這種能力的復制子此處稱為載體，這種載體的一個例子是Ti質粒載體，當其存在于一個適當宿主如根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中時，它可將自身的一部分即所謂的T-區(qū)域轉移至植物細胞。不同類型的Ti質粒載體(參看EP0116718B1)現(xiàn)在被常規(guī)地用于將嵌合DNA序列轉移至植物細胞或原生質體中，以此可產(chǎn)生新的在其基因組中穩(wěn)定整合入該嵌合DNA的植物。一種特定的優(yōu)選的Ti質粒載體的形式是在(EP0120516131和US4,940,838)中要求的所謂的二元載體。另一些可用來將根據(jù)本發(fā)明的DNA導入到植物宿主中的合適載體可從病毒載體中選擇，例如非整合型植物載體，諸如來自雙鏈植物病毒(如CaMV)和單鏈病毒、雙生病毒群等。使用這種載體可能是有益的，特別是當難以穩(wěn)定地轉化植物宿主時(例如針對木本種類，特別是樹)與藤本植物時?！霸谄浠蚪M中整合入根據(jù)本發(fā)明的嵌合DNA序列的宿主細胞”的意思應該包括細胞以及包含這種細胞或基本上由這種細胞組成的多細胞生物體，這些細胞在其基因組中穩(wěn)定地整合有該嵌合DNA并籍此維持嵌合DNA，而且優(yōu)選地通過有絲分裂與減數(shù)分裂將這種嵌合DNA的一個拷貝傳給子代細胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案所提供的植物基本上由在其基因組中整合有一種或多種該嵌合DNA分子的細胞組成，并且能夠優(yōu)選地以孟德爾方式將一個或數(shù)個拷貝傳給其子代。通過根據(jù)本發(fā)明的嵌合DNA分子的轉錄和翻譯，這些細胞將產(chǎn)生所需的酶。雖然在植物細胞中控制DNA轉錄的原理并非總是完全清楚，創(chuàng)建能表達的嵌合DNA現(xiàn)在已是一個常規(guī)方法。常規(guī)地用于以組成性方式表達被轉化的多聚核苷酸的轉錄起始區(qū)是這樣一些啟動子，它們可獲自花椰菜花葉病毒、著名的35SRNA和19SRNA的轉錄啟動子和所謂的根瘤土壤桿菌的T-DAN啟動子。特別要提到的是胭脂氨酸合成酶啟動子、章魚氨酸合成酶啟動子(公開于EP0122791B1)和甘露氨酸合成酶啟動子。另外可使用的基本上是組成性的植物啟動子，諸如水稻肌動蛋白基因啟動子。對于種子特異性表達，可將目的cDNA基因插于來自在植物種子中特異性表達基因的啟動子之后。這些啟動子包括編碼種子貯存蛋白基因的啟動子，如蕓苔(Brassicanapus)十字花素(Cruciferin)啟動子，菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白啟動子，水稻(OryzaeSativa)的谷蛋白啟動子，玉蜀黍(Zeamays)的玉米醇溶蛋白啟動子和大麥(Hordeumvulgare)的大麥醇溶蛋白啟動子。人們還知道某些元件(所謂的增強子)的重復可顯著地增強在它控制下的DNA的表達水平(參見例如KayR.等(1987)，科學(Science)236，1299-1302CaMV35S啟動子-343到-90之間序列的重復增強該啟動子的活性)。除了組成性的35S啟動子單獨地或雙重地增強外，高強度的啟動子的例子還有光誘導的核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcSSU)啟動子和葉綠素a/b結合蛋白(Cab)啟動子。本發(fā)明同時設想的還有雜合啟動子，它包含了物理上相連的不同啟動子區(qū)域的元件。其中眾所周知的例子是所謂CaMV增強的甘露氨酸合成酶啟動子(美國專利5,106,739)，它包含了連接于CaMV增強子的甘露氨酸合成酶啟動子的元件。特別地，對于單子葉植物轉化，啟動子與選擇性標志基因之間的內含子的使用可以增強表達。這樣，名詞“啟動子”指結構基因上游的一個DNA區(qū)域，它參與識別和結合RNA聚合酶及其它蛋白質而起始轉錄?！爸参飭幼印笔且环N能在植物細胞中起始轉錄的啟動子?！敖M成性啟動子”是在發(fā)育或細胞分化過程中的多數(shù)環(huán)境條件與狀態(tài)下有活性的啟動子。至于轉錄終止區(qū)域的必要性，一般認為在植物細胞中這樣一個區(qū)域提高轉錄的可靠性和效率。因此在本發(fā)明的上下文中特別優(yōu)選其應用。雖然本發(fā)明的一些實施方案現(xiàn)在可能不可實行，例如因為某些植物種類仍然抗拒基因轉化，但在這些植物種類中本發(fā)明的實施僅僅是一個時間問題而不是原則問題，因為對這種基因轉化的順從性與本發(fā)明的實施方案無關。植物種類的轉化對于很多植物而言已成常規(guī)方法，既包括雙子葉植物也包括單子葉植物。原則上，任何轉化方法都可以用來將根據(jù)本發(fā)明的嵌合DNA導入一種合適的祖細胞?？蓮南铝蟹椒ㄖ羞m當選擇用于原生質體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等，1982，自然296，72-74；NegrutiuI.