專利名稱：用物質(zhì)加減法對質(zhì)譜判斷滯留層析中蛋白指紋的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法，具體指用于生物樣品分析的蛋白指紋法。本發(fā)明還涉及用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組并采用計算機可讀取的條碼格式(蛋白指紋)分析的蛋白指紋法。所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定采用了加減法，即加入或減去某種物質(zhì)來確定其質(zhì)譜分子量的意義。蛋白指紋法確定某生物樣品在第一和第二(加入或減去某種物質(zhì))樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了其分子量在生物樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。
背景技術(shù)：
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于診斷疾病，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質(zhì)表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行定性鑒定和定量分析。
如，一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內(nèi)等電點聚焦先分離蛋白質(zhì)，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行第二次分離。結(jié)果得到一張根據(jù)等電點范圍(凈電荷)和大小(質(zhì)量)來區(qū)分蛋白質(zhì)的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特征—質(zhì)量和等電點(pl)。其次，各維度的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區(qū)分質(zhì)量差異小于5％或pl差異的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量表達的生物分子。第四，無法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測出疾病的已知標(biāo)記。但是，制備特異性結(jié)合標(biāo)記并且能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據(jù)多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多維度分析卻困難而費時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質(zhì)譜的方法測定蛋白質(zhì)是較新的方法。但沒有與滯留層析法聯(lián)合應(yīng)用時，質(zhì)譜分析方法只能對蛋白質(zhì)進行定性分析，無法進行定量分析，尤其在是樣品中混合物復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量極小的情況下。
蛋白指紋技術(shù)最早源于馬鈴薯/土豆品種鑒定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。當(dāng)時用電泳技術(shù)來區(qū)別分不同品種土豆。因為不同品種的土豆在電泳下有不同的蛋白指紋組合。由于人體細胞蛋白比土豆要復(fù)雜的多，故僅用電泳來鑒別疾病的蛋白指紋遠遠不能滿足臨床需要。
滯留層析法是上世紀90年代開發(fā)的一種新的生物分析方法(Singh TK，F(xiàn)ox PF，HealyA.J Dairy Res.62，629-640；1995 and Siegel MM，Tabei K，Bebernitz GA，Baum EZ.J Mass Spectrom.33，264-273；1998)，有人將其用于分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的研究中。滯留層析中先將待測樣品與選定的吸附劑結(jié)合，然后檢測滯留在吸附劑上的分析物。與常規(guī)層析不同，進行滯留層析時無需將分析物先從吸附劑上洗脫，而是直接進行檢測。滯留層析與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用其優(yōu)點是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物分子量。并且能夠根據(jù)分子量大小將生物樣品組成按條碼格式排列。用滯留層析法可以將血清蛋白排出成千上萬條分子量帶。但目前人血液中只有289個蛋白分子量可以被臨床應(yīng)用，未見到文獻有用滯留層析法進行蛋白指紋鑒定分析并且解讀出成千上萬條分子量帶的方法學(xué)(Anderson NL and Anderson NG，Molecular & Cellular Proteomics 1845-867；2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種確定某生物樣品在第一和第二樣品中蛋白指紋差異存在的意義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖；B)測定生物樣品在第二樣品中(減去某種物質(zhì)某種特異性單克隆抗體柱子處理過的，或加入某種物質(zhì))相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖；和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之間的差異。利用加減物質(zhì)法來判斷兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了分析物在樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。
