專利名稱：與il-18結合的抗體及其純化方法
與IL-18結合的抗體及其純化方法與相關申請的交叉參考
本申請要求于2008年10月20日提交的美國臨時申請系列號61/196，751的利益，其在此整體引入作為參考。
背景技術：
人白細胞介素-18是作為無生物學活性的193氨基酸前體蛋白質(zhì)合成的鑒定的細胞因子。前體蛋白質(zhì)例如通過胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-4的切割釋放顯示生物學活性的156 氨基酸成熟蛋白質(zhì)，所述生物學活性包括T細胞增殖的共刺激、NK細胞細胞毒性的增強、通過T細胞和NK細胞的IFN-γ生產(chǎn)的誘導、和T輔助1型(Thl)分化的加強。此外，IL-18是人單核細胞促炎介質(zhì)的有效誘導物，所述促炎介質(zhì)包括IL-8、腫瘤壞死因子- a (TNF-α ) 和前列腺素E2 (PGE2)0IL-18通過增強在Th 1細胞上的Fas配體的功能活性在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中起潛在作用。IL-18還在腎上腺皮質(zhì)中表達，并且因此可以是分泌的神經(jīng)免疫調(diào)諧劑 (neuro-immunomodulator)，在應激經(jīng)歷后協(xié)調(diào)(orchestrating)免疫系統(tǒng)中起重要作用。產(chǎn)生促炎細胞因子例如IFN-γ、IL-2和TNF-β的Thl細胞已牽涉于介導許多自身免疫疾病，包括多發(fā)性硬化(MS)、類風濕性關節(jié)炎(RA)、1型或胰島素依賴性糖尿病 (IDDM)、炎性腸病(IBD)和牛皮癬。因此，THl促進性細胞因子例如IL-18的拮抗作用將預期抑制疾病發(fā)展。11-18特異性mAbs可以用作拮抗劑。在體內(nèi)，IL-18通過pro-IL-18的切割形成，并且它的內(nèi)源活性看起來解釋瘡皰丙酸桿菌0°. ac/ ^)中的IFN- γ生產(chǎn)和LPS介導的致死率。阻斷人疾病中的IL-18生物學活性是許多疾病中的治療策略。這可以使用可溶性受體或針對細胞結合的IL-18受體的封閉抗體來實現(xiàn)。細胞因子結合蛋白質(zhì)(可溶性細胞因子受體)對應于其各自細胞表面細胞因子受體的細胞外配體結合結構域。它們通過細胞表面受體共同的前信使RNA的可變剪接得到， 或通過細胞表面受體的蛋白酶剪切得到。此種可溶性受體已在過去得到描述，尤其包括 IL-6和IFN- γ的可溶性受體。命名為護骨蛋白(0PG，也稱為破骨細胞抑制因子一0CIF)的一種細胞因子結合蛋白，TNFR/Fas家族的成員，看起來是僅作為分泌的蛋白存在的可溶性受體的首個例子。已暗示IL-18與慢性炎性疾病中致病性的進展有關，包括內(nèi)毒素休克、肝炎和自身免疫性糖尿病?；谠谛∈竽Ｐ椭性谥嗵钦T導的急性肝損傷中顯示升高水平的IL-18 的實驗假定IL-18在肝損傷發(fā)展中的可能作用。然而，多功能因子IL-18在肝損傷發(fā)展中的機制迄今為止仍未得到闡明。近期研究指出IL-18在關節(jié)代謝中起促炎作用。研究者顯示IL-18由關節(jié)軟骨細胞產(chǎn)生，并且誘導促炎和分解代謝應答。IL-18 mRNA由軟骨細胞中的IL-I β誘導。軟骨細胞產(chǎn)生IL-18前體，并且響應IL-I刺激，分泌成熟形式的IL-18。關于IL-18對軟骨細胞作用的研究進一步顯示它抑制TGF-β誘導的增殖且增強氧化氮生產(chǎn)。IL-18刺激幾種基因在正常人關節(jié)軟骨細胞中的表達，包括誘導型氧化氮合酶、誘導型環(huán)加氧酶、IL-6和溶基質(zhì)蛋白酶?；虮磉_與相應蛋白質(zhì)的合成相關。用IL-18處理正常人關節(jié)軟骨增加糖胺聚糖的釋放。這些發(fā)現(xiàn)將IL-18鑒定為調(diào)節(jié)軟骨細胞應答且促成軟骨降解的細胞因子。已暗示IL-18在類風濕性關節(jié)炎中起促炎作用。