等，1987年6月，植物分子生物學(PlantMol.Biol.)8，363-373)，原生質體的電穿孔方法(ShillitoR.D.等，1985生物技術(Bio/Technol)，3，1099-1102)，顯微注射到植物材料中(CrosswayA.等，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)，(DNA或RNA包被的)顆粒轟擊各種植物材料(KleinT.M.等1987，自然327，70)，用(非整合型)病毒感染，在植物中通過成體植物浸潤或成熟花粉或小孢子的轉化等方法的根瘤土壤桿菌介導的基因轉移(EP0301316)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方法包含根瘤土壤桿菌介導的DNA轉移。特別優(yōu)選的是使用如在EPA120516和美國專利4,940,838中所公開的所謂的二元載體技術。雖然認為單子葉植物有些更為抗拒基因轉化，可順應轉化且有繁殖力的轉基因單子葉植物能夠從轉化的細胞或胚或其它植物材料中再生?，F(xiàn)在，單子葉植物轉化的優(yōu)選方法有胚、外植體或懸浮細胞的微粒轟擊，和直接DNA攝取或(組織)電穿孔(Shimamoto，等，1989，自然338，274-276)。通過微粒轟擊將吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因導入玉米懸浮培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生細胞獲得了轉基因玉米植株。該基因編碼膦絲菌素乙酰轉移酶(一種滅活除草劑膦絲菌素的酶)(Gordon-Kamm，1990，植物細胞(PlantCell)，2，603-618)。將遺傳材料導入其它單子葉作物如小麥和大麥的糊粉原生質體已有報導(Lee，1989，植物分子生物學，13，21-30)。通過選擇胚胎發(fā)生的愈傷組織以建立胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，從胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物中再生小麥株(Vasil，1990生物技術8，429-434)。對于這些作物的轉化系統(tǒng)的組合使本發(fā)明用于單子葉植物成為可能。單子葉植物，包括商業(yè)上重要的作物如水稻與玉米均易于通過土壤桿菌菌株介導進行DNA轉移(參見WO94/00977；EP0159418B1；GouldJ.，MichaelD，HasegawaO，UlianEC，PetersonG，SmithRH，(1991)植物生理(PlantPhysiol.)95426-434)。對于大麥，一個優(yōu)選的轉化方法已由Tingay，S.等所描述(植物雜志(ThePlantJ.)11(6)，1369-1376，1997)。為獲得能組成性地表達多于一個嵌合基因的植物，有很多備選方法，包括下列方法A.DNA的使用，如在一個二元質粒上的T-DNA，其帶有物理上偶聯(lián)于另一個選擇標記基因的一些修飾過的基因。這種方法的優(yōu)點在于嵌合基因是物理性地偶聯(lián)的因而可作為一個孟德爾基因座轉移。B.用來自一種包含一種或多種偶聯(lián)在另一種選擇標記基因上的嵌合基因的轉基因植物的花粉對另一些轉基因植物進行交叉授粉，其中該轉基因植物都已能夠表達一種或多種嵌合基因，并且該基因優(yōu)選地與一種選擇性標記基因偶聯(lián)。通過這種雜交獲得的種子，可依據(jù)兩種選擇標記的存在或依據(jù)嵌合基因本身的存在進行篩選。由所選的種子得到的植物以后可用于進一步雜交。原則上，這嵌合基因不在單一基因座上，因而這些基因可以獨立的基因座分離。C.使用一些復數(shù)(plurality)嵌合DNA分子，例如質粒，每個都含一種或多種嵌合基因和一種選擇標記。如果共轉化的頻率高，僅依據(jù)一種標記篩選就足夠了。在另外一些情況下，優(yōu)選的根據(jù)多種標記進行篩選。D.用新的嵌合DNA對已含有第一、第二(等)嵌合基因的轉基因植物連續(xù)轉化，任選地，包括了一種選擇標記基因。與方法B中一樣，嵌合基因原則上不在單一的基因座上，因而嵌合基因可以獨立的基因座相互分離。E.上述策略的組合。實際策略可能依賴于幾種考慮，諸如親代株的用途(直接生長、用于繁殖計劃、用于生產(chǎn)雜合體)，但相對于所描述的發(fā)明并不是關鍵的。人們已經(jīng)知道，實際上所有植物都可由培養(yǎng)的細胞或組織再生。再生的方法因植物種類不同而不同，但一般首先提供的是轉化的原生質體的懸浮物或含有轉化的外植體的培養(yǎng)平板。芽可直接誘導，或間接地從愈傷組織通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生進行誘導且隨后生根。