層析分析系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及層析分析系統(tǒng)。本發(fā)明涉及一種橫流式測(cè)定格式分析物檢測(cè)裝置,包括:至少一個(gè)第一過濾元件,包括至少一個(gè)儲(chǔ)存區(qū)(1),與至少一個(gè)第二過濾元件(11)接觸,第二過濾元件連接至芯吸膜(6),其中用包括銪(III)螯合物的粒子共價(jià)標(biāo)記的對(duì)分析物特異性連接配偶體被注入在儲(chǔ)存區(qū)(1)上,每個(gè)粒子具有約30,0000-1,000,000個(gè)銪(III)原子;俘獲分析物/特異性連接配偶體復(fù)合物的至少一種特異性連接配偶體固定在芯吸膜(6)上;其特征在于第二過濾元件插入到第一過濾元件和芯吸膜(6)之間。
【專利說明】層析分析系統(tǒng)
[0001]本發(fā)明是申請(qǐng)日2004年5月3日、標(biāo)題為“層析分析系統(tǒng)”申請(qǐng)?zhí)?00480011913.8的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及分子,特別是生物分子的高靈敏度檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及使用熒光標(biāo)記物。
【背景技術(shù)】
[0003]超靈敏的免疫測(cè)定方法被開發(fā)并用于臨床診斷中,用以測(cè)量高度復(fù)雜的樣品中濃度極低的特定化合物。雖然這些方法的靈敏度、可靠性、快速性、簡(jiǎn)單性以及成本已有穩(wěn)定的改進(jìn),但仍需要進(jìn)一步的提高,并且這也是可能的(參見Hampl J等人的Upconvertingphosphor reporters in chromatographic assays.Analytical B1chemistry,2001 ;288, 176-187 ;Unger M.等人的 Single-molecule fluorescence observed with mercurylamp illuminat1n.B1techniquesl999 ;27:1008-1014 ;以及 Weiss S.的 Fluorescencespectroscopy of single b1molecules.Sciencel999 ;283:1676-1683)。目前的趨勢(shì)是向小型化發(fā)展,多種分析物方法已經(jīng)引入了對(duì)它本身的挑戰(zhàn)和對(duì)于免疫測(cè)定技術(shù)的要求。(Taylor JR 等人的 Probing specific sequences of single DNA moleculeswith b1conjugated fluorescent nanoparticles.Anal Chem2000 ;72:1979-1986 ;以及 Zijlmans 等人的 Detect1n of cell and tissue surface antigens usingup-converting phosphors: a new reporter technology.Anal B1cheml999 ;267:30-36)。尤其是已經(jīng)增加了對(duì)新標(biāo)記技術(shù)的關(guān)注,這是因?yàn)橥ǔJ褂玫闹苯拥幕蛎?放大的放射性報(bào)道物(i^portr)、比色報(bào)道物、發(fā)光報(bào)道物或熒光報(bào)道物中沒有一種能達(dá)到理想標(biāo)記物的所有要求,對(duì)理想標(biāo)記物的要求包括:對(duì)于特異活性、大小、無毒性、成本、穩(wěn)定性、定位和檢測(cè)的要求??芍苯訖z測(cè)的標(biāo)記物(諸如熒光團(tuán))遭受到有限的靈敏度,而酶-放大方法或離解-增強(qiáng)方法損失空間信息。
[0004]最近,已經(jīng)將基于高度特異的活性微粒標(biāo)記物(諸如量子點(diǎn)、發(fā)光無機(jī)晶體、向上轉(zhuǎn)換型磷光體、突光納米粒子、以及胞質(zhì)基因共振粒子(plasmon resonant particle))的新型檢測(cè)方法引入,用以對(duì)臨床診斷以及生物研究、染色體研究和藥物研究的未來要求作出響應(yīng)。將這些亞微米大小的標(biāo)記物連接到特異性結(jié)合的試劑上(諸如,核酸探針、受體、凝集素、酶、以及抗體),用以檢測(cè)靈敏度等于或高于可得到的最好的常規(guī)標(biāo)記物的特定分子。盡管存在大分子尺寸和明顯的硬脂問題,但這些特定標(biāo)記物也已經(jīng)被成功地用于固相免疫測(cè)定。然而,已經(jīng)認(rèn)識(shí)到粒子-蛋白質(zhì)生物結(jié)合物的生產(chǎn)、膠態(tài)穩(wěn)定性以及非特異性結(jié)合可能仍需要進(jìn)一步的改進(jìn)。
[0005] 在20年前時(shí)間分辨熒光計(jì)和鑭系元素報(bào)道物就被引入免疫測(cè)定。從那時(shí)起,離解-增強(qiáng)的鑭系元素?zé)晒饷庖邷y(cè)定(DELF1A?)技術(shù)就已經(jīng)被認(rèn)為是最靈敏和最可靠的免疫測(cè)定平臺(tái)之一。對(duì)于固有熒光的、惰性的和穩(wěn)定的鑭系元素螯合物和穴狀化合物標(biāo)記物的研究已經(jīng)導(dǎo)致了新型的同類和不同類測(cè)定(化驗(yàn))的發(fā)展,期望將這些測(cè)定(化驗(yàn))引入到例行的臨床診斷中。而且,已知一種基于鑭系元素共熒光的先進(jìn)的離解-增強(qiáng)技術(shù),該技術(shù)放大銪(III)、鋱(III)、釤(III)和鏑(III)的長(zhǎng)壽命熒光。鑭系元素螯合物熒光的一個(gè)獨(dú)特的特征是在多種標(biāo)記中沒有自發(fā)淬滅,使得它們很理想,并且適用于高密度簇標(biāo)記物,諸如染色的膠乳納米粒子。用于DELFIA技術(shù)的高度熒光螯合物也可以用于熒光鑭系元素(III)螯合物納米粒子,這是因?yàn)槟z乳內(nèi)部的疏水環(huán)境保護(hù)熒光螯合物免受環(huán)境的影響(諸如溶劑淬滅)并穩(wěn)定活動(dòng)力弱的復(fù)合物。對(duì)于所有四種鑭系元素的合適的螯合物的應(yīng)用將能使基于納米粒子、標(biāo)記具有極低檢測(cè)限以及直接的、表面讀取測(cè)定的四重標(biāo)記技術(shù)成為可能。
[0006]使用典型的熒光染料檢測(cè)樣品中低水平的目標(biāo)標(biāo)記物有時(shí)是困難的,并且易于發(fā)生錯(cuò)誤,這是因?yàn)樘禺愋詿晒庑盘?hào)往往較低的,并且通常與非特異性信號(hào)混合。此外,由測(cè)試樣本生成的自身熒光會(huì)引起干擾。鑭系元素(例如銪(EU))的復(fù)雜螯合物的熒光半衰期多達(dá)六個(gè)數(shù)量級(jí),長(zhǎng)于常規(guī)的熒光標(biāo)記物。因此,來自鑭系元素螯合物的發(fā)射可以通過使用具有適當(dāng)延遲、計(jì)數(shù)和循環(huán)次數(shù)的時(shí)間分辨熒光計(jì)而與背景熒光(其具有較短的衰變半衰期)區(qū)分開。這種獨(dú)特的染料使發(fā)光具有大于500μ s的衰變時(shí)間,遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于常規(guī)的熒光探針或自身熒光樣品的發(fā)光衰變時(shí)間,后者通常具有小于50ns的衰變時(shí)間。因此,時(shí)間分辨熒光計(jì)可以實(shí)質(zhì)上消除自身熒光。
