碳酸鑭分離富集核酸的方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及碳酸鑭的用途，具體涉及碳酸鑭分離富集核酸的方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，生物科學(xué)的研究成果得到了廣泛應(yīng)用，作為生 物體遺傳信息的攜帶者，核酸（包括DNA和RNA)及其分析在后基因組時(shí)代相關(guān)的生命分析 化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)診斷、疾病預(yù)防、法醫(yī)檢驗(yàn)等應(yīng)用中具有重要意義，核酸的純度是保證這些 分析順利進(jìn)行的前提和基礎(chǔ)；在實(shí)際應(yīng)用中，核酸往往是從活的生物體或組織樣本中提取 而來，多種機(jī)體組分如蛋白質(zhì)、脂類、糖類等的存在會(huì)對(duì)核酸的分析產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此從 復(fù)雜的樣品中獲得較高純度的核酸是進(jìn)行后續(xù)分析操作的前提條件；
[0003] 核酸的分離主要分為粗分離和精分離兩個(gè)階段，粗分離是指將核酸與其它非核酸 組分（如蛋白質(zhì)、脂類、糖類等）分離，精分離是指將粗分離得到的核酸樣品根據(jù)不同分子 量、電荷或構(gòu)型進(jìn)行分離，從而得到分子量在特定范圍或特定構(gòu)型的DNA或RNA片段；
[0004] 核酸粗分離是核酸精分離的基礎(chǔ)和前提，現(xiàn)有的核酸粗分離方法主要包括酚抽提 法、玻棒纏繞法、甲酰胺解聚法、柱色譜法和固定相吸附法等等，其中固定相吸附法通過特 定的固定相材料與核酸進(jìn)行選擇性結(jié)合，進(jìn)而將核酸與其它非核酸組分分離，具有操作簡 便快速、分離效率高、對(duì)核酸結(jié)構(gòu)破壞性小、適于批量操作等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)有技術(shù)中的固定相材 料主要包括玻璃粉、玻璃珠、磁珠及表面修飾的磁珠等等，而固定相吸附法由于固定相材料 成本高且回收操作復(fù)雜而難以廣泛應(yīng)用；
[0005] 核酸的富集包括將核酸從濃度較低的核酸溶液中提取出來，或?qū)⒑怂釓囊环N溶液 體系中轉(zhuǎn)移至另一種不同的溶液體系中，現(xiàn)有技術(shù)中常采用玻棒纏繞法對(duì)核酸進(jìn)行富集， 但此方法僅適用于濃度較高的核酸溶液，對(duì)核酸稀溶液中核酸的富集效率較差，而實(shí)際生 產(chǎn)或研究的過程中提取出的核酸往往為稀溶液，采用常規(guī)方法難以有效富集其中的核酸成 分，因此，亟需開發(fā)一種適用于核酸稀溶液中核酸富集的方法。
[0006] 碳酸鑭可用于治療高磷酸鹽血癥，其原理是碳酸鑭可與磷酸鹽結(jié)合，生成磷酸鑭 復(fù)合物，從而降低體內(nèi)血清磷酸鹽水平；
[0007]發(fā)明人據(jù)此推測(cè)碳酸鑭與核酸基本組成單位中的磷酸基團(tuán)具有親和性，可能選擇 性結(jié)合核酸，從而作為固定相材料對(duì)核酸進(jìn)行分離富集；
[0008] 基于上述推測(cè)和現(xiàn)有問題的存在，本發(fā)明人對(duì)碳酸鑭分離富集核酸進(jìn)行研究，以 便研究出碳酸鑭分離富集核酸的方法及用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服上述問題，本發(fā)明人對(duì)碳酸鑭與核酸的相互作用進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)：在合適的緩沖溶液中，碳酸鑭可以憑借其表面所帶的正電荷與核酸中帶負(fù)電荷的磷 酸基團(tuán)通過靜電力結(jié)合，生成難溶的碳酸鑭-核酸復(fù)合物；難溶的碳酸鑭-核酸復(fù)合物可用 氨羧配合劑進(jìn)行洗脫，使得核酸脫離碳酸鑭的結(jié)合，重新溶解到緩沖溶液中，離心除去不溶 的碳酸鑭后，即可得到純度較高的核酸溶液；洗脫后的碳酸鑭用少量稀酸進(jìn)行淋洗后可重 復(fù)使用，其與核酸的結(jié)合能力不受影響；此外，可將碳酸鑭制成粒徑更小的納米顆粒，以增 大其比表面積，提高碳酸鑭對(duì)核酸的結(jié)合能力。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供以下方面：
[0011] (1)使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，該方法包括：
[0012] 步驟1)，將碳酸鑭固體高速剪切處理，制備成碳酸鑭納米顆粒；
[0013] 步驟2)，將待分離富集的核酸樣品溶于緩沖溶液一中，加入步驟1)中所述碳酸鑭 納米顆粒，攪拌〇. 2~2. 5小時(shí)，優(yōu)選0. 3~1. 8小時(shí)，最優(yōu)選0. 3~1. 5小時(shí)，離心分離， 得到固相部分一，所述固相部分一為碳酸鑭納米顆粒-核酸復(fù)合物；
[0014] 步驟3)，將步驟2)中所述固相部分一用蒸餾水清洗后加入到緩沖溶液二中，攪拌 0. 1~1. 5小時(shí)，優(yōu)選0. 2~I. 0小時(shí)，最優(yōu)選0. 2~0. 5小時(shí)，離心分離，得到上清液和固 相部分二，所述上清液為分離富集后的核酸溶液；
[0015] 步驟4)，將步驟3)中所述固相部分二使用稀酸進(jìn)行淋洗，蒸餾水清洗至中性，離 心分離，得到固相部分三，所述固相部分三為回收的碳酸鑭納米顆粒。