除選擇標記外，培養(yǎng)其一般包含各種氨基酸和激素，比如生長素、細胞分裂素。培養(yǎng)基中加入谷氨酸與脯氨酸也有益處。有效的再生依賴于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)物的歷史。如果控制這三個參數(shù)，通常可再現(xiàn)并重復再生。將轉化的基因序列穩(wěn)定地整合入轉基因植物后，由它們所賦予的特性可通過有性交配轉移到其它植物中。可以使用許多標準的繁育技術中的任何一種，這依賴于所交配的種類。在本發(fā)明的一個實施方案中，所用的轉基因種子以這樣一種方式制成，即它們產(chǎn)生單一的酶，以便靈活地產(chǎn)生具有所需的每種酶活性比例的酶混合物。在另一個實施方案中，在單獨的轉基因植物株系的種子中包含一種以上的酶活性。含有目的酶的轉基因種子可在釀造工藝的一個期望的階段一起加入。另外，含有一種目的酶的轉基因種子可一種一種地加，每種都在釀造工藝的所期望的時刻加入。用本發(fā)明的工藝可產(chǎn)生一種高品質風味與色澤的麥芽，而無需處理麥芽中的酶活性。在本發(fā)明的工藝中可基本上繞過使用麥芽這一步。僅需少量麥芽以提供啤酒的風味與色澤。含有所需酶的轉基因種子，可以與谷粒的最適比例而使用，任選地，加入足夠量的麥芽以提供風味與色澤?？墒孪葘⑥D基因種子與谷物和麥芽混合?；蛘?，每種混合物、谷粒、轉基因種子和麥芽可在啤酒釀制工藝的不同階段被加入。優(yōu)選地，每種混合物、轉基因種子、谷粒和麥芽、或轉基因種子、谷粒和麥芽的混合物在加入釀造工藝之前先研磨。轉基因種子含平均水平的所需酶，其范圍為種子重量的0.001-2.5％，優(yōu)選地從0.01-1.0％，更優(yōu)選地從0.05-0.25％。依賴于種子中的表達水平，僅僅部分或全部常規(guī)用于釀造工藝的種子被轉基因種子取代。當達到高水平表達時，也可以加入不常用于釀造工藝的其它植物種類的轉基因種子而對釀造混合物改變不多。對于麥芽，與傳統(tǒng)的麥芽相比優(yōu)選地對部分麥芽進行特殊處理，其中在烘烤過程中麥芽被加熱至產(chǎn)生最大量的色澤與風味化合物。經(jīng)此處理剩余的酶活性可忽略不計。在本發(fā)明中公開的種子中酶的表達提供了在釀造工藝中避免加入外源微生物酶的可能性。含有酶的轉基因種子的制備成本大大低于用發(fā)酵方法生產(chǎn)酶的成本。此外，轉基因種子更方便于使用，因為其提供了穩(wěn)定的易于操作的酶的貯存形式并且易于處理。轉基因種子的使用帶來的成本下降和使用的方便性尤其與本發(fā)明的方法相關，因為克服了在啤酒釀制工藝中使用幾種來自于數(shù)種微生物發(fā)酵的不同酶的要求。本發(fā)明的工藝過程比使用麥芽作為酶來源的工藝過程更具可預見性，因為除了通過所導入的基因產(chǎn)生的酶外，轉基因種子不含高水平的其它酶活性。而且，本發(fā)明的工藝過程比使用微生物酶的工藝過程更具可預見性，因為微生物酶制劑帶有不確定的且水平變化的附帶活性。特別可應用本發(fā)明的領域之一是在禁止麥芽進口的非洲國家。在這種情況下酶可在高粱中表達，然后加到釀酒工藝中去。除了在酒精性飲料釀造中的應用外，也可預見其它應用，其過程中轉基因麥芽種可取代發(fā)芽的谷粒，磨場主使用發(fā)芽的大麥和/或小麥以標準化面粉的淀粉酶活性。也要在面粉中加入半纖維素酶(例如木聚糖酶)以提高用面粉做成的面團之氣體保留能力。在面粉中加入或使用的酶也可用轉基因麥芽種取代，它十分合適，因為酶可以無論如何都要用的谷粒的形式加入。同樣在焙烤工藝中也可加入酶以取代很多在面團中用到的麥芽。改善焙烤工藝的酶有木聚糖酶、淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、外肽酶。同樣為了焙烤目的，來自黑曲霉的葡萄糖氧化酶也可在種子中表達。實施例1內切β-1，4-木聚糖酶的活性測定內切木聚糖酶從在無菌罐和培養(yǎng)基中的黑曲霉的純培養(yǎng)物中獲得。培養(yǎng)基含適當?shù)奶荚春偷匆埠瑹o機鹽。發(fā)酵在30-40℃之間的恒溫進行，并且pH維持在3-5的范圍內。測定酶活性是通過水解懸浮在1MpH2.75的甘氨酸緩沖液中的來自燕麥斯佩耳特小麥的木聚糖(35g/L)。在47℃用毛細管粘度計(Ubbelhode型)確定此溶液的粘度。在時間T內測定液體的上彎月面流經(jīng)兩個參照點的所需時間dt。以T對1/dt作圖的斜率求出表觀動力學常數(shù)。1Lyx單位是該動力學常數(shù)每分鐘達到1的值時所需的酶量。實施例2外肽酶的活性測定培養(yǎng)生產(chǎn)菌株醬油曲霉(DS8351)。外肽酶活性以亮氨酸氨肽酶單位(Leu-A)表示1Leu-A是在pH7.2和20℃時從L-亮氨酸-對硝基苯胺每分鐘產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺所需的酶量。測定如下進行亮氨酸對硝基苯胺(SIGMA)以9mM濃度溶于水中。