本發(fā)明采用蛋白指紋法對蛋白質(zhì)組進行鑒別。
蛋白指紋法是通過鑒別檢測特定的蛋白質(zhì)組用于疾病診斷。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)的定義是研究一組蛋白質(zhì)在細胞終身表達的變化狀態(tài)。蛋白質(zhì)組學(xué)的目的之一是鑒定和描述由于不同細胞差異表達的有機生物分子。通過比較表達情況可以鑒定細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的區(qū)別。鑒別出可作為某種疾病標(biāo)志的蛋白質(zhì)組，可用于該疾病的診斷及治療藥物的篩選。
本發(fā)明所述的鑒別檢測蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。
本發(fā)明用滯留層析法從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出并捕獲到用于檢測的蛋白質(zhì)組。滯留層析法是將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測系統(tǒng)所無法達到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細胞或組織液提取物中差異表達的蛋白質(zhì))。根據(jù)吸附劑/洗脫劑組合的化學(xué)特性測定包括分子量在內(nèi)的理化特征的蛋白質(zhì)。詳述本方法如下I吸附劑包含陰離子，陽離子，親水，疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有捕獲生物樣品中蛋白質(zhì)的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì)，配位共價金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基)。更具體的說，可以用陰離子吸附劑捕獲生物樣品中所有帶陽離子的蛋白質(zhì)，然后用質(zhì)譜儀去讀出分子量(條碼帶)。
II信息處理在特定洗脫條件下檢測被吸附結(jié)合的分析物提供了有關(guān)樣品中分析物及其化學(xué)特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結(jié)合特性。與吸附劑結(jié)合的分析物具有使得結(jié)合成為可能性的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結(jié)合。強陽離子分子只有在很強的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結(jié)合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離和與不具有結(jié)合所需的相應(yīng)化學(xué)特性的分析的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學(xué)特性的一類或單一分析物。采集有關(guān)分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細分辨混合物中的分析物，而且提供有關(guān)分析物的化學(xué)信息，這些信息本身就可以完成對他們的鑒定。這種數(shù)據(jù)被稱為“滯留數(shù)據(jù)”。
用可編程計算機分析滯留試驗得出的數(shù)據(jù)是最簡單的。計算機程序一般包括一個儲存編碼的可讀介質(zhì)。某計算機編碼進入存儲，其中包含了基質(zhì)陣列上各種征點的位置，該處的吸附和用來洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某選擇性的一組特征。計算機還包括這樣的編碼，它們接受來自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號強度數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)指示所測分析物的數(shù)量，可能包括所測各分析物的信號強度和測得的分子量。
計算機還具有處理數(shù)據(jù)的編碼。實施例之一中，處理方法涉及形成一個分析物識別特征概況。例如，可將據(jù)分子量測得的特定分析物的滯留數(shù)據(jù)根據(jù)特定的結(jié)合特性(例如與陰離子吸附劑)分類。收集到的數(shù)據(jù)提供某特定分析物化學(xué)特征的概況。滯留特性反映分析物功能，后者繼而反映結(jié)構(gòu)。例如，根據(jù)不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數(shù)據(jù)所揭示的信息可以得出某蛋白質(zhì)的等電點。這進而反映出該蛋白質(zhì)內(nèi)離子氨基酸的大致數(shù)量。所以，計算機可能包含將結(jié)合信息轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)信息的編碼。而且，對分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識別特征，這可以由結(jié)合或質(zhì)量差異反映出來。
得出的數(shù)據(jù)即蛋白指紋，它可以各種格式顯示。一種格式中，信號強度顯示成分子量的函數(shù)圖。另一種格式又稱“條碼格式”，其中，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示，得出外觀類似商場上所用條碼帶讀取商品名稱。
