一種免疫球蛋白側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及基于側(cè)向?qū)游龇蛛x技術(shù)的用于免疫球蛋白測定試紙條及其應(yīng)用,該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)。
【專利說明】一種免疫球蛋白側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及基于側(cè)向?qū)游龇蛛x技術(shù)的用于免疫球蛋白測定側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)是一組具有抗體活性的蛋白質(zhì),Ig由楽;細(xì)胞產(chǎn)生,主要存在于生物體血液和其他體液(包括組織液和外分泌液)中,約占血漿蛋白總量的20%;還可分布在b細(xì)胞表面。人血漿內(nèi)的免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白(Y-球蛋白)中。免疫球蛋白可以分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類,其中IgG是血清主要的抗體成分,約占血清Ig的75%。
[0003]IgA (immunoglobulin A)在正常人血清中的含量僅次于IgG,占血清免疫球蛋白含量的10?20%。從結(jié)構(gòu)來看,IgA有單體、雙體、三體及多聚體之分。按其免疫功能又分為血清型及分泌型兩種。血清型IgA存在于血清中,其含量占總IgA的85%左右。血清型IgA雖有IgG和IgM的某些功能,但在血清中并不顯示重要的免疫功能。分泌型IgA存在于分泌液中,如唾液、淚液、初乳、鼻和支氣管分泌液、胃腸液、尿液、汗液等。分泌型IgA是機(jī)體粘膜局部抗感染免疫的主要抗體。故又稱粘膜局部抗體。因此,特異的IgA變化與某些粘膜疾病相關(guān),如EB病毒VCA抗原特異性IgA升高與鼻腔疾病密切相關(guān)。
[0004]IgM占血清免疫球蛋白總量的5% -10%,血清濃度約lmg/ml。單體IgM以膜結(jié)合型(mlgM)表達(dá)于細(xì)胞表面,構(gòu)成B細(xì)胞抗原受體(BCR)。分泌型IgM為五聚體,是分子量最大的Ig,沉降系數(shù)為19S,稱為巨球蛋白,一般不能通過血管壁,主要存在于血液中。五聚體IgM含10個(gè)Fab段,有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力;含5個(gè)Fe段,比IgG更易激活補(bǔ)體。天然的血型抗體為IgM,血型不符的輸血可致嚴(yán)重溶血反應(yīng)。IgM是個(gè)體發(fā)育過程中最早合成和分泌的抗體,在胚胎發(fā)育晚期的胎兒即能產(chǎn)生IgM,故臍帶血IgM升高提示胎兒有宮內(nèi)感染(如風(fēng)疹病毒或巨細(xì)胞病毒等感染)。IgM也是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體,是機(jī)體抗感染的“先頭部隊(duì)”;血清中檢出IgM提示新近發(fā)生感染,可用于感染的早期診斷。膜表面IgM是B細(xì)胞抗原受體的主要成分。只表達(dá)mlgM是未成熟B細(xì)胞的標(biāo)志。在感染過程中IgM首先出現(xiàn),但持續(xù)時(shí)間不長,是近期感染的標(biāo)志。因此,特異性IgM測定對感染性疾病的早期判定,以進(jìn)行早期治療有重要的臨床診斷價(jià)值。
[0005]免疫球蛋白E(IgE)是一類具有δ鏈的親同種細(xì)胞抗體,是參與過敏性鼻炎、過敏性哮喘和濕疹等發(fā)病機(jī)制調(diào)節(jié)的主要抗體。自1966年日本學(xué)者Ishizaka發(fā)現(xiàn)IgE以來,有關(guān)IgE的研究已取得重大進(jìn)展,并先后在肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了 IgE受體,還分別從各種過敏性疾病患者包括過敏性哮喘患者血清中分離出針對多種花粉、塵螨、霉菌和動物皮毛的特異性IgE,近年證實(shí)許多細(xì)胞因子如IL-4、Y-干擾素均參與了 IgE合成的調(diào)節(jié)。IgE抗體既能啟動速發(fā)相過敏反應(yīng),也可誘發(fā)遲發(fā)相過敏反應(yīng)。
[0006]血液中特異的免疫球蛋白含量測定方法有免疫比濁法、側(cè)向?qū)游龇?、ELISA等,其中,免疫比濁法簡單經(jīng)濟(jì),可自動化,需時(shí)短;ELISA法檢測敏感度高、特異好,但是兩種方法均需相應(yīng)的儀器設(shè)備,而側(cè)向?qū)游龇▌t可直接進(jìn)行結(jié)果判定,使用更為方便、靈活。
[0007]側(cè)向?qū)游黾夹g(shù),按其原理可分為兩類,一類是以酶促反應(yīng)顯色為基礎(chǔ),以顯色高度來定量;另一類則使用著色標(biāo)記物如乳膠微粒、膠體硒、膠體金以及脂質(zhì)體等,層析時(shí),標(biāo)記物與待測物反應(yīng)形成的復(fù)合物被相應(yīng)的固定在層析材料上的配體捕獲而富集顯色,根據(jù)層析材料上顯色條帶的有無或多少來定性或定量。以酶促反應(yīng)顯身手為基礎(chǔ)的免疫層析技術(shù)由于待測物的定量是以試紙條上以酶活性為依據(jù),故其測量結(jié)果受酶穩(wěn)定性以及樣品基質(zhì)、PH值、溫育時(shí)間和溫度等環(huán)境因素的影響。