1ml該溶液與1.SmlpH7.2的0.1M磷酸鹽緩沖液混合。在t＝0時，加入0.Sml酶使其在20℃反應。15分鐘后，加入1ml1NHCl終止反應。空白的測定是在t＝0時加入1NHCl根據(jù)400nm時空白值(OD空白)和測定值(OD測定)確定光密度?；钚杂嬎闳缦?OD空白-OD測定)4A＝-------------------x----------Leu-A/ml9.8×150.5實施例3阿拉伯呋喃糖苷酶的活性測定已從菌株黑曲霉或構巢曲霉(Aspergillusnidulans)培養(yǎng)物中獲得了同工酶A或同工酶B或阿拉伯木聚糖水解酶。通過對-硝基苯代-α-L-阿拉伯呋喃糖苷的水解測定同工酶A和B的活性。1ARF單位是在GunataZ.等所描述的測定條件下(農(nóng)業(yè)食物化學雜志(J.AgricFood.Chem.)38，772，1989)，每分鐘解離出1μmol對硝基苯酚所需的酶量。實施例4糖化淀粉酶的活性測定糖化淀粉酶獲自在無菌發(fā)酵罐和培養(yǎng)基中的Penicilliumemersonii的純培養(yǎng)物，該培養(yǎng)基包含適當?shù)奶荚春偷匆约盁o機鹽。開始發(fā)酵后10-30小時(優(yōu)選地24小時)向發(fā)酵罐中加入麥芽糖糊精。溫度保持在40-50℃范圍內(優(yōu)選地45℃)并且pH保持在4.5-5.5的范圍內(優(yōu)選地5.0)。開始后40-55小時(優(yōu)選地48小時)停止發(fā)酵。根據(jù)BETAMYL實驗測定糖化淀粉酶的活性，所需試劑等可購自MEGAZYME，愛爾蘭。1BTU是在pH6.2和40℃時從Megazyme的商品化底物產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚所需的酶量。實施例5用微生物酶制備麥芽汁麥芽汁由粗制的大麥谷粒制備，大麥品種為PLAISANT。用EBCMIAG研磨機研磨大麥達到壓濾器型顆粒測量儀的要求。57g所得研磨后的大麥懸浮于300ml溫水(50℃)并且包含650Lyx單位的內切-β-(1，4)-木聚糖酶850ARF單位的阿拉伯呋喃糖苷酶18mgB.A.T.S.(熱穩(wěn)定的淀粉酶)6mgBrewersProtease(+)(內切蛋白酶)1mgFiltraseL3000(+)(β-(1，3；1，4)-葡聚糖酶在50℃保溫30分鐘然后升到63℃(速率1℃/分鐘)；進一步在63℃保溫30分鐘然后升到72℃(速率1℃/分鐘)并在此溫度下保溫30分鐘。最終加熱到76℃(速率1℃/分鐘)并在此溫度下保溫5分鐘。加水以補償水的蒸發(fā)。然后將醪液倒入帶有Schleicher和Schull濾紙的漏斗中。和任何釀酒廠一樣，從過濾后的麥芽汁的密度確定產(chǎn)率；同時根據(jù)標準的EBC方法確定粘度與游離氨基酸(FAA)水平。測定的產(chǎn)率是71.5％，粘度是2.52mPa.s，游離氨基酸是66mg/l。實施例6糖化淀粉酶的比較從粗制的大麥谷粒制備麥芽汁，大麥品種是PLAISANT。在EBCMIAG研磨機中研磨大麥以達到壓濾器型顆粒測量儀的要求。57g所得的研磨后大麥懸浮于300ml溫水(50℃)中并且包含650Lyx單位的內切-β-(1，4)-木聚糖酶850ARF單位的阿拉伯呋喃糖苷酶18mgB.A.T.S.(熱穩(wěn)定的淀粉酶)6mgBrewersProtease(+)(內切蛋白酶)100Leu-單位外肽酶1mgFiltraseL3000(+)(β-(1，3；1，4)-葡聚糖酶)根據(jù)表1將糖化酶加到釀造混合物中。表1糖化酶的量在50℃保溫30分鐘然后升溫至63℃(速率1℃/分鐘)；進一步在63℃保溫30分鐘然后升至72℃(速率1℃/分鐘)，并在此溫度保溫30分鐘。最終加熱到76℃(速率1℃/分鐘)并在此溫度下保溫5分鐘。加水以補償水分蒸發(fā)。然后將醪液加到含Schleicher和Schull濾紙的漏斗中。和任何釀酒廠一樣，從過濾后麥芽汁的密度確定產(chǎn)率；同時根據(jù)標準EBC方法確定粘度與游離氨基酸(FAA)水平。表2中列出的所測定的產(chǎn)率、粘度和FAA的結果顯示用Penicillumemersonii的糖化酶作為BrewersFermex取代物后的效果，而不能從兩種酶同時用預期到真正的協(xié)同作用。尤其令人驚奇的是在增加FAA和減少粘度方面，Penicillumemersonii的淀粉酶有很強的正效應。表2結果實施例7構建含有一個種子特異性表達盒的二元載體使用OryzaSativa谷蛋白貯存蛋白的序列以獲得種子特異性表達，用這樣的方法構建了一個表達構建體(Zheng等，植物生理(1995)109；77-786)。這些序列可被來自相似地種子特異性基因的那些序列取代以達到與本發(fā)明的目標相同的目的。