一種側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，特別涉及一種側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫膠體金技術(shù)是繼三大標(biāo)記技術(shù)（熒光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展起來(lái)的 固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。80年代出現(xiàn)在臨床診斷領(lǐng)域的膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatography assay，GICA)快速診斷試紙條是建立在金標(biāo)免疫滲濾基礎(chǔ)上的一 種免疫檢測(cè)技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單快速、結(jié)果明確、無(wú)需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、敏感度高、攜 帶方便等優(yōu)點(diǎn)，己成為臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新方向。但是，在傳統(tǒng)側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試過(guò) 程中，由于缺乏洗滌過(guò)程，非特異性結(jié)合的信號(hào)物質(zhì)（如膠體金、熒光染料等）會(huì)殘留在檢 測(cè)線區(qū)域（T線），影響結(jié)果的判定。
[0003] 光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光 免疫技術(shù)，又稱為AlphaLISA分析法，被譽(yù)為免洗的ELISA。該技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧 的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光（680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單 線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫的生存時(shí)間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很 ?。s為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級(jí)的光 (520nm-620nm)。反之，單線態(tài)氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生。通常在反應(yīng)體系中， 微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微 弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個(gè)微粒的距離，例如形成免疫夾心 或受體-配體復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號(hào)。由于AlphaLISA技術(shù) 中微珠均為納米微粒，增加了反應(yīng)表面積，極大地提高了檢測(cè)靈敏度；恰當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)及時(shí) 間分辨計(jì)數(shù)模式，增加了其特異性；檢測(cè)過(guò)程不易受到樣本常見(jiàn)干擾物質(zhì)、pH值、溫度等因 素的影響，保證了檢測(cè)穩(wěn)定性；該技術(shù)獨(dú)特的發(fā)光方式，有效的降低了非特異信號(hào)的干擾， 提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。但是由于該技術(shù)為均相反應(yīng)，而T線包被物（捕獲抗體或抗原）為 固相，非均相反應(yīng)使空間位阻效應(yīng)明顯，影響檢測(cè)的靈敏度，因此限制了其在側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng) 中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 在側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)中，由于缺乏洗滌過(guò)程，檢測(cè)線區(qū)域非特異性結(jié)合的信號(hào)物質(zhì) (如膠體金、熒光染料等）會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果。因此，為了降低非特異性結(jié)合對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干 擾，提高檢測(cè)結(jié)果的特異性，本發(fā)明提供一種光激化學(xué)發(fā)光側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)。該側(cè)向?qū)游鱿?統(tǒng)，采用光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)，即只有由特異性反應(yīng)而發(fā)生橋連的光敏微球和熒光微球，才能 在680nm的光照射下光敏微球釋放單線態(tài)氧而激發(fā)焚光微球發(fā)光（圖1)，而非特異性結(jié)合 未能使光敏微球和熒光微球發(fā)生橋連，因此不發(fā)光，進(jìn)而有效提高檢測(cè)的特異性。
