專利名稱：使用a蛋白親和層析分離和純化抗體的制作方法
使用A蛋白親和層析分離和純化抗體與相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求于2008年10月20日提交的美國臨時申請系列號61/196，753的利益，其在此整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
用于通過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物級別單克隆抗體的純化方法一般涉及4個基本步驟。這些步驟包括(1)收獲/澄清-宿主細胞與發(fā)酵培養(yǎng)物分離；(2)捕獲-抗體與澄清的收獲物中的大多數(shù)組分分離；(3)精細純化-去除殘留的宿主細胞污染物和聚集體；和(4)配制-將抗體置于合適載體內(nèi)用于最大限度的穩(wěn)定性和保存期限。然而，這些步驟經(jīng)常不必定導(dǎo)致用于在藥學(xué)背景中使用的足夠純度的抗體組合物。目前需要生產(chǎn)且純化適合于藥學(xué)用途的足夠純形式的目的抗體的方法。本發(fā)明解決了這個需要。發(fā)明簡述
本發(fā)明涉及用于從樣品基質(zhì)分離且純化抗體的方法。在特定方面，本發(fā)明涉及采用親和層析優(yōu)選A蛋白層析的抗體純化方法。在具體方面，本文方法采用酸滅活步驟、親和層析步驟、和一個或多個另外的層析和/或過濾步驟。層析步驟可以包括一個或多個離子交換層析和/或疏水作用層析步驟。進一步地，本發(fā)明涉及包括通過本文描述的方法純化的一種或多種抗體的藥物組合物。本發(fā)明的一個實施方案涉及從樣品基質(zhì)純化抗體或其抗原結(jié)合部分，從而使得所得到的抗體組合物基本上不含宿主細胞蛋白質(zhì)(“HCPs”)的方法。在一個方面，樣品基質(zhì)(或簡單地“樣品”)包括細胞系收獲物，其中所述細胞系用于產(chǎn)生本發(fā)明的特定抗體。在具體方面，樣品基質(zhì)由用于產(chǎn)生抗IL-12抗體的細胞系制備；在另一個方面，樣品基質(zhì)由用于產(chǎn)生抗TNFa抗體的細胞系制備；并且在另一個方面，樣品基質(zhì)由用于產(chǎn)生抗IL-18抗體的細胞系制備。本發(fā)明的一種方法涉及對包括推定的目的抗體或其抗原結(jié)合部分的樣品基質(zhì)實施PH調(diào)整。在一個方面，將pH調(diào)整至酸性pH。合適pH的例子是約pH 3 - 5，優(yōu)選pH約 3.5。這個初步回收部分為減少或滅活pH敏感性病毒而執(zhí)行。除減少和/或滅活病毒外， 酸性條件還促進細胞和細胞碎片的去除，從而形成初步回收樣品。在合適的時間段后，PH可以朝向更中性或堿性的PH調(diào)整，并且對初步回收樣品實施親和層析，優(yōu)選A蛋白層析。在一個方面，收集親和層析樣品，并且進一步實施后續(xù)層析步驟，例如離子交換和疏水作用層析。在一個實施方案中，親和層析步驟包括使初步回收樣品經(jīng)歷包括合適親和層析支持體的柱的處理。此種層析支持體的非限制性例子包括但不限于A蛋白樹脂、G蛋白樹脂、 包括針對其產(chǎn)生目的抗體的抗原的親和支持體、和包含F(xiàn)c結(jié)合蛋白的親和支持體。A蛋白樹脂用于抗體(IgG)的親和純化和分離。在一個方面，在樣品裝載前，A蛋白柱用合適緩沖液進行平衡。合適緩沖液的例子是^^8/妝(1緩沖液，？!1約7.2。在這個平衡后，可以將樣品裝載到柱上。在柱裝載后，柱可以使用例如平衡緩沖液洗滌一次或多次?？梢栽谙疵撝笆褂闷渌礈欤ú捎貌煌彌_液的洗滌。A蛋白柱隨后可以使用合適的洗脫緩沖液進行洗脫。合適洗脫緩沖液的例子是乙酸/NaCl緩沖液，？!1約3.5。洗脫物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)進行監(jiān)控。例如，可以注意在OD28tl的吸光度。隨后可以制備一種或多種目的洗脫的級分用于進一步加工。在一個實施方案中，離子交換步驟跟隨A蛋白親和層析。這個離子交換步驟可以是陽離子或陰離子交換或兩者的組合。這個步驟可以是單個離子交換程序，或可以包括多個離子交換步驟，例如陽離子交換步驟隨后為陰離子交換步驟，或反之亦然。在一個方面， 離子交換步驟是單步驟程序。在另一個方面，離子交換步驟涉及兩步驟離子交換過程。合適的陽離子交換柱是其固定相包括陰離子基團的柱。此種柱的例子是Fractogel S03_。 這個離子交換捕獲層析步驟促進從樣品分離抗體。合適的陰離子交換柱是其固定相包括陽離子基團的柱。此種柱的例子是Q kpharose 柱。一個或多個離子交換步驟通過減少雜質(zhì)進一步分離抗體，所述雜質(zhì)例如宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA以及在可應(yīng)用時的親和基質(zhì)蛋白質(zhì)。這個陰離子交換程序是層析的流通(flow through)模式，其中目的抗體不與陰離子交換樹脂(或固相)相互作用或結(jié)合。