為構建種子特異性表達的表達構建體，來自OryzaSativa的谷蛋白(Gtl)基因啟動子和終止子序列用PCR技術合成，其中以基因組克隆Gtl(Okita等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)264，12573-12581，1989)作為模板。該基因表現(xiàn)種子特異性表達且它的編碼及側翼序列已被確定(EMBL，GenBank核苷酸序列資料庫，保藏號D00584))。合成了兩組寡核苷酸。一組可擴增包含Gtl5′側翼區(qū)域編碼一個XhoI/SphI片段的2.4kb片段。5′Gt1.15′GCACAATTCTCGAGGAGACCG3′5′Gt1.25′ATGGATGGCATGCTGTTGTAG3′另一組擴增3′側翼序列作為一個BamHI/EcoRI片段(725bp)3′Gt1.35′CCTCTTAAGGATCCAATGCGG3′3′Gt1.45CTTATCTGAATTCGGAAGCTC3′設計寡核苷酸使其在末端包含適當?shù)南拗菩悦盖形稽c以便用限制酶消化該片段后直接組裝表達構建體。根據(jù)發(fā)明混合物中的酶的基因可從下列文獻中獲得，內切木聚糖酶(分子微生物學(Mol.Mcrobol.)12，479-490，1994)，阿拉伯呋喃糖苷酶同工酶A和同工酶B(EP0506190)，來源于地衣芽孢桿菌的淀粉酶(EP0449376)，來源于解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶(細菌學雜志(J.Bact.)159，81l-819)和來源于解淀粉芽孢桿菌的葡聚糖酶(基因49，177-187，1986)。來源于青霉屬的糖化淀粉酶和來源于醬油曲霉的外肽酶的基因很容易由本領域中熟練的技術人員根據(jù)本描述從所示培養(yǎng)物所得純酶中闡明。優(yōu)化編碼表達于種子中的酶基因密碼子的使用以適于在單子葉植物中表達。為此合成了整個基因，為了克隆目的在ATG起始密碼子處引入BspHI位點，在TAA終止密碼子的下游處引入BamHI位點。包含Gtl5′側翼區(qū)域的2.4kbPCR產(chǎn)物用XhoI/SphI消化并克隆入用XhoI/SphI線性化的pSL1180載體。所得載體用SphI/BamHI線性化，并作為一個載體，與合成的酶編碼基因和任選地一個編碼靶向信號的寡核苷酸雙螺旋進行三重連接(three-wayligation)。靶向可指向囊泡、質外體、造粉質體或(帶有例如一個KDEL-保留信號)內質網(wǎng)。從該載體分離了一個片段，包含Gtl谷蛋白啟動子，任選的信號序列和合成基因的融合體。該片段與包含被BamHI/EcoRI消化的Gtl的3′終止子序列的725bpPCR產(chǎn)物以三重連接方式克隆于二元載體pMOG22(在大腸桿菌K-12菌株DH5α中，于1990年1月29日保藏于真菌菌種保藏中心，保藏號CBS101.90)實施例8包含在種子特異性表達盒內切木聚糖酶基因二元載體的構建取自黑曲霉的內切木聚糖酶基因按照大麥中密碼子的使用被優(yōu)化。所得DNA序列描述于SEQIDNO1。為了表達內切木聚糖酶基因，通過寡核苷酸雙螺旋完成胞外定向PRS.15′AACTTCCTCAAGAGCTTCCCCTTTTATGCCTTCCTTTGTTTTGGCCAATACTTTGTAGCTGTTACGCATGC3′PRS.23′GTACTTGAAGGAGTTCTCGAAGGGGAAAATACGGAAGGAAACAAAACCGGTTATGAAACATCGACAATGCGTACGGTACC5′其編碼煙草PR-S蛋白質的信號肽，而且為了進行三重連接，使用了被BspHI/BamHI消化的合成木聚糖酶基因。從該載體中分離了一個3.1kb的XhoI/BamHI片段，包含Gtl谷蛋白啟動子，PR-S信號序列和合成的木聚糖酶基因的融合體。該片段與包含用BamHI/EcoRI消化的Gtl3′終止子序列的725bpPCR產(chǎn)物以三重連接方式克隆到二元載體pMOG22中。所得載體命名為pMOG1265。實施例9大麥轉化使用根瘤土壤桿菌轉化未成熟的Hordeumvulgarecv.GoldenPromise的胚的方法通常如Tingay，S.等，植物雜志11(6)，1369-1376，1997所描述。簡要地，其方法如下提供起始材料的供體植物在人工氣候室中生長，條件為10-20℃，光照時間16小時，10,000-30,000lux和50-95％RH。于傳粉后的10-15天收獲未成熟種子并且在漂白溶液中消毒20-40分鐘。未成熟胚從初期的穎果中切下并用手術刀片去除胚軸。外植體盾片面朝上置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，在暗處于24℃溫育一段長為從16小時到7天的時間。胚浸沒在大約每毫升0.1-10×109個細菌的土壤桿菌懸浮液中5到20分鐘，其中該土壤桿菌含有包含編碼所選酶的DNA的構建體，然后轉移到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。隨即，胚在暗處于24℃溫育2到3天。