[0007]這些銪發(fā)光染料的特點(diǎn)是長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射(?610nm),其可以與激發(fā)峰值(?365nm)很好地分離開。這種異乎尋常大的斯托克司頻移(移動(dòng))允許使用過濾器組合,這種組合可以有效地隔離需要的發(fā)光信號(hào)(Harma et al., Europium nanoparticles andtime-resolved fluorescence of ultrasensitive detect1n of prostate-specificantigen.2001 ;47:561-568)。在DELFIA系統(tǒng)中,鑭系元素離子從螯合結(jié)構(gòu)中離解出來,并進(jìn)入到熒光增強(qiáng)溶液中。這種附加的增強(qiáng)步驟要求提供一種能有效消除淬滅水并含有吸收能量的螯合化合物的環(huán)境,以便將能量進(jìn)一步傳遞到鑭系元素離子。鑭系元素磷光體由于保護(hù)水的晶體結(jié)構(gòu)而可以在沒有任何增強(qiáng)步驟的情況下被直接檢測(cè)到。使用鑭系元素磷光體的缺點(diǎn)是缺乏能將所吸收的能量有效傳遞到鑭系元素離子的光吸收基團(tuán)。在20世紀(jì)70年代后期,F(xiàn)rank和Sundberg認(rèn)識(shí)到,通過將這些特性結(jié)合到膠乳粒子中,可以制備具有非常高的特異性(比)活性的熒光粒子。他們制備了膠乳粒子,該乳膠粒子包含有與三正辛基氧化膦絡(luò)合的噻吩甲酰三氟丙酮鑭系元素螯合物(DELFIA技術(shù)中與三正辛基氧化膦絡(luò)合的萘甲酰三氟丙酮),該絡(luò)合物提供沒有淬滅效應(yīng)的粒子,但是在該粒子內(nèi)部具有一個(gè)光吸收基團(tuán)。聚合物外殼通過生成疏水環(huán)境有效地將熒光-淬滅水從螯合物的附近去除。使用這種粒子標(biāo)記物可以進(jìn)行極靈敏的測(cè)定(Harma et al., 2001, Soukka et al.,2001a)。這些納米尺寸的聚合物標(biāo)記物包含被β - 二酮俘獲的30,000-2,000,000個(gè)銪分子,銪分子具有已知的鑭系元素螯合物的最高量子產(chǎn)量之一(Harma et al.Europium nanoparticlesand time-resolved fluorescence of ultrasensitive detect1n of prostate-specificantigen.2001 ;47:561-568)。這種封裝(包封)對(duì)熒光效率沒有負(fù)面影響。對(duì)于一個(gè)10nm大小的銪粒子,其熒光產(chǎn)量相當(dāng)于大約3,000個(gè)熒光素分子。藻膽蛋白B-PE(可能是已知的最具有熒光性的物質(zhì))具有相當(dāng)于大約30個(gè)熒光素分子的熒光產(chǎn)量。由于一個(gè)10nm的粒子大約是藻膽蛋白B-PE直徑的10倍,而其體積/質(zhì)量是1000倍,以摩爾為基礎(chǔ)比較,這些銪粒子比B-PE的熒光性大100倍。這種粒子由于其巨大的熒光性、較寬的斯托克司頻移和長(zhǎng)壽命的發(fā)光將會(huì)使測(cè)定具有超靈敏性。封裝:使30,000-2, 000, 000個(gè)銪分子存在于單一粒子中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明涉及一種高度靈敏的分析(化驗(yàn))系統(tǒng),包括但不局限于以橫流式(側(cè)流式或橫向流動(dòng)式)測(cè)定格式(規(guī)格化)(lateral flow assay format)使用的時(shí)間分辨的熒光染料,該系統(tǒng)確保提高的靈敏性,同時(shí)保持橫流式測(cè)定的有利方面。
[0009]在一個(gè)方面中,本發(fā)明涉及一種使用高度靈敏的銪粒子作為標(biāo)記物的層析(色譜)測(cè)試系統(tǒng)。層析測(cè)定可以給出快速的結(jié)果,方便(大多數(shù)是一步)并具有合理的靈敏度。在另一方面,本發(fā)明涉及一種靈敏的核酸檢測(cè)設(shè)備以及其中的系統(tǒng)。熒光稀土螯合物結(jié)合入基質(zhì)的應(yīng)用提供了高度靈敏的測(cè)定。
[0010]在另一方面,本發(fā)明涉及一種基因材料檢測(cè)系統(tǒng),該系統(tǒng)經(jīng)由基于核酸方法的非聚合酶鏈反應(yīng)或聚合酶鏈反應(yīng),針對(duì)存在的諸如RNA病毒、DNA病毒、細(xì)胞成分的RNA或DNA這樣的分析物進(jìn)行檢測(cè)。這種檢測(cè)系統(tǒng)的使用是快速容易的,并具有高靈敏度和特異性。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括以下方面:
[0012]本系統(tǒng)是極端靈敏的,這是分析物檢測(cè)的基本要求。
[0013]本發(fā)明的產(chǎn)品可以現(xiàn)場(chǎng)使用,減少了將樣品傳輸?shù)浆F(xiàn)場(chǎng)外的需要。
[0014]樣品制備之后大約15分鐘左右,有可能對(duì)本發(fā)明的產(chǎn)品發(fā)出陽(yáng)性結(jié)果的即時(shí)警報(bào)。應(yīng)該明白雖然本發(fā)明的系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)之一是檢測(cè)系統(tǒng)的快速性,但本發(fā)明不局限于在任何特定時(shí)間所得到的結(jié)果。這些結(jié)果可以在大約20分鐘、30分鐘、40分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)獲得,這取決于不同的條件。
[0015]這種一步法的測(cè)定過程實(shí)施簡(jiǎn)單,測(cè)試結(jié)果在15分鐘左右讀取,并且不需要任何額外步驟。
[0016]本發(fā)明的產(chǎn)品可以由沒有經(jīng)過高等教育和具有專業(yè)技術(shù)的人員實(shí)施。
[0017]本發(fā)明的產(chǎn)品可以在室溫下存儲(chǔ),而其它商品一般需要冷藏。
[0018]在本發(fā)明的另一方面,涉及一種關(guān)注點(diǎn)(Point-of-Care)檢測(cè)或者用于各種分析物的各種檢測(cè)設(shè)置,這是由于它:1)步驟簡(jiǎn)單;2)可現(xiàn)場(chǎng)使用;3)利用穩(wěn)定的試劑;4)不需要特別的存儲(chǔ);以及5)快速的結(jié)果。
[0019]本發(fā)明涉及一種分析物檢測(cè)裝置,該裝置具有至少一個(gè)儲(chǔ)存區(qū)域和芯吸膜,其中在該儲(chǔ)存區(qū)域上注入經(jīng)標(biāo)記的特異性結(jié)合的配偶體(parter);而在該芯吸膜上的區(qū)域固定有至少一種化學(xué)成分。如在該裝置中所使用的,該標(biāo)記物可以是稀土螯合物,特別是鑭系元素(III)螯合物,尤其是,該標(biāo)記物可以是銪(III)、鋱(III)、釤(III)或鏑(III)、或其組合。
[0020]在該裝置中,分析物可以不局限于抗原、抗體、核酸或半抗原。特異性結(jié)合的配偶體可以不局限于抗原、抗體、核酸、生物素或生物素類似物、鏈霉抗生物素(蛋白)、抗生物素蛋白或半抗原。并且該化學(xué)成分可以是抗原、抗體、核酸、生物素或生物素類似物、鏈霉抗生物素(蛋白)、抗生物素蛋白或半抗原。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)方面,該裝置可以是橫流式的測(cè)定格式(規(guī)格化)裝置。
[0022]在本發(fā)明的另一方面,本發(fā)明涉及一種測(cè)定樣品中存在至少一種類型的分析物的方法,該方法包括將一定數(shù)量的樣品施加于上述裝置,其中如果樣品中存在至少一種類型的分析物,則該樣品遷移到芯吸膜,在芯吸膜中發(fā)生化學(xué)反應(yīng),其中信號(hào)的存在指示該分析物存在于樣品中。在本發(fā)明的實(shí)施中,該信號(hào)可以由稀土螯合物生成,特別是鑭系元素
(III)螯合物,尤其是,該標(biāo)記物可以是銪(III)、鋱(III)、釤(III)、或鏑(III)、或其組合。
[0023]在本方法中,該樣品可以是生物樣品。而且,該樣品可以不局限于血液、血清、血漿、尿、唾液、汗液和來自生物樣品或環(huán)境樣品的經(jīng)處理的液態(tài)介質(zhì)。被檢測(cè)的分析物可以是抗原、抗體、核酸或半抗原。并且該化學(xué)反應(yīng)可以與抗原、抗體、核酸、生物素或生物素類似物、鏈霉抗生物素(蛋白)、抗生物素蛋白或半抗原進(jìn)行。在樣品中可以檢測(cè)到多種分析物。用于本方法的裝置可以不局限于橫流式的測(cè)定格式裝置。并且該分析物可以對(duì)病原體是特異性的。
[0024]本發(fā)明還涉及一種包括隔間的試劑盒,其包括上述裝置,以及用于使用上述裝置的說明書。
[0025]本發(fā)明還涉及高靈敏度的核酸檢測(cè)系統(tǒng)。本發(fā)明的基于核酸的檢測(cè)系統(tǒng)能夠放大來自生物樣品的低濃度的特定基因組的DNA或RNA序列的信號(hào)。這種方法也是獨(dú)特的、特異的、簡(jiǎn)單的,并且該放大系統(tǒng)易于在可現(xiàn)場(chǎng)展開的(field-d印loyable)檢測(cè)組件中操作。
[0026]時(shí)間分辨熒光計(jì)技術(shù)是一種基于包埋有微小粒子的銪系統(tǒng),其與低聚核苷酸、肽核酸(PNA)、抗原或抗體(共軛)結(jié)合。
[0027]任何疾病標(biāo)記物或環(huán)境物質(zhì)(對(duì)于它們的檢測(cè)都需要高靈敏度的工具)均可以使用這種技術(shù)。