然而，許多雜質(zhì)的確與陰離子交換樹脂相互作用且結(jié)合。 在具體方面，離子交換步驟是陰離子交換層析。通過調(diào)整樣品緩沖液的pH和離子強度制備親和層析洗脫物用于離子交換。例如， 親和洗脫物可以在1 M Tris緩沖液中調(diào)整至約6.0 -約8.5的pH。在將樣品(親和洗脫物)裝載到離子交換柱上之前，柱可以使用合適緩沖液進行平衡。合適緩沖液的例子是具有約6.0 -約8的pH的Tris/NaCl緩沖液。在平衡后，柱可以裝載親和洗脫物。在裝載后，柱可以用合適緩沖液洗滌一次或多次。合適緩沖液的例子是平衡緩沖液自身。流通物 (flow-through)收集可以例如在吸光度(ODaxi)升高超過約0. 2 AU時開始。在特定實施方案中，本文方法采用進一步的步驟。這個步驟涉及疏水作用層析(“HIC”)的使用。合適的柱是其固定相包括疏水基團的那種。此種柱的例子是苯基 kpharose 柱?？赡艿氖悄康目贵w在分離/純化過程期間已形成聚集體。這個疏水層析步驟促進這些聚集的消除。它還幫助去除雜質(zhì)。該程序使用高鹽緩沖液，其促進抗體(或其聚集)與疏水柱的相互作用。柱使用較低濃度的鹽進行洗脫。在另一個實施方案中，HIC洗脫物使用病毒去除濾器例如Ultipor DV20 濾器進行過濾。這個程序使病毒顆粒與苯基洗脫物分離，以使病毒(如果存在的話)量減少至安全水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的濾器可以在這個實施方案中使用。在所得到的樣品產(chǎn)物中目的抗體的純度可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進行分析，例如尺寸排阻層析、Poros A HPLC測定、HCP ELISA、A蛋白ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析。在另外一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括分離的抗體或其抗原結(jié)合部分和可接受載體的一種或多種藥物組合物。在另一個方面，組合物進一步包括一種或多種藥物試劑。附圖簡述


圖1公開了抗IL-12抗體(ABT-847)的非限制性例子的重和輕鏈可變區(qū)序列。圖2公開了抗IL-18抗體(ABT-325)的非限制性例子的重和輕鏈序列。圖3公開了抗TNFa抗體(阿達木單抗(Adalimumab))的非限制性例子的重和輕鏈可變區(qū)序列。
圖4描述了來自300 L生物反應(yīng)器的代表性層析譜，顯示在Mabklect A蛋白層析用于捕獲抗IL-12抗體且減少產(chǎn)物和過程相關(guān)的雜質(zhì)后的產(chǎn)物純度，所述雜質(zhì)例如單和雙輕鏈片段、CHO宿主細胞蛋白質(zhì)(HCPs)和DNA等。圖5描述了 Mabklect 洗滌條件的評價。圖6是在Mabklect 洗脫物調(diào)整至pH 8和導(dǎo)電性7mS/cm后獲得的沉淀的聚丙烯酰胺凝膠照片。圖7描述了 300 L生物反應(yīng)器規(guī)模Q Sepharose FF層析柱的代表性流通洗滌曲線圖。圖8描述了 300 L生物反應(yīng)器規(guī)模Wienyl Sepharose HP層析柱的代表性洗脫曲線圖。圖9描述了其中關(guān)于Mabklect 樹脂的10%突破點鑒定為在37. 4 g抗體/L樹脂的動態(tài)結(jié)合容量測定結(jié)果。圖10是為了比較A蛋白過程和AY-04過程之間的中間物差異進行的聚丙烯酰胺凝膠照片。裝載2yg每種樣品的抗體。圖11描述了 Mabklect 阿達木單抗回收得率與洗脫pH比較。該圖證實對于2. 5 -3.8的洗脫pH范圍獲得至少90%的得率，并且在pH 4發(fā)生得率中的顯著減少。圖12描述了比較阿達木單抗單體回收與洗脫pH和溫育時間比較的測定結(jié)果。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于從樣品基質(zhì)分離且純化抗體的方法。本發(fā)明的一個方面涉及在抗體純化的各個步驟中生成的樣品的病毒減少/滅活。在具體方面，本文的方法采用酸病毒減少 /滅活步驟，隨后為一個或多個層析步驟。層析步驟可以包括一個或多個下述層析程序離子交換層析、親和層析和疏水作用層析。進一步地，本發(fā)明涉及包括通過本文描述的方法純化的一種或多種抗體的藥物組合物。為了清楚起見且非限制性地，這個詳述分成下述亞部分
1.定義；
2.抗體生成；
3.抗體生產(chǎn)；
4.抗體純化；
5.測定樣品純度的方法；
6.進一步修飾；
7.藥物組合物；和
8.抗體用途。1.定義
