專利名稱：一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。
背景技術(shù)：
禽類免疫球蛋白IgY具有生物學(xué)活性，用途廣泛，可用于血清學(xué)免疫診斷(夾心法 ELISA檢測、免疫擴散、免疫吸附和補體結(jié)合等)和免疫治療(雞鴨的病毒性疾病、嬰兒和 幼畜的輪狀病毒感染等)。通常IgY是從禽類蛋中獲得，主要是產(chǎn)蛋母雞用特定抗原免疫 后，約7 10天后抗體從血液轉(zhuǎn)移至卵黃，再從卵黃中分離到IgY，相關(guān)此研究的報道較多， 例如專利CN1752105、CN1935841和CN101125886。但是，卵黃中脂肪含量很高(約30% )， 從卵黃中提取IgY需要去除大量的脂類物質(zhì)，規(guī)?；蛛x較為困難，因此直接從血液中分 離IgY將更為有利。另一方面，我國是禽類(特別是雞)養(yǎng)殖大國，禽類血液除了少部分食 用外，一般作為廢棄物排放，既浪費了寶貴的天然蛋白質(zhì)資源，又造成了一定的環(huán)境污染問 題。因此，綜合利用禽類血液，特別是提取高附加值的活性蛋白，具有重要的經(jīng)濟價值和社 會效益?；旌夏Ｊ綄游鍪墙臧l(fā)展起來的新型生物分離技術(shù)，其功能配基同時兼有兩種 或兩種以上的功能基團(tuán)，可以與目標(biāo)蛋白產(chǎn)生多種相互作用模式，主要是疏水和靜電相互 作用。混合模式吸附劑的配基密度通常比較高，吸附容量大，可以通過靜電相吸來強化吸 附或靜電排斥來協(xié)助解吸，特別適合于大規(guī)模的分離純化，已經(jīng)在免疫球蛋白的分離純化 中得到應(yīng)用，是Protein A親和層析的潛在替代方法。商業(yè)化的混合模式吸附劑有MEP HyperCel，由Pall公司生產(chǎn)。一些新型的混合模式吸附劑也有報道，如以巰基甲基咪唑 或巰基苯并咪唑為配基的介質(zhì)，制備方法見專利CN101279244、CN101279243和文獻(xiàn)(Ind. Eng. Chem. Res47(23) :9566_9572，2008)。本發(fā)明有效地結(jié)合了辛酸沉淀與混合模式層析兩種分離方法，采用辛酸沉淀去除 部分雜蛋白，用混合模式吸附劑直接處理辛酸沉淀的上清液，充分利用混合模式吸附的高 吸附容量、高抗體選擇性的特性，開發(fā)一種從雞血中分離IgY免疫球蛋的經(jīng)濟高效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法包括如下步驟1)配制0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將雞血與抗凝劑按照體積比為9 1的 比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，得到血漿；2)將血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2 5. 0)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 60μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置1 4小時，用離心機以8000 IOOOOrpm轉(zhuǎn)速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫 球蛋白IgY粗品溶液；3)調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7. 0 8. 5，用0. 45 μ m濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對 應(yīng)的洗脫緩沖液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)將免疫球蛋白IgY溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于90%的免疫球蛋白IgY產(chǎn)品。所述的混合模式吸附劑為以巰基甲基咪唑為配基的層析介質(zhì)，或者以巰基苯并咪 唑為配基的層析介質(zhì)，或者商業(yè)化介質(zhì)MEP HyperCel ；平衡緩沖液為Tris-HCl緩沖液，pH 值為7. 0 8. 5 ；洗脫緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為3. 6 4. 2。本發(fā)明針對雞血資源的綜合開發(fā)，通過辛酸沉淀與混合模式層析的有機結(jié)合，能 很好地從雞血中分離純化高純度的免疫球蛋白IgY。采用辛酸沉淀去除部分雜蛋白，混合模 式吸附劑直接處理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗體選 擇性，提高分離效率，簡化分離步驟，得到一個經(jīng)濟高效的提取免疫球蛋白IgY的方法。本 發(fā)明的優(yōu)點在于1)快速、成本低廉；2)分離步驟少、工藝簡單、易于放大；3)過程處理量 大、分離效率高；4)免疫球蛋白IgY的純度高。


附圖是本發(fā)明混合模式層析分離雞血免疫球蛋白IgY的電泳譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。將新鮮抗凝血液離心去 除紅細(xì)胞，得到血漿；用辛酸法沉淀去除部分雜蛋白，得到上清液；將上清液通過混合模式 層析柱進(jìn)行分離，得到免疫球蛋白IgY。本發(fā)明方法分離得到的免疫球蛋白IgY純度大于 90%。從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法包括如下步驟1)配制0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將雞血與抗凝劑按照體積比為9 1的 比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，得到血漿；2)將血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2 5. 0)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 60μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置1 4小時，用離心機以8000 IOOOOrpm轉(zhuǎn)速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫 球蛋白IgY粗品溶液；3)調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7. 0 8. 5，用0. 45 μ m濾膜過濾后，上 樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對 應(yīng)的洗脫緩沖液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)將免疫球蛋白IgY溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于90%的免疫球蛋白IgY產(chǎn)品。所述的混合模式吸附劑為以巰基甲基咪唑為配基的層析介質(zhì)，或者以巰基苯并咪 唑為配基的層析介質(zhì)，或者商業(yè)化介質(zhì)MEP HyperCel ；平衡緩沖液為Tris-HCl緩沖液，pH 值為7. 0 8. 5 ；洗脫緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為3. 6 4. 2。以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述實施例1
取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離 心機以2500rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入5ml 60mM的 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約10ml，加入600 μ 1辛酸，攪拌均 勻，4°C靜置4小時，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液9. 6ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為7.0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的層析介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩沖液 (pH7. 0)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH3. 6)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得 到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為95. 2%。實施例2取新鮮雞血，按照9 1 (體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入IOml 60mM的乙 酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約15ml，加入450 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置1小時，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液14. 2ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為7. 5，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩 沖液(pH7. 5)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH3. 8)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干 燥，得到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為96. 