[0005] 本發(fā)明所提供的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，包括樣本墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水墊和PVC襯 板，還包括含有親和素活化的光敏微球（SA-LP)和檢測(cè)蛋白活化的熒光微球（dPro-FP， detecting protein-FP)的樣本稀釋液；所述結(jié)合墊涂布有生物素標(biāo)記抗待測(cè)物抗體 (Biotin_Ab2)或生物素與待測(cè)物雙標(biāo)記載體蛋白（Biotin-cPro-T，Biotin-carrier Protein-Target);所述反應(yīng)膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線；所述檢測(cè)線上包被抗待測(cè)物抗 體（Ab3)或抗載體蛋白抗體（anti-cPro，against carrier protein antibody);所述質(zhì) 控線上包被生物素標(biāo)記抗原（Biotin-Ag，Biotin-antigen)或生物素標(biāo)記抗檢測(cè)蛋白抗體 (Biotin-anti-dPro, Biotin-anti-detecting protein antibody)〇
[0006] 所述親和素活化的光敏微球?yàn)橛H和素與光敏微球共價(jià)偶聯(lián)物。
[0007] 所述檢測(cè)蛋白活化的熒光微球?yàn)闄z測(cè)蛋白與熒光微球共價(jià)偶聯(lián)物。
[0008] 所述檢測(cè)蛋白為能與待測(cè)物發(fā)生特異性親和結(jié)合的蛋白。
[0009] 所述抗待測(cè)物抗體為能與待測(cè)物發(fā)生特異性親和結(jié)合的抗體。
[0010] 所述生物素與待測(cè)物雙標(biāo)記載體蛋白為生物素和待測(cè)物與載體蛋白共價(jià)偶聯(lián)物。
[0011] 所述抗載體蛋白抗體為能與載體蛋白親和結(jié)合的抗體。
[0012] 所述生物素標(biāo)記抗檢測(cè)蛋白抗體為生物素通過(guò)共價(jià)結(jié)合的且能與檢測(cè)蛋白親和 結(jié)合的抗體。
[0013] 所述親和素活化的光敏微球可以與生物素標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合。
[0014] 所述檢測(cè)蛋白活化的熒光微球與光敏微球橋連后在680nm波長(zhǎng)的光激發(fā)下可以 發(fā)射焚光（610nm)，用于結(jié)果的判定。
[0015] 所述檢測(cè)蛋白活化的熒光微球可以與樣本中待測(cè)物質(zhì)結(jié)合。
[0016] 所述結(jié)合墊涂布物為生物素標(biāo)記的抗待測(cè)物抗體（Biotin_Ab2)或生物素和待測(cè) 物雙標(biāo)記的載體蛋白（Biotin-cPro-T，Biotin-carrier Protein-Target)，其作用為可橋 連光敏微球和熒光微球，使其形成光敏微球_待測(cè)物-熒光微球復(fù)合物。
[0017] 所述反應(yīng)膜包括：a). T線：包被抗待測(cè)物抗體（Ab3)或抗載體蛋白抗體 (anti-cPro，against carrier protein antibody)，其作用可以捕獲光敏微球-待測(cè)物 質(zhì)-焚光微球復(fù)合物，用于結(jié)果判定，據(jù)焚光強(qiáng)若判定結(jié)果；b). C線：包被生物素標(biāo)記抗 原（Biotin-Ag，Biotin-antigen)或生物素標(biāo)記抗檢測(cè)蛋白抗體（Biotin-anti-dPro， Biotin-detecting protein antibody)，其作用可以橋連光敏微球和焚光微球，用于質(zhì)量 控制，即C線有熒光產(chǎn)生則代表試紙條結(jié)果有效，否則無(wú)效。
[0018] 所述側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)在檢測(cè)目標(biāo)物中應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 本文所提供的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)，通過(guò)獨(dú)特的復(fù)合物捕獲（T線）設(shè)計(jì)，成功利用光激 化學(xué)發(fā)光技術(shù)，可有效降低側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)中非特異性結(jié)合對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，從而有效提 高了檢測(cè)靈敏度和特異性。具體為：
[0020] a)夾心法：