[0016] (2)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 1)中所述碳酸鑭為La2(CO3)3 ?xH20,其中X值為0~8。
[0017] (3)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 1) 中所述碳酸鑭納米顆粒的粒徑為100~500nm。
[0018] (4)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 2) 中所述核酸包括DNA和RNA。
[0019] (5)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 2) 中所述緩沖溶液一的pH值為5. 5~9. 0,優(yōu)選為5. 5~6. 5,最優(yōu)選為5. 5~6. 0。
[0020] (6)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 3) 中所述緩沖溶液二為氨羧配合劑或磷酸鹽緩緩沖溶液，優(yōu)選為磷酸鈉、磷酸一氫鈉、磷酸 二氫鈉、磷酸鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、EDTA或EGTA緩沖溶液，最優(yōu)選為磷酸二氫鈉、磷 酸二氫鉀或H)TA緩沖溶液；所述緩沖溶液二的pH值為5. 5~9. 0,優(yōu)選為7. 0~9. 0,最優(yōu) 選為8. 0~8. 5。
[0021] (7)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 4) 中所述稀酸優(yōu)選使用乙酸、稀鹽酸、稀硝酸、稀高氯酸，最優(yōu)選使用稀鹽酸、稀硝酸、稀高 氯酸。
[0022] (8)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步驟 4)中所述稀酸的pH值為0~3,優(yōu)選為0. 2~2. 5,最優(yōu)選為0. 3~2. 0。
[0023] (9)根據(jù)上述（1)所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法，其特征在于，步 驟2)、步驟3)和步驟4)中所述離心分離的轉(zhuǎn)速為15000~25000r/min，優(yōu)選為17000~ 23000r/min，最優(yōu)選為 18000 ~22000r/min。
[0024] (10)碳酸鑭在核酸分離富集中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用采用如上述權(quán)利要求 1至9所述的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法。
[0025] 本發(fā)明所具有的有益效果包括：
[0026] (1)本發(fā)明提供的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法采用碳酸鑭作為固定相材 料，對(duì)核酸進(jìn)行分離富集，碳酸鑭制備簡便，價(jià)格便宜，降低了核酸分離富集的成本；
[0027] (2)本發(fā)明提供的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法僅需使用少量溫和無毒的 緩沖溶液和有機(jī)酸堿，對(duì)使用者損害小且對(duì)環(huán)境友好；
[0028] (3)本發(fā)明提供的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法將碳酸鑭固體粉末進(jìn)行高 速剪切處理，制備成粒徑更小的納米顆粒，增加了比表面積，從而提高碳酸鑭對(duì)核酸的結(jié)合 率，提高分離富集效果；
[0029] (4)本發(fā)明提供的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法優(yōu)選采用乙二胺四乙酸 (EDTA)緩沖溶液作為洗脫劑，使核酸脫離碳酸鑭的結(jié)合并重新溶解核酸，所述EDTA緩沖溶 液為常用的核酸保存液，無需再對(duì)分離富集后的核酸進(jìn)行二次分離，從而簡化了操作步驟， 便于應(yīng)用實(shí)施；
[0030] (5)本發(fā)明提供的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法將使用過的碳酸鑭用少量 稀酸進(jìn)行淋洗，即可重復(fù)使用，回收的碳酸鑭對(duì)核酸的結(jié)合能力不受影響，從而進(jìn)一步降低 了使用成本；
[0031] (6)本發(fā)明提供的使用碳酸鑭進(jìn)行核酸分離富集的方法具有操作簡便、快速有效、 成本低等特點(diǎn)，適用于傳統(tǒng)方法不適用的核酸的大規(guī)模批量分離富集和稀溶液中核酸的分 離富集，有利于實(shí)現(xiàn)核酸分離富集的自動(dòng)化和機(jī)械化；
[0032] (7)本發(fā)明提供的碳酸鑭在核酸分離富集中的應(yīng)用，開辟了碳酸鑭的新用途，為碳 酸鑭在其它領(lǐng)域的理論及實(shí)際應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0033] 圖1示出八水合碳酸鑭固體粉末的XRD圖譜；
[0034] 圖2示出八水合碳酸鑭納米顆粒的XRD的圖譜；
[0035] 圖3示出八水合碳