IL-18水平已顯示在類風濕性關節(jié)炎患者的滑液中顯著升高。研究者已在類風濕性關節(jié)炎滑膜組織(synovial tissue)內(nèi)檢測到比骨關節(jié)炎對照中顯著更高水平的IL-18 mAb和蛋白質(zhì)。還顯示IL-12或IL-15與 IL-18的組合在體外誘導通過滑膜組織的IFN-Y生產(chǎn)。此外，膠原/不完全弗氏佐劑免疫接種的小鼠的IL-18施用促進侵蝕性、炎性關節(jié)炎的發(fā)展，從而暗示IL-18在體內(nèi)可能是促炎的。IL-18在其他自身免疫疾病的發(fā)展中的作用已得到證實。因此，已證實IL-18表達緊接在疾病發(fā)作前在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰和脾中是顯著增加的。此外，已證實 IL-18施用增加鼠實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)的臨床嚴重性，其為多發(fā)性硬化模型的Thl 介導的自身免疫疾病。此外，已顯示中和抗大鼠IL-18抗血清阻止雌性Lewis大鼠中EAE 的發(fā)展。因此，IL-18是用于開發(fā)用于自身免疫的新治療的所需靶。IL-18是具有炎癥增強和減弱功能的多效性白細胞介素。一方面，它增強促炎細胞因子如TNF-α的生產(chǎn)，從而促進炎癥。另一方面，它誘導胱天蛋白酶-1抑制劑一一 NO的生產(chǎn)，從而阻斷IL-I β和IL-18的成熟，并且可能減弱炎癥。IL-18的這種不確定的 (ambiguous)作用提出了關于IL-18抑制劑在治療炎性疾病中的功效的疑問。此外，由于廣泛多樣的不同細胞因子和趨化因子在炎癥調(diào)節(jié)中的相互作用，不能預期通過阻斷此種復雜情況中的僅一種參與物(player)將獲得有利作用。盡管前述，但中和IL-18抗體仍被視為在減輕自身免疫疾病和相關癥狀中是有用的。因此，本領域需要高親和力IL-18抗體，例如針對人白細胞介素18的中和單克隆抗體。 此外，重要的是包括針對IL-18的抗體的治療方案具有高純度。本發(fā)明解決了這個需要，而無需使用A蛋白柱或等價的基于A蛋白的純化步驟。發(fā)明概述
在特定實施方案中，本發(fā)明涉及與IL-18結合的純化、分離的抗體和抗體片段，以及包括此種抗體和片段的藥物組合物。在特定實施方案中，本發(fā)明涉及與人IL-18結合的分離的抗體或其抗原結合部分。本發(fā)明的分離的抗IL-18抗體可以用于臨床情況以及研究和開發(fā)中。在特定實施方案中，本發(fā)明涉及包括SEQ ID NOs. 1和2中鑒定的重和輕鏈序列的抗IL-18抗體。本發(fā)明的特定實施方案涉及從樣品基質(zhì)中純化抗IL-18抗體或其抗原結合部分， 以使其基本上不含宿主細胞蛋白質(zhì)(“HCPs”)的方法。在特定方面，樣品基質(zhì)(或簡單地“樣品”)包括用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗IL-18抗體的細胞系。在具體方面，樣品包括用于產(chǎn)生人抗 IL-18抗體的細胞系。在本發(fā)明的特定實施方案中，對包括推定的抗IL-18抗體或其抗原結合部分的樣品基質(zhì)實施PH調(diào)整。在特定方面，將pH調(diào)整至約3. 5。低pH尤其促進可能污染樣品的pH 敏感病毒的減少和/或滅活。在合適的時間段后，將PH調(diào)整至約5. 0，并且對樣品實施離子交換層析，以產(chǎn)生洗脫物。在特定方面，收集離子交換洗脫物，并且進一步實施疏水作用層析，以產(chǎn)生洗脫物。隨后可以收集疏水作用層析洗脫物用于進一步加工或使用。在特定實施方案中，本發(fā)明提供了純化IL-18抗體的方法，其包括初步回收步驟，以尤其去除細胞和細胞碎片。在上述方法的特定實施方案中，初步回收步驟包括一個或多個離心或深層過濾(cbpth filtration)步驟。例如并且非限制性地，此種離心步驟可以以約7000 χ g至約11，000 χ g執(zhí)行。