[0021] 樣本中待測(cè)物質(zhì)與樣本稀釋液（含有檢測(cè)蛋白活化的熒光微球和親和素活化的 光敏微球）混勻后，樣本中待測(cè)物與檢測(cè)蛋白活化（如抗體）的熒光微球結(jié)合而形成復(fù)合 物，滴入樣本墊，接著復(fù)合物和光敏微粒與結(jié)合墊涂布的生物素標(biāo)記抗待測(cè)物抗體橋連，形 成{光敏微球-親和素} _ {生物素_抗待測(cè)物抗體} _待測(cè)物_ {檢測(cè)蛋白-熒光微球}大 復(fù)合物，然后大復(fù)合物被檢測(cè)線（T線）包被的抗待測(cè)物質(zhì)抗體捕獲，而未橋連的光敏微球 和熒光微球被質(zhì)控線包被的生物素標(biāo)記抗原進(jìn)一步橋連。
[0022] b)競(jìng)爭(zhēng)法：
[0023] 樣本中待測(cè)物質(zhì)與樣本稀釋液（含有檢測(cè)蛋白活化的熒光微球和親和素活化的 光敏微球）混勻后，樣本中待測(cè)物與檢測(cè)蛋白活化（如抗體）的熒光微球結(jié)合而形成復(fù)合 物，滴入樣本墊，接著未反應(yīng)的熒光微球和光敏微粒，與結(jié)合墊涂布的生物素和待測(cè)物雙標(biāo) 記載體蛋白橋連，形成{光敏微球-親和素}_{生物素-載體蛋白-待測(cè)物}_{檢測(cè)蛋 白-熒光微球}大復(fù)合物，然后大復(fù)合物被檢測(cè)線（T線）包被的抗載體蛋白抗體捕獲，而 未橋連的光敏微球和熒光微球被質(zhì)控線包被的生物素標(biāo)記抗檢測(cè)蛋白抗體進(jìn)一步橋連。
[0024] 最后當(dāng)T線/C線在680nm照射下，光敏微球會(huì)產(chǎn)生單線態(tài)的氧而激發(fā)大復(fù)合物中 焚光微球產(chǎn)生焚光信號(hào)，而未形成大復(fù)合物的焚光微球未被激發(fā)無(wú)焚光信號(hào)，因而可以有 效的提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為光激化學(xué)發(fā)光原理。
[0026] 圖2為側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)及組成。
[0027] 圖3為NC膜T/C線包被。
[0028] 圖4為實(shí)施例2的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)示意圖。
[0029] 圖5為實(shí)施例3的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1、光激化學(xué)發(fā)光側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)
[0031] 所用試劑：
[0032] 親和素活化光敏微球（SA-LP) :PerkinElmer，6760002。
[0033] 活性熒光微球（FP) :PerkinElmer，6772001。
[0034] pH7.510mM PBS:稱取 0.27g 磷酸二氫鉀（KH2P04)(國(guó)藥，10017608)、1.42g 磷酸氫 二鈉（Na2HP04)(國(guó)藥，10〇2〇3〇〇 8)，8g 氯化鈉（NaCl)(國(guó)藥，100193〇8)、0? 2g 氯化鉀（KC1) (國(guó)藥，10016308)于900mL超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié)pH至7. 5,然后用容量瓶定容至1L。
[0035] 10mMTris-HCl:稱取1. 576g(國(guó)藥，xw020034)于900mL超純水中，完全溶解后調(diào) 節(jié)到所需的pH值，然后定容至1L。
[0036] 5% BSA :稱取 5g BSA(amresco,0332)于 100ml PBS 溶液中，至完全溶解。
[0037] 術(shù)語(yǔ)解釋：
[0038] 親和素活化的光敏微球：即SA-LP，親和素與光敏微球共價(jià)偶聯(lián)物。
[0039]檢測(cè)蛋白活化的焚光微球：即dPro-FP (detecting protein-FP)，檢測(cè)蛋白與焚光 微球共價(jià)偶聯(lián)物。
[0040]檢測(cè)蛋白：即dPro (detecting protein)，可以與待測(cè)物發(fā)生特異性親和結(jié)合的蛋 白（如抗體）。
[0041] Ab2、Ab3 :抗待測(cè)物抗體，可以與待測(cè)物發(fā)生特異性親和結(jié)合的抗體。
[0042] 生物素與待測(cè)物雙標(biāo)記載體蛋白：即Biotin-cPro-T (Biotin-carrier Protein-Target)，生物素（Biotin)和待測(cè)物（Target)與載體蛋白（carrier Protein)共 價(jià)偶聯(lián)物。
[0043] 抗載體蛋白抗體：能與載體蛋白親和結(jié)合的抗體。
[0044] 生物素標(biāo)記抗原：生物素通過(guò)共價(jià)結(jié)合的抗原。
[0045] 抗檢測(cè)蛋白抗體（anti-dPro):將檢測(cè)蛋白（dPro)或其片段免疫動(dòng)物（如羊、鼠、 兔）后，由動(dòng)物體產(chǎn)生的可以特異性親和結(jié)合該檢測(cè)蛋白的免疫球蛋白。
[0046] 生物素標(biāo)記抗檢測(cè)蛋白抗體（Biotin-anti-dPro)為生物素通過(guò)共價(jià)結(jié)合的且能 與檢測(cè)蛋白親和結(jié)合的抗體。
[0047] -、檢測(cè)蛋白活化的焚光微球（dPr〇-FP，detecting protein-FP)制備：
[0048] 參照Perkinelmer公司偶聯(lián)方法：
[0049] 1)