2%。實施例3取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2700rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入15ml 6OmM的 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 8)混合均勻，得到稀釋血漿約20ml，加入800 μ 1辛酸，攪拌均 勻，4°C靜置1小時，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液19. 4ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為8.0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的層析介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩沖液 (pH8. 0)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得 到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為97. 6%。實施例4取新鮮雞血，按照9 1 (體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿約25ml，加入800 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置4小時，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液24. 3ml。上清 液用0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為8. 5，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填 充5ml以2-巰基-1-甲基咪唑為配基的混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩 沖液(pH8. 5)，洗脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干 燥，得到免疫球蛋白IgY，電泳分析純度為98. 5%。實施例5取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2500rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入5ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約10ml，加入600 μ 1辛酸，攪拌均勻，4°C靜置1小時，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液9. 2ml。上清液用 0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為7.0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填充5ml 以2-巰基苯并咪唑為配基的層析介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，洗 脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋 白IgY，電泳分析純度為96. 0%。實施例6取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿約25ml，加入750 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置4小時，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液24. 2ml。上清液用 0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為8. 5，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填充5ml 以2-巰基苯并咪唑為配基的層析介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 5)，洗 脫液為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH3. 6)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋 白IgY，電泳分析純度為95. 4%。實施例7取新鮮雞血，按照9 1 (體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2500rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入5ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)混合均勻，得到稀釋血漿約10ml，加入600 μ 1辛酸，攪拌均勻， 4°C靜置1小時，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液9. 2ml。上清液 用0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為7.0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填充 5ml MEP HyperCel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，洗脫液 為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白 IgY，電泳分析純度為93.7%。實施例8取新鮮雞血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，得到血漿。取5ml血漿，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿約25ml，加入750 μ 1辛酸，攪拌均勻， 8°C靜置4小時，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液24. Iml0上清液 用0.45 μ m濾膜過濾，調(diào)節(jié)pH值為8. 5，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑Icm)中填充 5ml MEP HyperCel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 5)，洗脫液 為20mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH3. 6)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白 IgY，電泳分析純度為91.2%。
權(quán)利要求
一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于包括如下步驟1)配制0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將雞血與抗凝劑按照體積比為9∶1的比例混合均勻，用離心機以2500～3000rpm轉(zhuǎn)速離心10～20分鐘，得到血漿；2)將血漿與pH為4.5～5.0，濃度為60mM的乙酸 乙酸鈉緩沖液按照體積比為1～4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30～60μl/ml稀釋血漿，4～8℃靜置1～4小時，用離心機以8000～10000rpm轉(zhuǎn)速離心20～30分鐘，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；3)調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫緩沖液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)將免疫球蛋白IgY溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于90％的免疫球蛋白IgY產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述 的混合模式吸附劑為以巰基甲基咪唑為配基的層析介質(zhì)、以巰基苯并咪唑為配基的層析介 質(zhì)或者商業(yè)化介質(zhì)MEP HyperCel0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述 的平衡緩沖液為Tris-HCl緩沖液，pH值為7. 0 8. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述 的洗脫緩沖液為乙酸_乙酸鈉緩沖液，pH值為3. 6 4. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從雞血中分離免疫球蛋白IgY的方法。具體步驟如下1)血漿預(yù)處理，取新鮮雞血，離心，除去紅細(xì)胞，得到血漿。2)辛酸沉淀，向血漿中加入辛酸達(dá)到一定濃度，沉淀去除雜蛋白，離心分離，取上清液。3)柱層析，用填充有混合模式吸附劑的層析柱分離上清液，收集洗脫峰。4)脫鹽和干燥，將收集液脫鹽，冷凍干燥，得到高純度的免疫球蛋白IgY。本發(fā)明的特色在于開發(fā)了一條新的分離工藝，可以從雞血中分離得到高純度的免疫球蛋白IgY。方法的關(guān)鍵在于從辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY，具有操作步驟簡單、分離效率高、成本低廉的特點。
文檔編號C07K1/36GK101948535SQ20101029542
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者姚善涇, 林東強, 童紅飛 申請人:浙江大學(xué)