共培養(yǎng)后，胚轉移至含抗生素的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中以殺死土壤桿菌，并直接與選擇劑一起開始轉基因細胞的篩選過程。篩選過程進行長達8周。轉移抗性胚胎發(fā)生愈傷組織種系到再生培養(yǎng)基，在24℃以不斷增加的光密度(500到3000Lux)溫育，光照時間為16小時。再生小植株被移至加或不加選擇劑的無激素或含高濃度細胞激動素的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。當根系發(fā)育后，小植株被移至土壤中并以自花傳粉長至成熟。實施例10進行了三個完整的試點釀造試驗。兩個釀造試驗組以大大減少的麥芽量(生原料的20％)進行，而對照組中的麥芽量正常(見表3)。兩個釀造試驗組中，研磨和過濾技術不同(見表3)。所有釀造的釀造圖如圖1所示。表3生原料的組成、過濾與研磨對于對照組混合物，8％的麥芽和玉米粗輾粉一起加入糊化器，另67％的麥芽加入轉化器。對于釀造試驗組，8％的未發(fā)芽大麥與玉米粗輾粉一起加入糊化器。另47％未發(fā)芽大麥和麥芽一起加入轉化器。表4每100kg生原料中加入的酶的編號及量酶1、2、4、5和7加到轉化器中，而酶3加到糊化器中(加入的酶編號及量見表4)釀造試驗組與對照組中麥芽汁加工結果(淀粉糖化和過濾)類似。在釀造廠中兩個釀造試驗組有類似表現(xiàn)。釀造試驗組生產(chǎn)出非常相似的麥芽汁，表明過濾與研磨中的不同并不重要。從實驗與對照組的啤酒的味道對比來看，認為所有三種啤酒有十分類似的味道。與對照組相比，發(fā)現(xiàn)釀造試驗組有更強的口感。這可能是由于分析麥芽汁時發(fā)現(xiàn)的更高水平的糊精造成的。與對照組相比，釀造試驗組的麥芽汁中的氨基酸水平較低，雖然可接受。氨基酸水平可通過加入外肽酶而增高(見實施例11)。釀造試驗組的啤酒被品嘗人員定級為與皮爾森型(pilsener)啤酒一樣好，表明用酶混合物部分代替麥芽生產(chǎn)出的啤酒比得上用在釀造工業(yè)中常用的麥芽量生產(chǎn)出的啤酒。實施例11進行了兩個完整的試點釀造試驗。釀造試驗組用減少的麥芽量進行而對照組用正常量的麥芽進行(見表5)。在Lautertun上進行過濾。釀造試驗組和對照組的釀造圖參見圖2。表5生原料組成對于對照混合物，8％的麥芽與玉米粗輾粉一起加入到糊化器中，另67％麥芽加到轉化器中。對于釀造試驗組8％未發(fā)芽的大麥與玉米糊輾粉一起加到糊化器中，另47％未發(fā)芽大麥與麥芽一起加到轉化器中。在釀造試驗組中，酶1-7加到轉化器中，而酶3也加到糊化器的內容物中(所用酶的編號和量參見表6)釀造試驗組與對照組中麥芽汁加工結果(淀粉糖化和過濾)類似。釀造試驗組與對照組的麥芽汁中游離氨基酸氮含量類似。釀造試驗組生產(chǎn)出的啤酒通過品嘗被認為有與對照組十分類似的味道。釀造試驗組的啤酒被品嘗人員定級為與皮爾森型啤酒一樣好，表明用酶混合物部分代替麥芽生產(chǎn)出的啤酒比得上用在釀造工業(yè)中常用的麥芽量生產(chǎn)出的啤酒。表6在釀造試驗組中每100kg生原料中加入的酶的編號和量實施例12來自7個株系的轉基因大麥谷粒，每種各表達表9所示的一種酶，將其以這樣的量混合以制成轉基因麥芽種，當它以粗大麥的10％混和時，提供如表9所示的酶活性。轉基因麥芽種制劑與非轉基因大麥一起混和且被研磨，共占釀造試驗中生原料的55％。釀造試驗組中糊化器與轉化器中的生原料組分如表8所示。對于對照組混合物，8％的麥芽與玉米粗輾粉一起加到糊化器中。生原料的剩余部分用于轉化器中。在轉化器和糊化器中，轉基因麥芽種的分布產(chǎn)生的酶活性如表10所示。進行兩個釀造試驗。釀造試驗組以減少的麥芽量進行而對照組以正常量的麥芽進行(見表7)。過于釀造試驗組使用了較高的糖化溫度(見表7)。在Lautertun上進行過濾。對照組和釀造試驗組的釀造圖見圖2。表7生原料的組分表8釀造試驗組中每100kg總量中生原料的組成釀造試驗組與對照組的麥芽汁加工結果(淀粉糖化和過濾)相似。通過品嘗，認為釀造試驗組生產(chǎn)出來的啤酒有與對照組相似的味道。通過品嘗，釀造試驗組被定級為經(jīng)典的麥芽啤酒，表明麥芽可(部分地)被由表達這些酶的轉基因種子表達的酶代替。表9在釀造實驗1中通過加入轉基因麥芽種而加入的酶活性的量(單位每100kg生原料)<p>序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名MOGENInternationalnv(B)街道Einstei1weg97(C)城市Leiden(E)國家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)2333CB(G)電話31-(0)71-5258282(H)傳真31-(0)71-5221471(A)姓名Gist-brocadesN.V.