[0028]本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)將由本發(fā)明的下面的描述、作為參照的附圖以及所附的權(quán)利要求而得到更加充分的理解。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]本發(fā)明將由下文所給出的詳細(xì)描述以及僅作為舉例說明所給出的附圖得到更加充分的理解,因此其不是對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0030]圖1示出本發(fā)明的裝置的原理描述。
[0031]圖2示出用于檢測(cè)多種分析物的本發(fā)明的裝置。
[0032]圖3示出測(cè)試裝置的圖片。
[0033]圖4示出快速層析檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。
[0034]圖5示出㈧膠狀金抗體結(jié)合物的圖像結(jié)果,⑶銪粒子的圖像結(jié)果。
[0035]圖6示出快速核酸檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。
[0036]圖7示出用于檢測(cè)樣品諸如來自生物病原體的特定DNA序列的測(cè)定(化驗(yàn))原理的圖解。
[0037]圖8示出用于測(cè)量時(shí)間分辨的鑭系元素發(fā)射的儀器(Xiao,M and Selvin, PR.An improved instrument for measuring time-resolved lanthanide emiss1n andresonance energy transfer.Review of scientific instrumentsl999 ;70 (10): 3877-81)。
[0038]圖9示出測(cè)試設(shè)備的圖片。
[0039]圖10示出一種測(cè)試條(帶)的實(shí)施例。
[0040]圖11示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0041]圖12示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0042]圖13示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0043]圖14示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0044]圖15示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0045]圖16示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0046]圖17示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0047]圖18示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
[0048]圖19示出一種測(cè)試條的實(shí)施例。
【具體實(shí)施方式】
[0049]在本申請(qǐng)中,“一”和“一個(gè)/ 一種”用于指單個(gè)和多個(gè)對(duì)象。
[0050]如在本文中所使用的,“底部組件”是指固體材料,其為測(cè)試條(帶)提供支撐和結(jié)合。該支撐物可以由一已被切成大小適于包括全部的測(cè)定內(nèi)容物而給用戶提供方便的薄玻璃片、紙片或塑料片組成。
[0051]如在本文中所使用的,“干的多孔載體”或“芯吸膜”是指一種多孔的足以允許液體遷移(移動(dòng))并接近過濾元件的物質(zhì)。通常用于干的多孔載體的材料包括但不限于:尼龍、纖維素、聚砜、聚偏二乙烯二氟化物、纖維素乙酸酯、聚氨酯、玻璃纖維以及硝化纖維。
[0052]如在本文中所使用的,“過濾器”可以由任何數(shù)量的過濾材料制成。通常使用的過濾材料可以包括但不限于:纖維素、聚酯、聚氨酯、尼龍和玻璃纖維。這種過濾區(qū)域可以包括C:藏帶(墊)和吸收帶(墊)。
[0053]如在本文中所使用的,“熒光稀土螯合物”可以是在U.S.專利第4,259,313和4,283,382號(hào)中所描述的,將上述專利的全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。因此,本發(fā)明描述了使用長(zhǎng)壽命熒光組合物的方法,該組合物是通過將稀土金屬的螯合物(優(yōu)選是銪和鋱)結(jié)合到聚合物基質(zhì)(諸如膠乳粒子)中而制備的。該螯合劑強(qiáng)烈地吸收光,并有效地將能量傳遞給金屬。該膠乳結(jié)構(gòu)給予熒光稀土螯合物水穩(wěn)定性,該熒光稀土螯合物以前在含水液體中已遭受淬滅。然后可以將衍生自該膠乳并具有結(jié)合在膠乳中的稀土螯合物的聚合珠用作熒光標(biāo)記物,以便通過將抗原、抗體、植物凝集素、碳水化合物或其它這類蛋白質(zhì)化合物、脂質(zhì)和核酸吸收或共價(jià)連接到聚合膠乳珠的表面而形成標(biāo)記試劑。
[0054]如在本文中所使用的,“注入(的)”是指被結(jié)合到測(cè)定系統(tǒng)中的試劑,其中將它們干燥或凍干到測(cè)定系統(tǒng)上去。
[0055]如在本文中所使用的,“聚合物粒子”是指各種尺寸的球形或接近球形的聚合物粒子。優(yōu)選地,大小為直徑大約在0.05-0.5 μ m之間。然而,應(yīng)該明白本發(fā)明不局限于使用任何特定類型的聚合物粒子。在它最廣泛的意義上,任何可以封裝熒光染料的物質(zhì)或粒子都本發(fā)明所涵蓋。
[0056]如在本文中所使用的,“特定(特異性)連接試劑”或“特定(特異性)連接劑”或“特定(特異性)連接配偶體”包括但不局限于:抗體、抗原、半抗原、半抗原-大分子(例如牛血清白蛋白)結(jié)合物、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素(蛋白)、生物素、生物素-大分子(例如牛血清白蛋白)結(jié)合物、低聚核苷酸、肽核酸以及核酸基因物質(zhì)。
[0057]如在本文中所使用的,“標(biāo)記物”是指一種被標(biāo)記到特定連接試劑上的物質(zhì),它被標(biāo)記有時(shí)間分辨的熒光染料。該標(biāo)記物特異性地與固定在固相上的特定連接劑反應(yīng)。特別是,當(dāng)固定在固相上的特定連接劑是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素(蛋白)時(shí),該標(biāo)記物可以是生物素。當(dāng)固定在固相上的特定連接劑是對(duì)標(biāo)記物的半抗原有特異性的抗體時(shí),該標(biāo)記物可以是半抗原。
[0058]如在本文中所使用的,“時(shí)間分辨的熒光計(jì)”是指一種使用設(shè)備,該設(shè)備用于測(cè)量熒光強(qiáng)度在短激發(fā)脈沖之后的時(shí)間相關(guān)性,激發(fā)脈沖也可以被制成發(fā)射波長(zhǎng)的函數(shù)。
[0059]層析放大
[0060]在一個(gè)方面,本發(fā)明涉及一種適于快速層析測(cè)試的裝置。
[0061 ] 本發(fā)明的測(cè)試可以在現(xiàn)場(chǎng)由一個(gè)具有最簡(jiǎn)單培訓(xùn)的外行實(shí)施,在給一次性測(cè)試裝置(設(shè)備)或測(cè)試卡或測(cè)試條加入一兩滴樣品之后可以快速得到結(jié)果。結(jié)果可以目視讀取而不需任何進(jìn)一步的干預(yù)。在本發(fā)明的一個(gè)方面,所建議的測(cè)試的步驟可以如下:僅出于討論的目的,測(cè)試可以根據(jù)抗原/抗體反應(yīng)來討論。然而,應(yīng)該明白,該測(cè)定(測(cè)試)不局限于抗原/抗體復(fù)合物。對(duì)于任何感興趣的分子(其特定連接配偶體是已知的),可以將特定連接劑用于和注入到裝置中來對(duì)所感興趣的分子的存在進(jìn)行測(cè)定。這種所感興趣的分子與它的特定連接配偶體可以包括但不局限于:抗原/抗體、配體/受體、核酸/核酸、核酸/抗體、脂質(zhì)/特定連接配偶體(諸如抗體)、碳水化合物/特定的連接配偶體(諸如抗體)等。僅出于舉例說明的目的,在下面的討論中,主要討論抗原/抗體以及核酸/核酸的相互作用,應(yīng)該理解,使用特定連接配偶體的原理適用于來自任何樣品源的任何類型的分子。