III滯留層析分離方法的組合—差異蛋白質(zhì)展示實施例對該方法進行了詳細的描述。生物樣品通常包含數(shù)以百千計的蛋白質(zhì)。人們可能希望準(zhǔn)確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，陰離子吸附劑。
舉例，如用陰離子吸附劑，可以將某種pH值狀況下的血清中所有帶正點的蛋白質(zhì)捕獲至吸附劑上。然后用質(zhì)譜讀出各自的分子量，按分子量大小排列出條碼格式。計算機將記住這種條碼格式。第二步，將這份血清通過一個單克隆抗體柱子(如抗胰島素或抗生長激素)，胰島素或生長激素被捕獲并留在柱子上。然后，用上述同樣方法去分析，就可以產(chǎn)生沒有胰島素或生長激素的條碼格式。
通過分析兩種條碼格式差異，計算機能夠知道某種條碼帶(分子量)是來自于胰島素或生長激素。
本發(fā)明利用這種方法學(xué)，可無限量地解讀每種條碼帶中的肽類、蛋白質(zhì)或小分子(如血清藥物)指紋的意義。
這種方法學(xué)可以比目前所有生化診斷手段(ELISA，免疫熒光法)更有優(yōu)勢。
IV鑒定生物材料間差異表達的分析物的方法本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了鑒定在兩種以上樣品中差異表達的有機生物分子，特別是蛋白質(zhì)的方法?！安町惐磉_”指兩樣品間分析物量或質(zhì)上的差異。這些差異可能緣于蛋白質(zhì)表達的任一階段，該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組分辨率高、可比較的分析物數(shù)量多的制備條件。
然后，比較識別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達的正調(diào)控或負調(diào)控。差異滯留還包括分析物質(zhì)的差異。例如，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的不同會造成識別圖的不同，檢測時表現(xiàn)為結(jié)合特性差異(例如，如果蛋白質(zhì)被糖基化與凝集素結(jié)合將不同)或質(zhì)量差異(例如翻譯后切割的不同)。這種分析也可以用可編程計算機進行。
本發(fā)明提供一種統(tǒng)一的操作系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)功能，細胞功能和生物整體功能的發(fā)現(xiàn)和診斷。
更具體的說，根據(jù)分析物在至少兩種不同選擇條件下吸附固定相的能力(例如陰離子/陽離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質(zhì)譜)根據(jù)質(zhì)量在第二維度上分離分析物，進一步檢測已分離的分析物。分析物所吸附的性質(zhì)提供了分析物的物理化學(xué)信息。
在實施例中，所述的方法包括I)分析物與確切位置上的第一選擇性條件(吸附劑)接觸，使得分析物被吸附劑保留。II)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物。III)檢測步驟包括用激光解吸質(zhì)譜測定分析物的質(zhì)量。
洗脫條件的差異在于pH，緩沖能力，離子強度，水結(jié)構(gòu)特征，除垢劑種類，除垢劑強度，疏水性或介電常數(shù)。
本發(fā)明提供一種確定某分析物在第一和第二品中是否存在差異(例如差異表達)的方法。該方法可以用于通過差異蛋白質(zhì)展示來檢測差異蛋白表達的組合方法。該方法包括A)測定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；B)測定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和C)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在的意義。
實施例之一是測定某種蛋白指紋在生物樣品中的意義。
滯留層析及蛋白指紋方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的滯留層析及蛋白指紋方法的一個操作方案實例。
1.樣品處理將生物樣品稀釋在溶液中。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點樣在基質(zhì)(包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑)一個位點上。
3.洗滌用結(jié)合溶劑洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μL洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進幾次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μL洗滌液重復(fù)以上步驟。
用水徹底洗滌整個陣列。
自然干燥吸附劑支持物。
加0.5μL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。
自然干燥吸附劑支持物。
用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀用氮激光儀(337nm)和80cm飛行管分析陣列分析滯留與各位點的蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。
蛋白指紋圖譜的重大意義在于定期監(jiān)測人體活動或血液中蛋白指紋的動態(tài)變化狀態(tài)。
本發(fā)明提供的方法的特點為(1)準(zhǔn)確滯留層析的一個特點是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。所以，滯留層析可提供有關(guān)滯留分析物化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。