(B)街道Postbus1(C)城市Delft(E)國家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)2600MA(G)電話31-(0)15-2799111(H)傳真31-(0)15-2793957(ii)發(fā)明名稱使用轉基因麥芽種生產(chǎn)酒精性飲料的改進工藝(iii)序列數(shù)目8(iv)計算機可讀信息(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朎P96202195.2(B)遞交日1996年8月5日(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度558個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義非(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..558(D)其它信息/產(chǎn)物＝“成熟蛋白質”(xi)SEQIDNO1的序列描述ATGAGCGCGGGAATCAACTACGTCCAGAACTACAATGGCAACCTCGGC48MetSerAlaGlyIleAsnTyrValGlnAsnTyrAsnGlyAsnLeuGly151015GACTTTACTTACGACGAGTCAGCGGGAACTTTCAGCATGTATTGGGAG96AspPheThrTyrAspGluSerAlaGlyThrPheSerMetTyrTrpGlu202530GATGGCGTGTCCTCAGACTTCGTCGTGGGACTGGGCTGGACCACTGGA144AspGlyValSerSerAspPheValValGlyLeuGlyTrpThrThrGly354045TCATCCAATGCGATCACCTACAGCGCCGAGTACTCCGCGTCAGGATCA192SerSerAsnAlaIleThrTyrSerAlaGluTyrSerAlaSerGlySer505560GCCTCCTATCTGGCCGTGTACGGATGGGTGAACTACCCGCAGGCCGAG240AlaSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpValAsnTyrProGlnAlaGlu65707580TACTACATCGTGGAGGATTACGGAGATTACAACCCATGCAGCTCAGCG288TyrTyrIleValGluAspTyrGlyAspTyrAsnProCysSerSerAla859095ACCTCCCTCGGAACTGTGTACAGCGACGGCTCCACCTACCAGGTCTGC336ThrSerLeuGlyThrValTyrSerAspGlySerThrTyrGlnValCys100105110ACCGACACCCGCACTAACGAGCCGTCAATCACCGGCACTTCCACCTTC384ThrAspThrArgThrAsnGluProSerIleThrGlyThrSerThrPhe115120125ACCCAGTACTTCAGCGTGCGCGAGTCCACTCGCACCTCAGGAACCGTG432ThrGlnTyrPheSerValArgGluSerThrArgThrSerGlyThrVal130135140ACCGTCGCGAACCACTTCAACTTCTGGGCGCAGCACGGATTCGGCAAC480ThrValAlaAsnHisPheAsnPheTrpAlaGlnHisGlyPheGlyAsn145150155160AGCGACTTTAACTACCAGGTGGTCGCAGTGGAGGCATGGTCAGGAGCG528SerAspPheAsnTyrGlnValValAlaValGluAlaTrpSerGlyAla165170175GGCTCAGCGTCCGTCACTATCAGCTCCTG558GlySerAlaSerValThrIleSerSer180185(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度185個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲類型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)SEQIDNO2的序列描述MetSerAlaGlyIleAsnTyrValGlnAsnTyrAsnGlyAsnLeuGly151015AspPheThrTyrAspGluSerAlaGlyThrPheSerMetTyrTrpGlu202530AspGlyValSerSerAspPheValValGlyLeuGlyTrpThrThrGly354045SerSerAsnAlaIleThrTyrSerAlaGluTyrSerAlaSerGlySer505560AlaSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpValAsnTyrProGlnAlaGlu65707580TyrTyrIleValGluAspTyrGlyAspTyrAsnProCysSerSerAla859095ThrSerLeuGlyThrValTyrSerAspGlySerThrTyrGlnValCys100105110ThrAspThrArgThrAsnGluProSerIleThrGlyThrSerThrPhe115120125ThrGlnTyrPheSerValArgGluSerThrArgThrSerGlyThrVal130135140ThrValAlaAsnHisPheAsnPheTrpAlaGlnHisGlyPheGlyAsn145150155160SerAspPheAsnTyrGlnValValAlaValGluAlaTrpSerGlyAla165170175GlySerAlaSerValThrIleSerSer180185(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義非(vi)初始來源(A)生物Nicotianatabacum(xi)SEQIDNO3的序列描述AACTTCCTCAAGAGCTTCCCCTTTTATGCCTTCCTTTGTTTTGGCCAATACTTTGTAGCT60GTTACGCATGC71(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度80個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義是(xi)SEQIDNO4的序列描述CCATGGCATGCGTAACAGCTACAAAGTATTGGCCAAAACAAAGGAAGGCATAAAAGGGGA60AGCTCTTGAGGAAGTTCATG80(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義非(xi)SEQIDNO5的序列描述ATGGATGGCATGCTGTTGTAG21(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義非(xi)SEQIDNO6的序列描述GCACAATTCTCGAGGAGACCG21(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義非(xi)SEQIDNO7的序列描述CCTCTTAAGGATCCAATGCGG21(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設非(iii)反義非(xi)SEQIDNO8的序列描述CTTATCTGAATTCGGAAGCTC2權利要求1.一種用于酒精性飲料生產(chǎn)的工藝，其中加入了一種酶混合物，該混合物含有至少一種內切β(1，4)-木聚糖酶、一種阿拉伯呋喃糖苷酶、一種α-淀粉酶、一種內切蛋白酶和一種β-(1，3；1，4)-葡聚糖酶。2.一種如權利要求1的工藝，其中的混合物也包含一種糖化淀粉酶。3.一種如權利要求1或2的工藝，其中的混合物也包含一種外肽酶。4.一種如權利要求1至3中任一項的工藝，其特征在于該酒精性飲料是啤酒。5.一種如權利要求1至4中任一項的工藝，其特征在于每一種所述的酶由單獨的轉基因植物株系的種子提供。6.一種如權利要求1至4中任一項的工藝，其特征在于超過一種的酶由單獨的轉基因植物株系的種子提供。7.一種如權利要求1至6中任一項的工藝，其特征在于至少一種酶由單獨的植物株系的種子提供。8.一種如權利要求5至7中任一項的工藝，其特征在于該轉基因植物株系是大麥植物株系。9.用于酒精性飲料生產(chǎn)的轉基因種子，其表達該飲料生產(chǎn)工藝中必需的酶。10.如權利要求9的轉基因種子，其表達選自如下的酶α-淀粉酶、內切-β-1，4-木聚糖酶、β-1，3-1，4-葡聚糖酶、內切蛋白酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖化淀粉酶和外肽酶。全文摘要本發(fā)明涉及一種用包含內切－β(1,4)木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α－淀粉酶、內切蛋白酶和β－(1,3;1,4)－葡聚糖酶并且任選地,包括糖化淀粉酶與/或外肽酶的酶的混合物生產(chǎn)酒精性飲料比如啤酒或威斯忌的工藝。優(yōu)選的是由轉基因種子提供的釀造過程所必需的酶的混合物。只需少量麥芽以產(chǎn)生風味與色澤。文檔編號C12N9/32GK1230225SQ97197918公開日1999年9月29日申請日期1997年7月23日優(yōu)先權日1996年8月5日發(fā)明者J·索普,R·F·比德克申請人:莫根國際股份有限公司,吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司