專利名稱：C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法制備的C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
人類在組織損傷的急性期，肝臟合成的一些血 漿蛋白顯著增加，這些蛋白質(zhì)通稱為急性時相蛋白，C反應(yīng)蛋白(CRP)是急性時相蛋白中變化最顯著的一種。CRP在正常人血清中其含量極微；在組織受到損傷、炎癥、感染或腫瘤破壞時CRP可以在數(shù)小時內(nèi)急劇上升，CRP被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的早期診斷及鑒別診斷，其升高可見于I、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎癥性疾病,如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性血管炎、多肌痛風(fēng)濕病；2、術(shù)后感染及并發(fā)癥的指標手術(shù)后病人CRP升高，術(shù)后7-10天CRP水平應(yīng)下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并發(fā)感染或血栓栓塞；3、可作為細菌性感染和病毒性感染的鑒別診斷大多數(shù)細菌性感染會引起患者血清CRP升高，而病毒性感染則多數(shù)不升高。近年來研究發(fā)CRP水平還同未來發(fā)生心血管疾病密切相關(guān)，大量研究資料表明，動脈粥樣化也是一個慢性炎癥過程，CRP輕度升高與冠狀動脈事件、中風(fēng)及周圍血管病相關(guān)，是一項獨立的危險因素；高敏CRP(Hs-CRP)水平升高者發(fā)生急性腦卒中的幾率是正常健康人的2倍，發(fā)生心肌梗死的幾率是正常者的3倍。2003年歐洲高血壓防治指南(ESH/ESC)正式推薦，高血壓患者需檢測hs-CRP水平。目前國內(nèi)用于全自動生化儀的免疫透射比濁法試劑CRP出現(xiàn)了兩種普通CRP有較高的線性但靈敏度不好，高敏CRP有較高的靈敏度但線性較低，用途也有所區(qū)別；近幾年來，隨著檢驗技術(shù)的發(fā)展，開始出現(xiàn)了一種全程CRP，這種CRP即能滿足較高的靈敏度，又能滿足較高的線性，用途更廣。但全程CRP檢測試劑主要采用化學(xué)發(fā)光法或乳膠法制備，只適合血清或血漿樣本，不適合全血樣本。尚未有采用免疫層析膠體金技術(shù)制備的全程CRP檢測試劑盒。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，基本原理如下利用膠體金標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對抗原或抗體，檢測時當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測T線，在一定的條件下，T線的強弱和樣品中的濃度呈正相關(guān)或負相關(guān)，從而實現(xiàn)檢測。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒，具有全程定量或半定量檢測能力，操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。[0008]C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒，其特征在于試劑盒由試紙卡、比色卡和免疫層析結(jié)果判讀記錄儀構(gòu)成。所述試紙卡結(jié)構(gòu)為在塑料底板(I) 一端粘貼上樣墊(2)，上樣墊的一端緊密壓接含有標記抗人C反應(yīng)蛋白特異性抗體的膠體金墊(3)，膠體金墊一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分離的檢測線T(5)和質(zhì)控線C(6)，檢測線為和標記抗體配對的CRP抗體，質(zhì)控線為抗鼠IgG抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(7)形成試紙，試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。所述試紙卡的抗體為高敏CRP配對抗體，分別識別CRP識別不同表位，抗體可以為純化的單克隆抗體或多克隆抗體。所述試紙卡的NC膜為孔徑8-12微米的多孔樣結(jié)構(gòu)膜，上樣墊為玻璃纖維膜或無 紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。所述比色卡是白色背景上印有系列不同深淺紅色線條的紙板，用于對檢測結(jié)果的對比判定。不同深淺的紅色線條共6條，分別對應(yīng)l、3、10、20、50、200mg/L的CRP濃度。所述免疫層析結(jié)果判讀記錄儀是一種光學(xué)檢測系統(tǒng)，用于對檢測結(jié)果的定量判定，對CRP的檢測范圍為0-200mg/L。所述試紙卡，NC膜抗體的包被過程為以O(shè). OlM pH7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將CRP抗體配制成O. 6-2mg/ml的溶液,將抗鼠IgG配制成l_2mg/ml的溶液,用噴膜儀在NC膜上部和下部以1-1. 5ul/cm的參數(shù)進行分別劃線，包被C、T線，劃線后將NC膜在干燥間，溫度20-25°C，濕度小于30%，干燥2-5小時。所述試紙卡，膠體金墊制備過程為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm的膠體金溶液，制備完成后取IOOml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用O. 2M K2CO3調(diào)至PH8. O,按IOOml膠體金溶液加入O. 5_2mg和包被CRP配對的另一株CRP抗體，室溫攪拌2小時，加入終濃度為O. 5%牛血清白蛋白，O. 5%聚乙二醇20000封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至50ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間，溫度20-25°C，濕度小于30%，干燥2-5小時，制成膠體金墊。