[0062]將液態(tài)樣品加入到該測(cè)試設(shè)備或測(cè)試卡或測(cè)試條中。當(dāng)該液體由毛細(xì)作用傳送(芯吸)/移動(dòng)經(jīng)過該卡時(shí),目標(biāo)抗原與嵌入染料帶(墊)中的經(jīng)標(biāo)記的特定抗體發(fā)生反應(yīng)。該材料流入膜中,其中一組未經(jīng)標(biāo)記的抗體被固定在至少一個(gè)不同的區(qū)域或多個(gè)區(qū)域內(nèi)。被抗原標(biāo)記的抗體復(fù)合物被保留/俘獲,從而產(chǎn)生用于讀取的經(jīng)限定的線條。該線條可以由裝配有時(shí)間分辨熒光計(jì)或任何其它合適的檢測(cè)機(jī)器的讀取器檢測(cè)到。在分隔開的對(duì)照區(qū)域,該測(cè)試中被過量標(biāo)記的抗體與嵌入的非特異性抗體發(fā)生反應(yīng),以便能為關(guān)鍵測(cè)試元件正常發(fā)揮作用提供保證,由此將其用作陽(yáng)性對(duì)照。該測(cè)試的非限制性原理在圖1中進(jìn)一步示出。
[0063]將液態(tài)樣品加入到測(cè)試設(shè)備或測(cè)試卡或測(cè)試條(帶)中。當(dāng)該液體芯吸/移動(dòng)經(jīng)過該測(cè)試卡時(shí),目標(biāo)抗原與嵌入染料帶中的經(jīng)標(biāo)記的特定抗體發(fā)生反應(yīng)。該材料流入膜中,其中一組未經(jīng)標(biāo)記抗體被固定在至少一個(gè)不同的區(qū)域或多個(gè)區(qū)域中。被抗原標(biāo)記的抗體復(fù)合物被保留/俘獲,從而產(chǎn)生用于讀取的經(jīng)限定的線條。該線條可以由裝配有時(shí)間分辨熒光計(jì)或任何其它合適的檢測(cè)機(jī)器的讀取器檢測(cè)到。
[0064]具有橫流式測(cè)定的層析測(cè)定,例如,是一種放大系統(tǒng)。該液體樣品中的目標(biāo)抗原在利用毛細(xì)管吸力移動(dòng)通過膜時(shí)被固定在膜上的高親和力的抗體穩(wěn)定地集中。其結(jié)果是,即使該抗原可能在實(shí)際樣品中處于非常低的濃度,但在測(cè)試線條或測(cè)試區(qū)中所俘獲的抗原的濃度比該樣品中的濃度高得多。此外,毛細(xì)管遷移也連續(xù)地將目標(biāo)抗原提供給經(jīng)固定的抗體。
[0065]通常,當(dāng)該俘獲抗體與抗原如在常規(guī)的測(cè)定中那樣形成一種復(fù)合物時(shí),圍繞著固定在固相上的俘獲抗體的微環(huán)境抗原的濃度降低。一般而言,這種圍繞著固定在固相上的抗體的抗原的耗減是測(cè)定靈敏性,特別是微型板測(cè)定和基于芯片的測(cè)定中的主要問題之一,因?yàn)檫@導(dǎo)致了圍繞抗體的抗原濃度的實(shí)際降低。
[0066]在一可選的實(shí)施例中,吸水性強(qiáng)的膜(例如硝化纖維)的三維結(jié)構(gòu)為抗體連接到固相提供了更多的表面區(qū)域。這使得層析(色譜)測(cè)定比其它兩維測(cè)定系統(tǒng)(例如微型板測(cè)定)具有更大的俘獲容量。
[0067]本發(fā)明還涉及多種分析物檢測(cè)系統(tǒng),它僅利用單一抽樣來實(shí)現(xiàn),并且本發(fā)明的層析測(cè)定不需要進(jìn)一步的程序步驟。如果將各種抗體-染料結(jié)合物嵌入到染料帶區(qū)域中并且將對(duì)每一種抗原特異性的抗體分別固定在膜上不同的區(qū)域,那么每一測(cè)試線條提供針對(duì)每一特定抗原和特定試劑的不同信息(圖2)。還可以預(yù)期該裝置可以檢測(cè)多于一種類型的分析物。例如,作為實(shí)施例,參照?qǐng)D2,可以給測(cè)試區(qū)I注入以抗體來檢測(cè)抗原;可以給測(cè)試區(qū)2注入以受體來檢測(cè)配體;并且可以給測(cè)試區(qū)3注入以對(duì)于序列特定連接的核酸。
[0068]在一個(gè)方面,本發(fā)明涉及一種使用單一粒子中包含大約30,0000-1, 000, 000個(gè)銪原子的熒光銪粒子的信號(hào)放大系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以是一種改進(jìn)的層析測(cè)定,具有如下的優(yōu)點(diǎn),諸如:1)簡(jiǎn)單的測(cè)試步驟;2)可現(xiàn)場(chǎng)使用;3)使用穩(wěn)定的試劑;4)不需要專門的存儲(chǔ)器;以及5)快速的結(jié)果。經(jīng)放大的信號(hào)可以由提供定量或定性結(jié)果的小的便攜式讀取器檢測(cè)到。
[0069]測(cè)試條可以封裝在一容器內(nèi),該容器優(yōu)選是一種可展開的塑料盒,但是也可以由任何物質(zhì)制成并能夠安全容納內(nèi)容物。測(cè)試盒可以包括多個(gè)窗口,優(yōu)選至少有兩個(gè)窗口或開口,至少一個(gè)用來查看對(duì)照線和/或測(cè)試線或測(cè)試帶,另一個(gè)提供一槽(孔)來接收樣品(圖3)。參照?qǐng)D4,在該裝置內(nèi)部可以是一個(gè)優(yōu)選具有兩個(gè)帶(墊)的測(cè)試帶。第一帶(墊),儲(chǔ)存區(qū)I或樣品槽,可以用于樣品的接收和從樣品中去除干擾物質(zhì)。另外,第一帶(墊)可以在特別設(shè)計(jì)的緩沖系統(tǒng)中包含銪粒子-特定連接配偶體結(jié)合物3。注入到儲(chǔ)存區(qū)的經(jīng)標(biāo)記的特定連接試劑可以連接樣品中的分析物,隨后分析物/特定連接配偶體復(fù)合物通過毛細(xì)作用被傳送通過芯吸膜6,直到形成測(cè)試帶4,其中該分析物的另一特異性連接劑俘獲該分析物/特定連接配偶體復(fù)合物,由此形成一測(cè)試帶。該樣品進(jìn)一步通過毛細(xì)作用被傳送并使連接配偶體與注入到芯吸膜的特定連接配偶體相遇,并形成了對(duì)照帶5。第二帶(墊)7為吸收帶(墊),可以用于除去已通過該反應(yīng)膜的過量液體。將第一帶、第二帶以及芯吸膜連接到塑料板2上。
[0070]可以將兩種類型的試劑分別固定在膜上作為細(xì)線條或細(xì)帶??梢詫?duì)該(共軛)結(jié)合的抗體具有特異性的抗體固定在對(duì)照窗口,而將對(duì)分析物(諸如生物威脅劑(b1threat agent)或任何想要被檢測(cè)到的試劑)具有特異性的抗體固定在檢測(cè)窗口中(圖3和4)。
[0071]層析測(cè)定原理
[0072]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒被設(shè)計(jì)成一種自我實(shí)施的裝置。如圖1所示,它可以包含所有精確數(shù)量的試劑和成分,用來在加入樣品后產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果。該樣品首先通過包含各種材料的儲(chǔ)存墊。它可以包含:(a)緩沖液,用以優(yōu)化樣品的pH值,(a)去污劑,用以懸浮樣品中的所有成分,以及(a)多孔過濾器,用以生成合適的通過裝置的流量。該樣品隨后通過毛細(xì)管作用或擴(kuò)散流動(dòng)到染料區(qū)或染料帶,在那里檢測(cè)試劑與經(jīng)標(biāo)記的特定連接劑發(fā)生反應(yīng),經(jīng)標(biāo)記的特定連接劑優(yōu)選被對(duì)試劑具有特異性的銪粒子標(biāo)記物標(biāo)記。反應(yīng)復(fù)合物然后遷移通過芯吸膜,在那里試劑中未反應(yīng)的連接部位(位點(diǎn))與經(jīng)固定的特定連接劑發(fā)生反應(yīng),并在檢測(cè)窗口中生成一線條或條帶。耗損的樣品和未結(jié)合的染料復(fù)合物的剩余物繼續(xù)遷移到對(duì)照窗口,在那里對(duì)該結(jié)合抗體由特異性抗體被固定,以便保留染料復(fù)合物并形成對(duì)照線條。也可以預(yù)期,反應(yīng)復(fù)合物可以在到達(dá)檢測(cè)區(qū)域之前遇到對(duì)照區(qū)域。
[0073]在本發(fā)明的一個(gè)方面,其結(jié)果是一種用于定性或定量檢測(cè)生物試劑的固相層析測(cè)定。在檢測(cè)步驟中,可以將大約60 μ L的液體樣品添加到樣品施加區(qū),并且可以由儀器在大約15分鐘左右提供結(jié)果。應(yīng)該明白,雖然測(cè)定的快速性是本發(fā)明的系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn),但獲得結(jié)果的確切時(shí)間可能根據(jù)條帶和樣品的不同而變化。因此,本發(fā)明不受任何特定的測(cè)定時(shí)間的限制。
[0074]實(shí)施例1
[0075]在一個(gè)檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0076]至少一個(gè)過濾元件I,已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;以及
[0077]干的多孔載體6 (例如硝化纖維),其是多孔的,足以使液體遷移并接近過濾元件,其中
[0078]至少一種特定連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)域(圖10)。