為了本發(fā)明可以更容易理解，首先定義了特定術(shù)語。術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白分子，其包含通過二硫鍵互連的4條多肽鏈一一 2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。重鏈恒定區(qū)包括3個結(jié)構(gòu)域一一 CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個結(jié)構(gòu)域一一 CL。VH和VL區(qū)可以進一步再分成稱為互補性決定區(qū)(CDRs)的高變區(qū)，由稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域點綴。每個VH和VL由3個CDRs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或“抗體部分”)包括抗體的片段，其保留與抗原 (例如，hIL-12、hTNFa或hIL_18)特異性結(jié)合的能力。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長抗體的片段執(zhí)行。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段例子包括(i) Fab片段，包括VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域的單價片段；(ii) F (ab' ) 2片段，包括在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)包括VH和CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iv) 包括抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段，(ν)包括VH結(jié)構(gòu)域的dAb片段(Ward等人， (1989) Nature 341:544 546，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)；和(vi )分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組法通過合成接頭進行連接，所述合成接頭使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL 和VH區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv);參見例如，Bird等人(1988) kience 242:423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。此種單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。 還包含其他形式的單鏈抗體，例如雙抗體。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達，但使用太短而不允許相同鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭， 從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并且產(chǎn)生2個抗原結(jié)合部位(參見例如， !1011士861~，卩.，等人(1993)卩1~0(；. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ；Poljak, R. J.， 等人(1994) Mructure 2:1121-1123，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。再進一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是通過抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價結(jié)合形成的較大免疫粘附分子的部分。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)，以制備四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)，以及使用半胱氨酸殘基、標記肽和C末端多組氨酸標簽，以制備二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人 (1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。抗體部分例如Fab 和F (ab' )2片段可以使用常規(guī)技術(shù)由完整抗體制備，例如完整抗體分別地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可以使用標準重組DNA技術(shù)獲得，如本文描述的。