[0008]免疫膠體金技術(shù)是繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。80年代出現(xiàn)在臨床診斷領(lǐng)域的膠體金免疫層析(colloidal goldimmunochromatography assay, GI CA)快速診斷試紙條是建立在金標(biāo)免疫滲濾基礎(chǔ)上的一種免疫檢測技術(shù)。它具有簡單快速、結(jié)果明確、無需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、敏感度高、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn),己成為臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新方向。但是,在IgM、IgA、IgD、IgE測試過程中,由于血液中高濃度的IgG競爭結(jié)合抗原,影響IgM、IgA、IgD、IgE測試的準(zhǔn)確測定,因此欲實(shí)現(xiàn)對IgM、IgA、IgD、IgE的任一測定都需除去或降低IgG的干擾。
[0009]例如,肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)大小為200nm,呈多種形態(tài),菌落開始呈“桑葚狀”,多次傳代后可成“煎荷包蛋”形狀,即表面隆起,中心致密,邊緣不整齊的微小集落。Mp可在不含組織或細(xì)胞,而在含酵母浸出液及20%馬血清的瓊脂培養(yǎng)基中生長良好。在厭氧環(huán)境下生長緩慢。該菌能發(fā)酵葡萄糖,在含葡萄糖的培養(yǎng)基中可生長而產(chǎn)酸。此外,Mp可同時(shí)進(jìn)行DNA/RNA復(fù)制,呈對半分裂增殖。Mp膜抗原能刺激人體產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體和生長抑制抗體。Mp細(xì)胞膜上的某些成分能同瓦塞爾(Wasserman)反應(yīng)陽性血清、鏈球菌MG和人類紅細(xì)胞I型抗原抗血清起交叉反應(yīng)。
[0010]肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)是人類支原體肺炎(或稱原發(fā)性非典型性肺炎)的病原體,主要經(jīng)飛沫傳染,潛伏期2-3周,發(fā)病率以青少年和兒童較高。臨床癥狀較輕或無癥狀,若有也只是頭痛、咽痛、發(fā)熱、咳嗽等一般的呼吸道癥狀,多在秋冬時(shí)節(jié)發(fā)生。
[0011]肺炎支原體的診斷方法主要依靠分離培養(yǎng)和血清學(xué)試驗(yàn),其中血清學(xué)試驗(yàn)常用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。
[0012]人體感染肺炎支原體后,能產(chǎn)生特異性IgM、IgG、IgA抗體。IgM抗體出現(xiàn)早,一般在感染后I周出現(xiàn),3-4周達(dá)高峰,以后逐漸降低。由于肺炎支原體感染的潛伏期為2-3周,當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀而就診時(shí),IgM抗體已達(dá)到相當(dāng)高的水平,因此IgM抗體陽性可作為急性期感染的輔助診斷。在傳統(tǒng)的側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)中,通過用特定的IgG封阻劑(如高濃度抗IgG抗體)理處樣本墊,樣本墊IgG封阻劑可以封閉IgG抗原結(jié)合位點(diǎn),降低特異性抗體與Mp結(jié)合,但是在此系統(tǒng)中由于IgG封阻劑與血清目標(biāo)IgM—起泳動,血清中未封閉完全的Mp特異的IgG會競爭結(jié)合金標(biāo)結(jié)合物(GC-Mp),干擾IgM的測定。此外,由于IgG封阻劑通常結(jié)合人IgG保守區(qū)而對可變區(qū)結(jié)合能力很低,因此其封阻效率也會嚴(yán)重影響IgM的測定。因此,開發(fā)肺炎支原體IgM測試試紙條在肺炎支原體感染的輔助診斷中有重要價(jià)值。
[0013]綜上所述。能夠適應(yīng)臨床快速準(zhǔn)確測定特異性免疫球蛋白的方法是迫在眉睫的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種特別的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其原理是具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的樣本墊可以固定特定粒徑的乳膠微粒,進(jìn)而將通過共價(jià)健與乳膠微粒結(jié)合的ant1-1gG固定于樣本墊。利用樣本墊上固定的anti_IgG捕獲樣本中的IgG,使IgG與IgM、IgA、IgE分離,然后再利用金標(biāo)側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)測定特定的IgM、IgA、IgE,有效降低IgG的干擾。該方法操作簡便、快速、敏感度高、特異性好。
[0015]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0016]本發(fā)明一種用于免疫球蛋白側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),包括固定有干擾物質(zhì)清除試劑活化的乳膠微粒的樣本墊、結(jié)合墊、NC膜,所述的免疫球蛋白為IgM、IgA、IgE中一種或一種以上。