所述試紙卡的裝配過程為在干燥室內(nèi)，溫度20_25°C，濕度小于40%，取塑料底板，將已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將膠體金墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的1/5粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/3粘貼；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10粘貼；最后用裁剪機將貼好的塑料板切成3-5_寬的試紙條,再裝入塑料卡內(nèi)，形成試劑試紙卡。所述試劑盒，檢測方法為1)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取10 μ I血清、血漿樣本，樣本為全血時吸取20ul樣本，加入潔凈的離心管中，再加入500ul樣本稀釋液(生理鹽水或PBS)，充分混勻；3)用移液槍吸取IOul稀釋后的樣本加入到樣本孔中，再立即在下部的緩沖液孔中加入100 μ L樣本稀釋液，15-20分鐘內(nèi)用免疫層析結(jié)果判讀記錄儀或比色卡(半)定量判定結(jié)果；4)儀器判定時，設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉內(nèi)進行檢測，儀器將顯示出樣品濃度的定量測定結(jié)果；5)用比色卡判定結(jié)果時，將試紙卡T線的顏色和比色卡上標準線的顏色深淺進行對比，半定量判定樣品的濃度區(qū)間。[0018]本實用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)制備的C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒，定量檢測范圍寬，包含高敏和普通CRP測定試劑盒的測定區(qū)間，同時適合血清、血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。

圖I是C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒的試紙卡附圖符號說明 I :塑料底板；2 :上樣墊；3 :膠體金墊；4 NC膜；5 :檢測線T ;6 :質(zhì)控線C ;7 :吸樣墊
具體實施方式
實施例C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒制備及檢測I主要材料I. ICRP特異性配對抗體、CRP標準品芬蘭MEDIX限公司產(chǎn)品；鼠抗人IgG抗體美國Arista公司產(chǎn)品；氯金酸Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純試劑。I. 2臨床樣本由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，共200份，其中血清樣本100份，血漿和全血樣本各50份，CRP含量分布區(qū)間為O. l-300mg/L之間的定值血清。I. 3免疫層析結(jié)果結(jié)判讀記錄儀型號NS001，天津中新科炬生物制藥有限公司
女口
廣叩ο2 方法2. ICRP抗體膠體金標記氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30_40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用O. 2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7. 5、pH8. O和pH8. 5。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入O. 5mg、lmg、l. 5mg將標記用CRP抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時，再加入到終濃度為O. 5%的PEG2000和O. 5%的BSA進行封閉20min，標記結(jié)束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按50%原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液中(PH8.0，含BSA，羊血清，蔗糖和表面活性劑)。然后將標記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無紡布上，在溫度20_25°C，相對濕度在
<30%的干燥間干燥2-5小時，制成膠體金墊。2. 2NC膜包被用 O. OlM pH7. 2PBS將包被CRP抗體稀釋成O. 6mg/ml、lmg/ml、I. 5mg/ml,鼠抗人IgG分別稀釋成lmg/ml、2mg/ml,然后用噴膜儀在NC膜上按I. 2ul/cm進行分別劃線包被，包被完成后將NC膜在在溫度20-25°C，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2_5小時。2. 3試紙卡組裝在干燥室內(nèi)，溫度20_25°C，濕度小于40%，取塑底板，將已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘貼，將膠體金墊裁切成合適的寬度，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的1/5粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/3粘貼；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10粘貼；最后用裁剪機將貼好塑料板切成3-5mm寬的試紙條,再裝入塑料卡內(nèi)，形成試紙卡。2. 4試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標記、包被的試劑進行組合配對，制備小樣，利用CRP標準品對試劑進行測試，尋找最佳組合。