[0079]實(shí)施例2
[0080]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0081]至少一個(gè)第一過濾元件I,已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0082]至少一個(gè)第二過濾元件11,插入到第一過濾元件和干的多孔載體之間,并且其多孔性足以使液體遷移;以及
[0083]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以使液體遷移并接近第二過濾元件,其中
[0084]至少一種特定連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)域(圖11)。
[0085]實(shí)施例3
[0086]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0087]至少一個(gè)第一過濾元件I,其插入到第二過濾元件11和干的多孔載體6之間、其是多孔的足以使液體遷移,并且已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0088]至少一個(gè)第二過濾元件11,接近第一過濾元件1,并且其是多孔的,足以使液體遷移;以及
[0089]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以使液體遷移并接近第一過濾元件,其中
[0090]至少一種特定連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)域(圖12)。
[0091]實(shí)施例4
[0092]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0093]底部組件2 ;
[0094]設(shè)置在底部組件2上的排列,該排列包括:
[0095]至少一個(gè)過濾元件I,已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;以及
[0096]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的足以使液體遷移并接近過濾元件,其中
[0097]至少一種特定連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)(圖13)。
[0098]實(shí)施例5
[0099]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0100]底部組件2;
[0101]設(shè)置在底部組件2上的排列,該排列包括:
[0102]至少一個(gè)過濾元件I,已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0103]至少一個(gè)第二過濾元件11,其被插入到第一過濾元件I和干的多孔載體6之間,并且其是多孔的,足以允許液體移動(dòng);以及
[0104]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以允許液體移動(dòng)并接近第二過濾元件,其中
[0105]至少一種特異性連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)域(圖14)。
[0106]實(shí)施例6
[0107]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0108]底部組件2;
[0109]布置在底部組件2上的排列,該排列包括:
[0110]至少一個(gè)第一過濾元件1,其被插入到第二過濾元件11和干的多孔載體之間、其是多孔的足以允許液體移動(dòng),并且已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0111]至少一個(gè)第二過濾元件11,其接近第一過濾元件1,并且是多孔的,足以允許液體移動(dòng);以及
[0112]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以允許液體遷移并接近第一過濾元件1,其中
[0113]至少一種特定的連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)(圖15)。
[0114]實(shí)施例7
[0115]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0116]底部組件2;
[0117]布置在底部組件2上的排列,該排列包括:
[0118]至少一個(gè)過濾元件I,已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0119]至少一個(gè)第二過濾元件11,其已經(jīng)被注入一種或多種對(duì)固定在干的多孔載體6中的特定連接試劑有特異反應(yīng)性的標(biāo)記物所標(biāo)記的特定連接試劑,其被插入到第一過濾元件I和干的多孔載體6之間,并且其是多孔的足以允許液體移動(dòng);以及
[0120]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以允許液體遷移并接近第二過濾元件,其中
[0121]至少一種特定連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)域(圖16)。
[0122]實(shí)施例8
[0123]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0124]至少一個(gè)第一過濾元件1,其插入到第二過濾元件11和干的多孔載體之間,其是多孔的足以允許液體移動(dòng),并且已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0125]至少一個(gè)第二過濾元件11,其已經(jīng)被注入一種或多種對(duì)固定在干的多孔載體6中的特定連接試劑有特異反應(yīng)性的標(biāo)記物所標(biāo)記的特定連接試劑,其接近第一過濾元件I,并且是多孔的,足以允許液體移動(dòng);以及
[0126]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以允許液體移動(dòng)并接近第一過濾元件,其中
[0127]至少一種特定的連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)(圖17)。
[0128]實(shí)施例9
[0129]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0130]底部組件2;
[0131]布置在底部組件2上的排列,該排列包括:
[0132]至少一個(gè)過濾元件1,已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0133]至少一個(gè)第二過濾元件11,其已經(jīng)被注入一種或多種對(duì)固定在干的多孔載體6中的特定連接試劑有特異反應(yīng)性的標(biāo)記物所標(biāo)記的特定連接試劑,其被插入到第一過濾元件I和干的多孔載體6之間,并且其是多孔的足以允許液體移動(dòng),;以及
[0134]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以允許液體移動(dòng)并接近第二過濾元件,其中
[0135]至少一種特定的連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)(圖18)。
[0136]實(shí)施例10
[0137]在另一檢測(cè)裝置的實(shí)施例中,該裝置包括以下特征:
[0138]底部組件2;
[0139]設(shè)置在底部組件2上的排布,該排布包括:
[0140]至少一個(gè)第一過濾元件1,其插入到第二過濾元件11和干的多孔載體之間,其是多孔的足以允許液體移動(dòng),并且已經(jīng)被注入一種或多種特定連接試劑,該特定連接試劑用包括被結(jié)合到聚合物粒子3中的熒光稀土螯合物的熒光標(biāo)記物所標(biāo)記;
[0141]至少一個(gè)第二過濾元件11,其已經(jīng)被注入一種或多種對(duì)固定在干的多孔載體6中的特定連接試劑有特異反應(yīng)性的標(biāo)記物所標(biāo)記的特定連接試劑,其接近第一過濾元件I,并且是多孔的,足以允許液體移動(dòng);以及
[0142]干的多孔載體6 (例如硝化纖維膜),其是多孔的,足以允許液體移動(dòng)并接近第一過濾元件1,其中
[0143]至少一種特定的連接試劑被固定在至少一個(gè)干的多孔載體區(qū)(圖19)。