[0017]本發(fā)明的一種用于免疫球蛋白測定側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng)還包括吸水墊、PVC襯板及卡盒。
[0018]本發(fā)明的一種用于免疫球蛋白測定的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),包括但不限于側(cè)向?qū)游鰴z測儀、側(cè)向?qū)游鲈嚰?、?cè)向?qū)游鰴z測板、測定試紙條等。優(yōu)選為測定試紙條。
[0019]本發(fā)明所述的干擾物質(zhì)清除試劑活化的乳膠微粒是指抗人IgG抗體活化的乳膠微粒(LP-ant1-1gG)。
[0020]本發(fā)明所述固定化的LP-ant1-1gG為抗人IgG抗體(anti_IgG)。
[0021]本發(fā)明所述固定化的LP-ant1-1gG為抗人IgG抗體anti_IgG與活性乳膠微粒LP通過共價(jià)偶聯(lián)而得,用以與人源樣本中IgG結(jié)合。優(yōu)選所述固定化的LP-ant1-1gG為抗人IgG抗體ant1-1gG與活性乳膠微粒LP通過1_ (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)法價(jià)偶聯(lián)而得。
[0022]本發(fā)明所述的樣本墊為網(wǎng)狀的纖維膜(Fusion5,GE),捕獲粒徑2.0-2.6um乳膠微
粒,將其固定。
[0023]所述的固定的乳膠微??梢圆东@樣本中IgG將其與IgM、IgA、IgE任一個(gè)分離,有效降低測定中IgG干擾,提高檢測的敏感性。
[0024]本發(fā)明所述樣品墊固定的ant1-1gG是羊抗人IgG全蛋白抗體ant1-whole IgG或羊抗人IgG Fe區(qū)域的抗體ant1-Fc IgG。優(yōu)選所述樣品墊固定的ant1-1gG是羊抗人IgG全蛋白抗體ant1-whole IgG。
[0025]優(yōu)選所述的樣本墊固定LP-ant1-1gG濃度為0.02-2.0mg/cm2,優(yōu)選濃度為0.2-2.0mg/cm2,最佳濃度為 0.2mg/cm2。
[0026]本發(fā)明所述的免疫球蛋白優(yōu)選為IgM、IgA、IgE中一種或一種以上。
[0027]本發(fā)明所述的結(jié)合墊是指涂布有膠體金標(biāo)記的Mp抗原的結(jié)合墊,具體指有膠體金顆粒Colloidal Gold, CG標(biāo)記的Mp抗原的結(jié)合墊,其中CG-Mp可以與樣本中特異的IgM結(jié)合形成復(fù)合物。本發(fā)明所述的結(jié)合墊可以用于Mp特異性IgM結(jié)果的判定。
[0028]本發(fā)明所述的NC膜是指包被有抗人IgM(ant1-1gM)抗體的T線和抗Mp抗體的C線的NC膜分別與IgM-金標(biāo)結(jié)合物和金標(biāo)結(jié)合物結(jié)合。本發(fā)明所述的NC膜可以用于Mp特異性IgM結(jié)果的判斷。
[0029]本發(fā)明所述的結(jié)合墊、NC膜,當(dāng)測定其它特異性IgM、IgA、IgE中時(shí),只需將抗原、特異性抗體和抗人IgM抗體替換為相應(yīng)的抗原、特異性抗體和抗人IgM或IgA或IgE即可。
[0030]判定方法[0031]由于肺炎支原體IgG與IgM在血液中共存,為了降低IgM測定過程中IgG的干擾,提高敏感性,因此試紙條選用抗人IgG抗體與乳膠微粒用1-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)法共價(jià)偶聯(lián),形成穩(wěn)定的共價(jià)化學(xué)鍵,獲得活性乳膠微粒。將一定量的活性乳膠微粒處理樣本墊,特定材料的樣本墊可以固定特定粒徑的乳膠微粒,活化的乳膠微粒會固定于樣本墊。在樣本檢測的側(cè)向?qū)游鲋?,由于樣本中的IgG與ant1-1gG的親和結(jié)合作用,進(jìn)而與IgM分離,然后IgM通過與金標(biāo)結(jié)合物結(jié)合、T線和C線的捕獲,最后根據(jù)T線和C線的顯色程度來判定結(jié)果。
[0032]有益效果
[0033]為了更好的說明本發(fā)明的有益效果,通過下述試驗(yàn)例加以說明。本發(fā)明對樣本墊包被ant1-1gG種類和濃度、金標(biāo)結(jié)合物和T線蛋白種類等方面進(jìn)行了選擇。
[0034]試驗(yàn)例I用涂布ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條與用固定有LP-ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條測定臨床樣本(100例)對比試驗(yàn)
[0035]1.1gM 測定
[0036]分別用涂布ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條和用固定有LP-ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條測定臨床樣本各100例,米用EUROIMMUN Medizinische LabordiagnostikaAG生產(chǎn)的抗肺炎支原體抗體IgM檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)(國食藥監(jiān)械(進(jìn))字2013第3404814號 )進(jìn)行陰陽性判定),計(jì)算檢測系統(tǒng)的敏感度、特異性、陽性符合率、陰性符合率及總符合率,結(jié)果見表1。