滯留層析與常規(guī)層析存在以下區(qū)別。首先，滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規(guī)層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然后進行檢測。用常規(guī)層析方法常常檢測不出吸附劑上洗脫下的分析物。第二，滯留層析與解吸質(zhì)譜檢測相結(jié)合提供了毫微微摩爾級的優(yōu)良靈敏以及極高的分辨率。第三，在一定程度上，因為允許直接檢測分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供多樣品中分析物的快速維度的描述。第四，吸附劑可以于預(yù)先確定的排列，可定址位置附著于基質(zhì)上。這就能夠?qū)υ诓煌疵摋l件下接觸不同吸附位置(即，“親合性位置”或“位點”)的分析物進行并行處理。
蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的而氨基酸的平均質(zhì)量為100Da。質(zhì)譜直接分析有很強的準(zhǔn)確性，一般誤差率只有0.01％-0.1％。例如，檢測出7030Da及7110Da被配位共價金屬螯合劑表面的基質(zhì)所捕捉的蛋白，由于質(zhì)譜差率只有0.01％-0.1％，蛋白7030Da及7110Da不可能是同一種蛋白質(zhì)。因此，蛋白指紋法可分辨蛋白質(zhì)。
(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析。
(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進行疾病診斷時，無需對蛋白質(zhì)進行測序。本發(fā)明采用了計算機“條碼格式”，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復(fù)雜的診斷，如可用此“蛋白指紋”或條碼格式進行醫(yī)學(xué)分析。
具體實施例方式
實施例1 生物樣品中蛋白指紋圖譜差異表達區(qū)分意義(1)實驗方法一、材料1.標(biāo)本來源10例正常人血清，8例肺炎病人的血清。
2.試劑Protein A and G、人標(biāo)準(zhǔn)血清、人生長激素、胰島素(分子量5807Da)、抗胰島素抗體、抗人血清淀粉樣蛋白A抗體、乙腈、三氟乙酸、SINAPINIC酸(Sinapinicacid)、CHAPS、Urea、NaAC、Tris-HCl均購自Sigma公司或贈送。
3.質(zhì)量控制A.人標(biāo)準(zhǔn)血清(Sigma)，加入人生長激素(Sigma)，調(diào)制人生長激素在標(biāo)準(zhǔn)人血清中的濃度為50ng/ml。B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用上述人標(biāo)準(zhǔn)血清，將人生長激素的峰值為50％時的激光能量設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)值。
二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10,000轉(zhuǎn)/分，4℃離心2分鐘；取上清液。
2.樣品的準(zhǔn)備A每個陰離子吸附劑支持物點需要血清3μl，將血清用2倍體積U9緩沖液(9M Urea，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀釋(例如3μl血清用6μl U9緩沖液稀釋)。將樣品充分混勻。將9μl上述變性后樣品加入111μl相應(yīng)的結(jié)合緩沖液(50mM NaAC，pH4.0)，使得血清的總稀釋倍數(shù)達到約40倍。將處理好的血清樣品40μl上樣到陰離子吸附劑上。
3.樣品的準(zhǔn)備B先將1種抗體結(jié)合至一個Protein A柱子(Column)上(一個柱子1種抗體)，然后將血清樣品樣本加載到柱子中并在室溫條件下輕微震蕩0.5小時。取上清液。每個芯片點需要血清3μl，將血清用2倍體積U9緩沖液(9M Urea，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀釋(例如3μl血清用6μl U9緩沖液稀釋)。將樣品充分混勻。將9μl上述變性后樣品加入111μl相應(yīng)的結(jié)合緩沖液(50mM NaAC，pH4.0)，使得血清的總稀釋倍數(shù)達到約40倍。將處理好的血清樣品40μl上樣到陰離子吸附劑上。
4.樣品檢測上樣，在吸附劑支持物中加入40μl處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉(zhuǎn)/分，4℃震蕩1小時。甩出樣品，每孔加入200μl的結(jié)合緩沖液(50mM NaAc，pH4.0)，室溫置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分，震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入結(jié)合緩沖液200μl，重復(fù)操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。取出吸附劑支持物后，待干后，樣品加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。
5.質(zhì)譜中，就會生成飛行時間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性。
(2)實驗結(jié)果分析10例正常人血清中蛋白質(zhì)的組成。
先用加入法在正常人血清中加入胰島素(Insulin)，我們可以看到5807分子量的物質(zhì)增加(

圖1，A)。這證明胰島素的分子量5807Da，即見箭頭所示的條碼帶為胰島素。