在一個方面，抗原結(jié)合部分是完整結(jié)構(gòu)域或完整結(jié)構(gòu)域?qū)ΑＨ绫疚氖褂玫模陶Z“人白細胞介素12”(本文縮寫為hIL-12或IL-12)包括主要由巨噬細胞和樹突細胞分泌的人細胞因子。該術(shù)語包括包含35 kD亞基(p35)和40 kD 亞基(P40)的異二聚體蛋白質(zhì)，其通過二硫鍵連接在一起。異二聚體蛋白質(zhì)被稱為“p70 亞基”。人IL-12的結(jié)構(gòu)在例如下述中進一步描述Kobayashi，等人(1989) J. Exp Med. 170:827-845 ;Seder，等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ;Ling，等人(1995) J. Exp Med. 154:116-127 ;Podlaski，等人(1992) Arch. Biochem. Biophys. 四4:230-237，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考。編碼IL-12的核酸可作為GenBank登記號 NM_000882獲得，并且多肽序列可作為GenBank登記號NP_000873. 2獲得。術(shù)語人IL-12意欲包括重組人IL-12 (rh IL-12)，其可以通過標準重組表達方法進行制備。如本文使用的，短語“人白細胞介素18”(本文縮寫為hIL-18或IL-18)包括最初作為無生物學(xué)活性的193氨基酸前體蛋白質(zhì)合成的人細胞因子，以及例如但不限于通過例
7如胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-4切割前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生的156氨基酸成熟蛋白質(zhì)，其顯示包括T細胞增殖的共刺激、NK細胞細胞毒性的增強、通過T細胞和NK細胞的IFN- γ生產(chǎn)的誘導(dǎo)、和T輔助1型(Thl)分化的加強的生物學(xué)活性。編碼IL-18的核酸可作為GenBank登記號NM_001562獲得，并且多肽序列可作為GenBank登記號NP_001553獲得。術(shù)語人IL-18 意欲包括重組人IL-18 (rh IL-18)，其可以通過標準重組表達方法進行制備。短語“人腫瘤壞死因子-α ”(本文縮寫為hTNF α或TNF α )是占優(yōu)勢地由單核細胞/巨噬細胞分泌的多功能促炎細胞因子，其對脂質(zhì)代謝、凝固、胰島素耐受性和內(nèi)皮功能有作用。TNFa是17 kD蛋白質(zhì)亞基的可溶性同三聚體。還存在膜結(jié)合的沈kD前體形式的TNFa。它在組織中的滑膜細胞和巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)。除單核細胞或巨噬細胞外的細胞也產(chǎn)生TNFa。例如，人非單核細胞腫瘤細胞系產(chǎn)生TNF α以及⑶4+和⑶8+外周血T淋巴細胞，并且一些培養(yǎng)的T和B細胞系產(chǎn)生TNFa。編碼TNFa的核酸可作為GenBank登記號X(^910獲得，并且多肽序列可作為GenBank登記號CAA26669獲得。術(shù)語人TNF α意欲包括重組人TNF a (rh TNF a )，其可以通過標準重組表達方法進行制備。術(shù)語“Kabat編號”、“ Kabat定義”和“Kabat標記”在本文中可互換使用。本領(lǐng)域公認的這些術(shù)語指編號氨基酸殘基的系統(tǒng)，所述氨基酸殘基比抗體或其抗原結(jié)合部分的重和輕鏈可變區(qū)中的其他氨基酸殘基更可變(即高變XKabat等人(1971 )Arm. NY Acad, Sci. 190:382-391 禾口 Kabat，Ε· A.，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242, 其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。對于重鏈可變區(qū)，高變區(qū)范圍為關(guān)于CDRl的氨基酸位置 31 - 35、關(guān)于⑶R2的氨基酸位置50 - 65、和關(guān)于⑶R3的氨基酸位置95 - 102。對于輕鏈可變區(qū)，高變區(qū)范圍為關(guān)于⑶Rl的氨基酸位置M - 34、關(guān)于⑶R2的氨基酸位置50 - 56、 和關(guān)于⑶R3的氨基酸位置89 - 97。術(shù)語“人抗體”包括具有與人種系免疫球蛋白序列對應(yīng)的可變和恒定區(qū)的抗體，如 ^ Kabat ^AffiiiW Kabat, ^A (1991 )Sequences of proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH
發(fā)明者佩里利-帕爾默 B., L. 維德 C., 萬 M., 黃 Q., K. ?？寺?R., T. 恩尼斯 S. 申請人:雅培制藥有限公司