[0144]層狀結(jié)構(gòu)測(cè)定
[0145]抗體一抗體層狀結(jié)構(gòu)
[0146]固定在固相上的特定連接劑(特異性連接物):單克隆抗體和/或多克隆抗體。被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑:被熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體和/或多克隆抗體。
[0147]抗體一抗原層狀結(jié)構(gòu)
[0148]抗體一抗原層狀結(jié)構(gòu)I
[0149]被固定在固相上的特定連接劑:對(duì)樣品中的分析物抗體有特異性的抗原(例如與人的抗-HIV-lgp41抗體特異性反應(yīng)的HIV-lgp41抗原)
[0150]被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑:被熒光染料標(biāo)記的次要(次級(jí))單克隆抗體和/或多克隆抗體。這種抗體對(duì)樣品中的主要(初級(jí))抗體有特異性。
[0151]抗體一抗原層狀結(jié)構(gòu)2
[0152]被固定在固相上的特定連接劑:次要單克隆抗體和/或多克隆抗體。這種抗體對(duì)樣品中的主要抗體有特異性。
[0153]被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑:抗原(被熒光染料標(biāo)記的)對(duì)樣品中的分析物抗體有特異性(例如與人的抗_HIV-lgp41抗體特異性反應(yīng)的HIV-lgp41抗原)
[0154]抗原一抗原層狀結(jié)構(gòu)
[0155]被固定在固相上的特定連接劑:對(duì)樣品中的分析物抗體有特異性的抗原(例如與人的抗-HIV-lgp41抗體特異性反應(yīng)的HIV-lgp41抗原)
[0156]被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑:抗原(被熒光染料標(biāo)記的)對(duì)樣品中的分析物抗體有特異性(例如與人的抗_HIV-lgp41抗體特異性反應(yīng)的HIV-lgp41抗原)
[0157]這種格式(規(guī)格)包括:
[0158]被固定在固相上的特定連接劑(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素(蛋白));被標(biāo)記物(例如生物素)標(biāo)記的特定連接試劑,其對(duì)被固定在固相上的特定連接劑進(jìn)行特異性反應(yīng);被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑。
[0159]這種格式適用于上述的所有測(cè)定格式;將被固定在固相上的特定連接劑替換為被固定在固相上的特定的連接劑(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素)以及被標(biāo)記物標(biāo)記的特定連接試劑。
[0160]競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定
[0161]格式(模式)I
[0162]被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑(例如對(duì)半抗原有特異性的抗體):能夠連接到感興趣的樣品中的分析物,用以形成反應(yīng)復(fù)合物(螯合物)。
[0163]被固定在固相上的特定的連接劑(例如半抗原):能夠與被熒光染料標(biāo)記的游離的特定連接試劑反應(yīng),并且能夠從反應(yīng)復(fù)合物中競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)移分析物,并與被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑反應(yīng)。
[0164]格式2
[0165]被固定在固相上的特定的連接劑(例如對(duì)半抗原有效的抗體):能夠競(jìng)爭(zhēng)連接到感興趣的樣品中的分析物上或被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑(例如半抗原)上。
[0166]被熒光染料標(biāo)記的特定連接劑(例如半抗原):能夠與感興趣的樣品中的分析物競(jìng)爭(zhēng)。
[0167]格式3
[0168]該格式包括:
[0169]被固定在固相上的特定連接劑(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素);被標(biāo)記物標(biāo)記的特定連接試劑(例如生物素),其對(duì)被固定在固相上的特定連接劑特異性反應(yīng);被熒光染料標(biāo)記的特定連接試劑(半抗原)。
[0170]這種格式適用于上述的所有測(cè)定格式;將被固定在固相上的特定連接劑替換為被固定在固相上的特定的連接劑(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素)以及被標(biāo)記物標(biāo)記的特定連接試劑。
[0171]多分析物的檢測(cè)
[0172]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例,在多于一種的特定類型的被標(biāo)記試劑和相同數(shù)目類型的被固定試劑的存在下,允許檢測(cè)單一液體樣品中的多個(gè)分析物。該裝置可以單向提供多種被標(biāo)記試劑,其通過過濾元件被注入并且多種相應(yīng)的被固定的物質(zhì)被限定在干的多孔載體上的若干測(cè)定標(biāo)記區(qū)中。在雙向或多向?qū)嵤├?,多于一組元件,諸如過濾元件和干的多孔載體與共同的儲(chǔ)存區(qū)相連。
[0173]試劑盒和用于使用該試劑盒的說明書
[0174]本發(fā)明包括一種用于使用本發(fā)明的檢測(cè)裝置的試劑盒。該試劑盒可以包括一由紙板、塑料或任何其它固體物或塑料包制成的容器,該容器可以容納檢測(cè)裝置。試劑盒中可以包括關(guān)于如何使用該試劑盒的說明書。這種說明書可以寫在容器上或以書面的形式諸如說明書紙頁(yè)放入容器內(nèi)。用于使用試劑盒和檢測(cè)裝置的說明書除了紙的形式也可以是在網(wǎng)站上的電子格式。說明書也可以被放入用于銷售試劑盒的目錄中。
[0175]實(shí)施例
[0176]實(shí)施例1:使用銪螯合納米粒子制備肌鈣蛋白I檢測(cè)條帶
[0177]制備被覆蓋的抗-肌鈣蛋白I納米粒子
[0178]利用10mmol/L的^(3-二甲氨基丙基)州’-乙基碳二亞胺和100mmol/L的N-羥基硫代丁二酰亞胺將銪螯合納米粒子的羧基活化30分鐘。利用50mM MES pH為6.1的緩沖液沖洗被活化的粒子一次。加入20mM/L的抗-肌鈣蛋白I抗體。孵育2小時(shí)之后,用pH為6.1的50mM MES緩沖液沖洗抗體被覆蓋的粒子三次。
[0179]制備染料帶(墊)
[0180]通過將含有抗-肌鈣蛋白I抗體被覆蓋的納米粒子、0.2%的吐溫-20、0.25%的牛血清白蛋白、0.5%的蔗糖、1mM pH為7.5的磷酸鈉溶液注入到測(cè)定為8mmX305mm的玻璃纖維過濾器的矩形片中,并在冷凍干燥機(jī)中的恒定真空下干燥。將該染料帶在干燥器中存儲(chǔ)并保持干燥直至使用。
[0181]制備過濾帶(墊)
[0182]利用0.05%的吐溫-20、2%的蔗糖、1%的BSA和10mM pH為7.4的磷酸鈉溶液處理玻璃纖維過濾器,然后在室溫下風(fēng)干。
[0183]將抗體固定在膜上
[0184] 將雙面透明膠帶(尺寸為305mmX25mm)貼到距離薄塑料板(305mmX60mm)的底端20mm的位置。將硝化纖維膜切成305mmX25mm大小并直接貼到雙面膠帶的頂端。通過噴射30微升pH為7.5在1mM PBS中的lmg/ml山羊抗-肌鈣蛋白I抗體溶液將用于肌鈣蛋白I的經(jīng)固定的檢測(cè)線的測(cè)定標(biāo)記區(qū)限定在距離膜底端9_的位置。對(duì)于對(duì)照條帶,通過噴射將lmg/ml的多克隆抗-小鼠IgG抗體限定在距離膜底端13mm的位置。噴射之后,將該膜在室溫下干燥約12小時(shí)。底部和芯吸膜被儲(chǔ)存在干燥器中直到進(jìn)一步處理。
[0185]條帶結(jié)構(gòu)
[0186]將染料帶連接到硝化纖維膜的底端正下方的塑料底部,而將過濾帶靠近染料帶連接。然后將塑料板切成多個(gè)長(zhǎng)60mm寬4mm的條帶,使得每一條帶都包含線性排列的硝化纖維膜、染料帶和過濾帶。
[0187]測(cè)定方法和結(jié)果:
[0188]當(dāng)將70微升樣品添加到過濾帶時(shí),當(dāng)條帶暴露于UV光時(shí)在孵育之后可檢測(cè)信號(hào)開始出現(xiàn)在測(cè)定標(biāo)記區(qū)。