然后用減法將上述血清通過抗胰島素的柱子(Anti-Insulin Immunoassay，圖1)，我們看到5807Da分子量的條碼帶消失了(圖1，B)這也證明5807Da條碼帶是胰島素。
分析8例肺炎病人的血清，已知該血清中血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid A，SAA)增加。假設(shè)我們不知道血清淀粉樣蛋白A(SAA)已知條碼帶位置(圖2，A)。血清通過抗血清淀粉樣蛋白A(抗SAA)的柱子(Anti-SAA Immunoassay，圖2)后，我們可以發(fā)現(xiàn)箭頭下11.5kDa的條碼帶消失了(圖2，B)。這證明11.5kDa條碼帶是血清淀粉樣蛋白A(SAA)。
(3)結(jié)論用滯留層析法捕獲生物樣品、進行質(zhì)譜分析的蛋白指紋法—可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發(fā)明提供確定某生物樣品在第一和第二樣品中差異存在的意義。包括A)測定生物樣品在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一蛋白指紋圖；B)測定生物樣品在第二樣品中(加入某種物質(zhì)；或減去某種物質(zhì)某種特異性單克隆抗體柱子處理過的)相同選擇性條件下的第二蛋白指紋圖；和C)比較第一和第二蛋白指紋圖之間的差異。兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了分析物在樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。在理論上，當(dāng)特異性抗體量無限地增加，所測定蛋白指紋條碼帶中單一蛋白指紋的意義可以相應(yīng)增大。另可以將某種蛋白質(zhì)從抗體柱子上還原，然后將這種蛋白質(zhì)用胰蛋白酶切成多肽指紋或做N-端氨基酸序列分析以鑒定蛋白質(zhì)分子序列，即最精確鑒別(金標(biāo)準(zhǔn))。
權(quán)利要求
1.一種用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)分析方法，其特征是采用蛋白指紋法對生物樣品中蛋白質(zhì)組進行鑒別檢測。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，其中所述的鑒別檢測蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。分析所得數(shù)據(jù)的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)—蛋白指紋法，其質(zhì)譜分析范圍為0～500kDa。每一條碼帶代表一種分子量，其顏色深淺代表蛋白質(zhì)量多與少。
3.權(quán)利要求2所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定采用了加減法，即加入或減去某種物質(zhì)來確定其質(zhì)譜分子量的意義。蛋白指紋法確定某生物樣品在第一和第二(加入或減去某種物質(zhì))樣品中蛋白指紋差異兩種蛋白指紋圖的差異條碼帶肯定了其分子量在生物樣品中的臨床意義，從而判斷每一條碼帶中單一蛋白指紋的意義。
4.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，其中所述的蛋白指紋(條碼格式或質(zhì)譜分子量的函數(shù)圖)可以被編程計算機存儲和用軟件分析。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，在滯留層析法中所用的吸附劑包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑。
6.權(quán)利要求1中滯留層析法所用吸附劑的支持物可以是金屬片，玻璃片，陶瓷片，陶瓷珠，磁性微粒或多聚體。
7.權(quán)利要求3所述的加減法中，減去某種物質(zhì)所用的抗體吸附表面物質(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)，如蛋白A和G(Protein A and Protein G)柱子。
8.權(quán)利要求7中抗體吸附表面物質(zhì)是用于捕獲抗原標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體?？梢詿o限量地增加抗體組來達到無限量地檢測多個或多種蛋白指紋。
9.權(quán)利要求1所述生物樣品來源于血液，體液，分泌物，細胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物。生物樣品可以來自動物與植物。
10.權(quán)利要求1所述蛋白指紋圖譜在定期監(jiān)測生物樣品中蛋白指紋動態(tài)變化的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質(zhì)組，然后用質(zhì)譜法進行分析的蛋白指紋法。分析所得蛋白質(zhì)分子量的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發(fā)明提供一種確定某生物樣品中質(zhì)譜條碼格式的意義。所述的條碼格式(蛋白指紋)，其條碼帶(分子量)意義的確定采用了加減法—即加入或減去某種物質(zhì)來確定其質(zhì)譜分子量的意義。本發(fā)明的方法可用于正常人與病人的蛋白指紋條碼帶的鑒定。蛋白指紋圖譜的重大意義在于定期監(jiān)測人體活動或血液中蛋白指紋的動態(tài)變化。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。
文檔編號G01N30/86GK1661367SQ20041000443
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日
發(fā)明者許洋 申請人:許洋