[0037]篩選方法如下:
[0038]I)分別選用ant1-1gG涂布樣本墊,LP_anti_IgG包被樣本墊;
[0039]2)層析試紙條制備方法按照實(shí)施例1制備;
[0040]3)分別加入100 μ L稀釋樣本,室溫反應(yīng)15min ;
[0041]4)據(jù)顯色程度判定結(jié)果,即無色為陰性,紅色為陽性。
[0042]表1不同樣本墊包被物的敏感度和特異性
[0043]
樣本墊包被物~敏感度特異性陽性符合率陰性符合率總符合率 ant1-1gG 84% 98%97%91%93%
LP-ant1-1gG 100% 98%97%100%99%
[0044]通過表1可見,用固定有LP-ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條測定臨床樣本在敏感度、特異性和總有符合率都高于涂布ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條。
[0045]2.1gA 測定:
[0046]分別用涂布ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條和用固定有LP-ant1-1gG的樣本墊組裝的試紙條測定臨床樣本各100例(采用同昕生物生產(chǎn)的EB病毒衣殼抗原(VCA) IgA抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400467號)進(jìn)行陰陽性判定),計(jì)算檢測系統(tǒng)的敏感度、特異性、陽性符合率、陰性符合率及總符合率,結(jié)果見表2。
[0047]篩選方法如下:
[0048]I)分別選用ant1-1gG涂布樣本墊,LP_anti_IgG包被樣本墊;[0049]2)層析試紙條制備方法按照實(shí)施例3制備;
[0050]3)分別加入100 μ L稀釋樣本,室溫反應(yīng)15min ;
[0051]4)據(jù)顯色程度判定結(jié)果,即無色為陰性,紅色為陽性。
[0052]表2不同樣本墊包被物的敏感度和特異性
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種用于免疫球蛋白側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,包括固定有干擾物質(zhì)清除試劑活化的乳膠微粒的樣本墊、結(jié)合墊、NC膜,所述的免疫球蛋白為IgM、IgA、IgE中一種或一種以上。
2.如權(quán)利要求1所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述的干擾物質(zhì)清除試劑活化的乳膠微粒是指抗人IgG抗體活化的乳膠微LP-ant1-1gG。
3.如權(quán)利要求2所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述的固定化的LP-ant1-1gG為抗人IgG抗體ant1-1gG與活性乳膠微粒LP通過共價(jià)偶聯(lián)而得,用以與人源樣本中IgG結(jié)合 。
4.如權(quán)利要求3所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征與活性乳膠微粒在于,所述的固定化的LP-ant1-1gG為抗人IgG抗體ant1-1gG LP通過1_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)法價(jià)偶聯(lián)而得。
5.如權(quán)利要求1所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述的樣本墊為網(wǎng)狀的纖維膜,捕獲粒徑2.0-2.6um乳膠微粒,將其固定。
6.如權(quán)利要求3或4所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于:所述的ant1-1gG是羊抗人IgG全蛋白抗體ant1-whole IgG或羊抗人IgG Fe區(qū)域的抗體anti_Fc IgG。
7.如權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述的樣本墊固定 LP-ant1-1gG 濃度為 0.02-2.0mg/cm2。
8.如權(quán)利要求7所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述的樣本墊固定LP-ant1-1gG 濃度為 0.2mg/cm2。
9.如權(quán)利要求1所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述的結(jié)合墊是指涂布有膠體金標(biāo)記的抗原。
10.如權(quán)利要求1所述的側(cè)向?qū)游鰴z測系統(tǒng),其特征在于,所述NC膜為包被有特異性抗體的T線和抗人IgM或IgA或IgE抗體的C線的NC膜。
【文檔編號】G01N33/558GK103983792SQ201410234215
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】肖智, 焦守恕, 李全 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司