[0189]實(shí)施例2:使用膠體金制備肌鈣蛋白I檢測(cè)條帶
[0190]制備金溶膠
[0191]使1400ml的去離子水煮沸。添加氫金酸(hydroauric acid) (299至305mg),持續(xù)沸騰5分鐘。將溶解在1ml蒸餾水中的檸檬酸鈉(440mg)倒進(jìn)金溶液,將該溶液再沸騰10分鐘。將該溶液冷卻到環(huán)境溫度。
[0192]制備標(biāo)記物
[0193]利用40mM的碳酸鉀將金溶膠的pH調(diào)節(jié)到6.8。將在實(shí)施例1中使用的同樣的單克隆抗體添加到50ml的金溶液中,該溶液在環(huán)境溫度下被劇烈攪拌30分鐘。添加lmll5%的牛血清白蛋白,隨后將該溶液在環(huán)境溫度下連續(xù)攪拌約15分鐘。通過以下過程回收膠體金-單克隆抗體結(jié)合物:在GSA旋轉(zhuǎn)器中以10,OOOrpm的速率離心I小時(shí),棄去上層清液,隨后將得到的沉淀懸浮于在1mM pH為7.5的磷酸鈉中的25ml的2%牛血清白蛋白中。然后將懸浮液在GSA旋轉(zhuǎn)器中以10,OOOrpm的速率旋轉(zhuǎn)I小時(shí)。再次將上層清液棄去,而將沉淀懸浮于6ml在1mM pH為7.5的磷酸鈉中的2%牛血清白蛋白中。
[0194]制備染料帶
[0195]通過將含有抗-肌鈣蛋白I抗體被覆蓋的膠體金、0.2%的吐溫-20、0.25%的牛血清白蛋白、0.5%的蔗糖、1mM pH為7.5的磷酸鈉溶液注入到測(cè)定為8mmX305mm的玻璃纖維過濾器的矩形片中,并在冷凍干燥機(jī)中的恒定真空下干燥。將該染料帶在干燥器中存儲(chǔ)并保持干燥直至使用。
[0196]制備過濾帶
[0197]利用0.05%的吐溫-20、2%的蔗糖、1%的BSA和10mM pH為7.4的磷酸鈉溶液處理玻璃纖維過濾器,然后在室溫下風(fēng)干。
[0198]將抗體固定在膜上
[0199]將雙面透明膠帶(尺寸為305mmX25mm)貼到距離薄塑料板(305mmX60mm)的底端20mm的位置。將硝化纖維膜切成305mmX25mm大小并直接貼到雙面膠帶的頂端。通過噴射30微升pH為7.5在1mM PBS中的lmg/ml山羊抗-肌鈣蛋白I抗體溶液將用于肌鈣蛋白I的經(jīng)固定的檢測(cè)線的測(cè)定標(biāo)記區(qū)限定在距離膜底端9_的位置。對(duì)于對(duì)照條帶,通過噴射將lmg/ml的多克隆抗-小鼠IgG抗體限定在距離膜底端13mm的位置。噴射之后,將該膜在室溫下干燥約12小時(shí)。底部和芯吸膜被儲(chǔ)存在干燥器中直到進(jìn)一步處理。
[0200]條帶結(jié)構(gòu)
[0201]將染料帶連接到硝化纖維膜的底端正下方的塑料底部,而將過濾帶靠近染料帶連接。然后將塑料板切成多個(gè)長(zhǎng)60mm寬4mm的條帶,使得每一條帶都包含線性排列的硝化纖維膜、染料帶和過濾帶。
[0202]測(cè)定方法和結(jié)果:
[0203]當(dāng)將70微升樣品添加到過濾帶時(shí),在孵育之后可檢測(cè)信號(hào)開始出現(xiàn)在測(cè)定標(biāo)記區(qū)。
[0204]實(shí)施例3:利用每一方法制備的條帶的靈敏度比較
[0205]檢測(cè)在實(shí)施例1中制備的條帶和在實(shí)施例2中制備的條帶,以便比較其靈敏度。實(shí)施例I中制備的條帶顯示出0.025納克/毫升的靈敏度,而實(shí)施例2中制備的條帶顯示出
0.5納克/毫升的靈敏度。使用銪納米粒子制備的條帶顯示出比使用膠體金制備的條帶高大約20倍的靈敏度。
[0206]實(shí)施例4:使用銪納米粒子制備hCG檢測(cè)條帶
[0207]制備抗-hCG被覆蓋的納米粒子
[0208]利用10mmol/L的N-(3_ 二甲氨基丙基)-N’ -乙基碳二亞胺和100mmol/L的N-羥基硫代丁二酰亞胺將銪螯合納米粒子的羧基活化30分鐘。利用pH為6.1的50mMMES緩沖液沖洗被活化的粒子一次。加入20mM/L的抗-hCG抗體。孵育2小時(shí)之后,用pH為6.1的50mM MES緩沖液沖洗抗體被覆蓋的粒子三次。
[0209]制備染料帶
[0210]通過將含有抗-hCG抗體被覆蓋的納米粒子、0.2%的吐溫-20、0.25%的牛血清白蛋白、0.5%的蔗糖、1mM pH為7.5的磷酸鈉溶液注入到測(cè)定為8mmX 305mm的玻璃纖維過濾器的矩形片中,并在冷凍干燥機(jī)中的恒定真空下干燥。將該染料帶在干燥器中存儲(chǔ)并保持干燥直至使用。
[0211]制備過濾帶
[0212]利用0.05%的吐溫-20、2%的蔗糖、1%的BSA和10mM pH為7.4的磷酸鈉溶液處理玻璃纖維過濾器,然后在室溫下風(fēng)干。
[0213]將抗體固定在膜上
[0214]將雙面透明膠帶(尺寸為305mmX25mm)貼到距離薄塑料板(305mmX60mm)的底端20mm的位置。將硝化纖維膜切成305mmX 25mm大小并直接貼到雙面膠帶的頂端。通過噴射30微升pH為7.5在1mM PBS中的lmg/ml單克隆抗-hCG抗體溶液將用于hCG的經(jīng)固定的檢測(cè)線的測(cè)定標(biāo)記區(qū)限定在距離膜底端9mm的位置。對(duì)于對(duì)照條帶,通過噴射將Img/ml的多克隆抗-小鼠IgG抗體限定在距離膜底端13mm的位置。噴射之后,將該膜在室溫下干燥約12小時(shí)。底部和芯吸膜被儲(chǔ)存在干燥器中直到進(jìn)一步處理。
[0215]條帶結(jié)構(gòu)
[0216]將染料帶連接到硝化纖維膜的底端正下方的塑料底部,而將過濾帶靠近染料帶連接。然后將塑料板切成多個(gè)長(zhǎng)60mm寬4mm的條帶,使得每一條帶都包含線性排列的硝化纖維膜、染料帶和過濾帶。
[0217]測(cè)定方法和結(jié)果:
[0218]當(dāng)將70微升樣品添加到過濾帶時(shí),當(dāng)條帶暴露于UV光時(shí)在孵育之后可檢測(cè)信號(hào)開始出現(xiàn)在測(cè)定標(biāo)記區(qū)。
[0219]實(shí)施例5:使用膠體金制備hCG檢測(cè)條帶
[0220]制備金溶膠
[0221]使1400ml的去離子水煮沸。添加氫金酸(hydroauric acid) (299至305mg),持續(xù)沸騰5分鐘。將溶解在1ml蒸餾水中的檸檬酸鈉(440mg)倒進(jìn)金溶液,將該溶液再沸騰10分鐘。將該溶液冷卻到環(huán)境溫度。
[0222]制備標(biāo)記物
[0223]利用40mM的碳酸鉀將金溶膠的pH調(diào)節(jié)到6.8。將在實(shí)施例4中使用的同樣的單克隆抗體添加到50ml的金溶液中,該溶液在環(huán)境溫度下被劇烈攪拌30分鐘。添加lmll5%的牛血清白蛋白,隨后將該溶液在環(huán)境溫度下連續(xù)攪拌約15分鐘。通過以下過程回收膠體金-單克隆抗體結(jié)合物:在GSA旋轉(zhuǎn)器中以10,OOOrpm的速率離心I小時(shí),棄去上層清液,隨后將得到的沉淀懸浮于在1mM pH為7.5的磷酸鈉中的25ml的2%牛血清白蛋白中。然后將懸浮液在GSA旋轉(zhuǎn)器中以10,OOOrpm的速率旋轉(zhuǎn)I小時(shí)。再次將上層清液棄去,而將沉淀懸浮于6ml在1mM pH為7.5的磷酸鈉中的2%牛血清白蛋白中。
[0224]制備染料帶
[0225]通過將含有抗-hCG抗體被覆蓋的膠體金、0.2%的吐溫-20、0.25%的牛血清白蛋白、0.5%的蔗糖、1mM pH為7.5的磷酸鈉溶液注入到測(cè)定為8mmX 305mm的玻璃纖維過濾器的矩形片中,并在冷凍干燥機(jī)中的恒定真空下干燥。將該染料帶在干燥器中存儲(chǔ)并保持干燥直至使用。
[0226]制備過濾帶
[0227]利用0.05%的吐溫-20、2%的蔗糖、1%的BSA和10mM pH為7.4的磷酸鈉溶液處理玻璃纖維過濾器,然后在室溫下風(fēng)干。
[0228]將抗體固定在膜上
[0229]將雙面透明膠帶(尺寸為305mmX25mm)貼到距離薄塑料板(305mmX60mm)的底端20mm的位置。將硝化纖維膜切成305mmX25mm大小并直接貼到雙面膠帶的頂端。通過噴射30微升pH為7.5在1mM PBS中的lmg/ml山羊抗-肌鈣蛋白I抗體溶液將用于hCG的經(jīng)固定的檢測(cè)線的測(cè)定標(biāo)記區(qū)限定在距離膜底端9_的位置。對(duì)于對(duì)照條帶,通過噴射將lmg/ml的多克隆抗-小鼠IgG抗體限定在距離膜底端13mm的位置。噴射之后,將該膜在室溫下干燥約12小時(shí)。底部和芯吸膜被儲(chǔ)存在干燥器中直到進(jìn)一步處理。
[0230]條帶結(jié)構(gòu)
[0231]將染料帶連接到硝化纖維膜的底端正下方的塑料底部,而將過濾帶靠近染料帶連接。然后將塑料板切成多個(gè)長(zhǎng)60mm寬4mm的條帶,使得每一條帶都包含線性排列的硝化纖維膜、染料帶和過濾帶。
[0232]測(cè)定方法和結(jié)果:
[0233]當(dāng)將70微升樣品添加到過濾帶時(shí),在孵育之后可檢測(cè)信號(hào)開始出現(xiàn)在測(cè)定標(biāo)記區(qū)。
[0234]實(shí)施例6:利用每一方法制備的條帶的靈敏度比較
[0235]檢測(cè)在實(shí)施例4中制備的條帶和在實(shí)施例5中制備的條帶,以便比較其靈敏度。實(shí)施例4中制備的條帶顯示出1.5mIU/ml的靈敏度,而實(shí)施例5中制備的條帶顯示出15mIU/ml的靈敏度。使用銪納米粒子制備的條帶顯示出比使用膠體金制備的條帶高大約10倍的靈敏度。
[0236]實(shí)施例7:利用銪螯合納米粒子制備登革熱病毒檢測(cè)條帶
[0237]制備低聚核苷酸被覆蓋的納米粒子
[0238]利用10mmol/L的N_(3_ 二甲氨基丙基)_N’_乙基碳二亞胺和100mmol/L的N-羥基硫代丁二酰亞胺將銪螯合納米粒子的羧基活化30分鐘。利用pH為6.1的50mMMES緩沖液沖洗被活化的粒子一次。加入20mM/L的具有載體諸如牛血清白蛋白的低聚核苷酸。孵育2小時(shí)之后,用pH為6.1的50mM MES緩沖液沖洗低聚核苷酸被覆蓋的粒子三次。
[0239]制備染料帶
[0240]通過將含有低聚核苷酸被覆蓋的粒子、0.2%的吐溫-20、0.25%的牛血清白蛋白、
0.5%的蔗糖、1mM pH為7.5的磷酸鈉溶液注入到測(cè)定為8mmX 305mm的玻璃纖維過濾器的矩形片中,并在冷凍干燥機(jī)中的恒定真空下干燥。將該染料帶在干燥器中存儲(chǔ)并保持干燥直至使用。
[0241]制備過濾帶
[0242]利用0.05%的吐溫-20、2%的蔗糖、I %的BSA和10mM pH為7.4的磷酸鈉溶液處理玻璃纖維過濾器,然后在室溫下風(fēng)干。
[0243]將低聚核苷酸固定在膜上
[0244]將雙面透明膠帶(尺寸為305mmX25mm)貼到距離薄塑料板(305mmX60mm)的底端20mm的位置。將硝化纖維膜切成305mmX 25mm大小并直接貼到雙面膠帶的頂端。通過噴射30微升pH為7.5在1mM PBS中的lmg/ml低聚核苷酸-BSA結(jié)合物的溶液將用于對(duì)登革熱病毒特異性的低聚核苷酸的經(jīng)固定的檢測(cè)線的測(cè)定標(biāo)記區(qū)限定在距離膜底端9_的位置。噴射之后,將該膜在室溫下干燥約12小時(shí)。底部和芯吸膜被儲(chǔ)存在干燥器中直到進(jìn)一步處理。
[0245]條帶結(jié)構(gòu)
[0246]將染料帶連接到硝化纖維膜的底端正下方的塑料底部,而將過濾帶靠近染料帶連接。然后將塑料板切成多個(gè)長(zhǎng)60mm寬4mm的條帶,使得每一條帶都包含線性排列的硝化纖維膜、染料帶和過濾帶。
[0247]測(cè)定方法和結(jié)果:
[0248]當(dāng)將70微升樣品添加到過濾帶時(shí),當(dāng)將條帶暴露于UV光時(shí),在孵育之后可檢測(cè)信號(hào)開始出現(xiàn)在測(cè)定標(biāo)記區(qū)。
[0249]實(shí)施例8:利用具有聚合酶鏈反應(yīng)的銪螯合納米粒子制備登革熱病毒檢測(cè)條帶
[0250]制備鏈霉抗生物素被覆蓋的納米粒子
[0251]利用10mmol/L的N-(3_ 二甲氨基丙基)-N’ -乙基碳二亞胺和100mmol/L的N-羥基硫代丁二酰亞胺將銪螯合納米粒子的羧基活化30分鐘。利用pH為6.1的50mMMES緩沖液沖洗被活化的粒子一次。加入20mM/L的鏈霉抗生物素。孵育2小時(shí)之后,用pH為6.1的50mM MES緩沖液沖洗鏈霉抗生物素被覆蓋的粒子三次。
[0252]制備染料帶
[0253]通過將含有鏈霉抗生物素被覆蓋的粒子、0.2%的吐溫-20、0.25%的牛血清白蛋白、0.5%的蔗糖、1mM pH為7.5的磷酸鈉溶液注入到測(cè)定為8mmX 305mm的玻璃纖維過濾器的矩形片中,并在冷凍干燥機(jī)中的恒定真空下干燥。將該染料帶在干燥器中存儲(chǔ)并保持干燥直至使用。
[0254]制備過濾帶
[0255]利用0.05%的吐溫-20、2%的蔗糖、I %的BSA和10mM pH為7.4的磷酸鈉溶液處理玻璃纖維過濾器,然后在室溫下風(fēng)干。
[0256]將抗-半抗原的抗體固定在膜上
[0257]將雙面透明膠帶(尺寸為305mmX25mm)貼到距離薄塑料板(305mmX60mm)的底端20mm的位置。將硝化纖維膜切成305mmX25mm大小并直接貼到雙面膠帶的頂端。通過噴射30微升pH為7.5在1mM PBS中的lmg/ml鏈霉抗生物素低聚核苷酸-BSA共軛結(jié)合物的溶液將用于抗-半抗原的抗體的經(jīng)固定的檢測(cè)線的測(cè)定標(biāo)記區(qū)限定在距離膜底端9_的位置。噴射之后,將該膜在室溫下干燥約12小時(shí)。底部和芯吸膜被儲(chǔ)存在干燥器中直到進(jìn)一步處理。
[0258]條帶結(jié)構(gòu)
[0259]將染料帶連接到硝化纖維膜的底端正下方的塑料底部,而將過濾帶靠近染料帶連接。然后將塑料板切成多個(gè)長(zhǎng)60mm寬4mm的條帶,使得每一條帶都包含線性排列的硝化纖維膜、染料帶和過濾帶。
[0260]測(cè)定方法和結(jié)果:
[0261]當(dāng)將2微升樣品和70微升顯影(develop)液添加到過濾帶時(shí),當(dāng)將該條帶暴露于UV光時(shí),在孵育之后可檢測(cè)信號(hào)開始出現(xiàn)在測(cè)定標(biāo)記區(qū)。
[0262]在本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)全部結(jié)合于此作為參考。
[0263]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到,或者僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確認(rèn)在本文中所特定描述的本發(fā)明的特定具體實(shí)施例的多種等價(jià)物。
【權(quán)利要求】
1.一種橫流式測(cè)定格式分析物檢測(cè)裝置,所述裝置包括 至少一個(gè)第一過濾元件,包括至少一個(gè)儲(chǔ)存區(qū)(1),與 至少一個(gè)第二過濾元件(11)接觸,所述第二過濾元件連接至 芯吸膜(6),其中用包括銪(III)螯合物的粒子共價(jià)標(biāo)記的對(duì)分析物特異性連接配偶體被注入在所述儲(chǔ)存區(qū)(I)上,每個(gè)粒子具有約30,0000-1, 000, 000個(gè)銪(III)原子;俘獲所述分析物/特異性連接配偶體復(fù)合物的至少一種特異性連接配偶體固定在所述芯吸膜(6)上; 其特征在于所述第二過濾元件插入到所述第一過濾元件和所述芯吸膜(6)之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置,其中,所述裝置分析的所述分析物選自由抗原、抗體、核酸和半抗原組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置,其中,所述特異性連接配偶體選自由抗原、抗體、核酸、生物素或生物素類似物、鏈霉抗生物素、抗生物素蛋白和半抗原組成的組。
4.一種用根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的裝置確定樣品中存在分析物的方法,所述方法包括: 以橫流式測(cè)定格式將一定量的樣品施加于至少一個(gè)儲(chǔ)存區(qū)(I),其中,所述樣品遷移到發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的所述芯吸膜(6),其中信號(hào)的存在表示在所述樣品中存在所述分析物,并且其中用包括銪(III)螯合物的粒子共價(jià)標(biāo)記的特異性連接配偶體被注入在所述儲(chǔ)存區(qū)(I)上,每個(gè)粒子具有約30,0000-1, 000, 000個(gè)銪(III)原子;至少一種特異性連接配偶體固定在所述芯吸膜上(6)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中,所述樣品選自由血液、血清、血漿、尿、唾液、汗和來自生物樣品或環(huán)境樣品的處理過的液體介質(zhì)組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中,可檢測(cè)到所述樣品中的多種類型的分析物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中,所述分析物對(duì)病原體是特異性的。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK104076143SQ201410251375
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2003年5月2日
【發(fā)明者】崔永鎬, 鄭宰安 申請(qǐng)人:安克塞斯生物公司