2. 5比色卡制備和儀器曲線參數(shù)設(shè)置確定好試紙工藝參數(shù)后，分別用1、3、10、20、50、200mg/L的CRP標準品對試紙進行測定，不同濃度的標準品顯示出不同強度色帶，將相應(yīng)強度的色帶印刷到比色卡上，完成比色卡制備；將相應(yīng)強度的色帶數(shù)字化后輸入免疫層析結(jié)果判讀記錄儀中，完成儀器曲線參數(shù)設(shè)置。2. 6檢測方法I)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取10 μ I血清、血漿樣本，樣本為全血時吸取20ul樣本，加入潔凈的離心管中，再加入500ul樣本稀釋液(PBS)，充分混勻；3)用移液槍吸取IOul稀釋后的樣本加入到樣本孔中，再立即在下部的緩沖液孔中加入100 μ L樣本稀釋液(PBS)，15-20分鐘內(nèi)用免疫層析結(jié)果判讀記錄儀或比色卡(半)定量判定結(jié)果；4)儀器判定時，設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉·內(nèi)進行檢測，儀器將顯示出樣品濃度的定量測定結(jié)果；5)用比色卡判定結(jié)果時，將試紙卡T線的顏色和比色卡上標準線的顏色深淺進行對比，半定量判定樣品的濃度區(qū)間。2. 7臨床樣本檢測試劑制備完成后，按檢測方法對所有臨床樣本進行檢測，并分析檢測結(jié)果。3 結(jié)果3. I試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測結(jié)果,確定了試紙的最佳標記pH值為8. O ；CRP抗體最佳標記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為20mM硼酸鹽緩沖液，ρΗ8· 0，含O. 5% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，O. 2% Tween20 ;最佳包CRP抗體濃度為I. 5mg/ml。檢測結(jié)果的最佳判定時間為15-20分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時可能需要適當(dāng)調(diào)整。3. 2臨床樣本檢測對200份臨床定值樣本檢測，用儀器定量判定結(jié)果時，在檢測范圍內(nèi)的195份樣品平均偏差值均小于15%，最大偏差小于20%，R2 > O. 97，一致性系數(shù)> O. 88。用比色卡判定結(jié)果時，區(qū)間判定結(jié)果和樣本值的符合率為95. 3%，一致性系數(shù)>
O.85。檢測結(jié)果表明制備的檢測試劑盒性能良好，適合用于臨床檢測，滿足不同客戶不同檢測場合的差異化需要。
權(quán)利要求1.一種C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒，其特征在于試劑盒由試紙卡、比色卡和免疫層析結(jié)果判讀記錄儀構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試紙卡結(jié)構(gòu)為在塑料底板(I)一端粘貼上樣墊(2)，上樣墊的一端緊密壓接含有標記抗人C反應(yīng)蛋白(CRP)特異性抗體的膠體金墊(3)，膠體金墊一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分離的檢測線T (5)和質(zhì)控線C ￠)，檢測線為和標記抗體配對的CRP抗體，質(zhì)控線為抗鼠IgG抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(7)形成試紙，試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。
3.根據(jù)權(quán)利要求I和2所述的試劑盒，其特征在于所述試紙卡的抗體為高敏CRR配對抗體，分別識別CRP識別不同表位，抗體可以為純化的單克隆抗體或多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I和2所述的試劑盒，其特征在于所述試紙卡的NC膜為孔徑8-12微 米的多孔樣結(jié)構(gòu)膜，上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述比色卡是白色背景上印有系列不同深淺紅色線條的紙板，用于對檢測結(jié)果的對比判定。不同深淺的紅色線條共6條，分別對應(yīng)l、3、10、20、50、200mg/L 的 CRP 濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于免疫層析結(jié)果判讀記錄儀是一種光學(xué)檢測系統(tǒng)，用于對檢測結(jié)果的定量判定，對CRP的檢測范圍為0-200mg/L。
專利摘要本實用新型專利公開了一種C反應(yīng)蛋白快速全程定量免疫層析檢測試劑盒，其特征在于試劑盒由試紙卡、比色卡和免疫層析結(jié)果判讀記錄儀組成。試紙卡結(jié)構(gòu)為在塑料底板(1)一端粘貼上樣墊(2)，上樣墊的一端緊密壓接含有標記抗人C反應(yīng)蛋白(CRP)特異性抗體的膠體金墊(3)，膠體金墊一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分離的檢測線T(5)和質(zhì)控線C(6)，T線為和標記抗體配對的CRP抗體，C線為抗鼠IgG抗體，NC膜的另一端連接吸樣墊(7)形成試紙，試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。檢測時用免疫層析結(jié)果判讀記錄儀或比色卡對結(jié)果進行定量或半定量判定，具有操作簡便、快速、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK202794189SQ20122039946
公開日2013年3月13日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者李洲, 楊發(fā)青, 王程飛 申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司