此外，上述方法的特定實施方案將包括深層過濾步驟， 例如去脂(delipid)深層過濾步驟。在上述方法的特定實施方案中，離子交換步驟可以是陽離子或陰離子交換層析或兩者的組合。這個步驟可以包括多個離子交換步驟，例如陽離子交換步驟隨后為陰離子交換步驟，或反之亦然。在特定方面，離子交換步驟涉及兩步驟離子交換過程。此種兩步驟過程可以例如且不限于通過第一個陽離子交換步驟隨后為第二個陰離子交換步驟來完成。示例性陽離子交換柱是其固定相包括陰離子基團的柱，例如CM Hyper DF 柱。這個離子交換捕獲層析步驟促進從初步回收混合物中分離抗IL-18抗體。合適的陰離子交換柱是其固定相包括陽離子基團的柱。此種柱的例子是Q kpharose 柱。一個或多個離子交換步驟通過減少雜質(zhì)進一步分離抗IL-18抗體，所述雜質(zhì)如宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA以及在可應用時的親和基質(zhì)蛋白質(zhì)。這個陰離子交換程序是層析的流通(flow through)模式，其中抗IL-18 抗體不與陰離子交換樹脂(或固相)相互作用或結合。然而，許多雜質(zhì)的確與陰離子交換樹脂相互作用且結合。在特定實施方案中，在初步回收后執(zhí)行第一個和第二個離子交換步驟。在特定此種實施方案中，對離子交換樣品實施中間過濾步驟，在第一個離子交換步驟前，在2個離子交換步驟之間，或兩者。在特定方面，這個過濾步驟包括捕獲超濾/滲濾(“UF/DF”)。在其他活性中，此種過濾促進抗IL-18抗體及其抗原結合部分的濃縮和緩沖液更換。本發(fā)明的特定實施方案提供了包括一個或多個疏水作用層析(“HIC”)步驟的方法。合適的HIC柱是其固定相包括疏水基團的那種。此種柱的非限制性例子是Wienyl HP kpharose 柱。在特定情況下，抗IL-18抗體在分離/純化過程期間將形成聚集體。一個或多個HIC步驟的包括促進此種聚集的減少或消除。HIC還幫助去除雜質(zhì)。在特定實施方案中，HIC步驟采用高鹽緩沖液，以促進抗IL-18抗體(或其聚集)與疏水柱的相互作用?？?IL-18抗體隨后可以使用較低濃度的鹽進行洗脫。在特定實施方案中，HIC洗脫物使用病毒去除濾器進行過濾，例如但不限于 Ultipor DV50 濾器(Pall Corporation,East Hills，N. Y.)?？商娲鸀V器例如 Viresolve 濾器(Millipore，Billerica, Mass. ) ；Zeta Plus VR 濾器(CUN0 ；Meriden, Conn.)；和 Planova 濾器(Asahi Kasei Pharma，Planova Division,Buffalo Grove，111.)，也可以在此種實施方案中使用。 在特定實施方案中，本發(fā)明涉及包括分離的抗IL-18抗體或其抗原結合部分和可接受載體的一種或多種藥物組合物。在一個方面，組合物進一步包括除抗IL-18抗體外的一種或多種抗體或其抗原結合部分。在另一個方面，組合物進一步包括一種或多種藥物試劑。附圖簡述


圖1描述了本發(fā)明的純化方案的非限制性例子。圖2公開了抗IL-18抗體(ABT-325)的非限制性例子的重和輕鏈序列。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及與IL-18結合的抗體。在一個方面，本發(fā)明涉及與人IL-18結合的分離的抗體或其抗原結合部分。本發(fā)明的分離的抗IL-18抗體可以用于臨床情況以及研究和開發(fā)中。本發(fā)明還涉及用于純化抗IL-18抗體或其抗原結合部分的方法?？梢栽诒景l(fā)明的背景中純化的合適抗IL-18抗體公開于USSNs 09/780, 035和10/988，360中，包括隨后已鑒定為ABT-325的抗體。ABT-325的重和輕鏈序列在圖2中顯示。本發(fā)明還涉及包括本文描述的抗IL-18抗體或其抗原結合部分的藥物組合物。為了清楚起見且非限制性地，這個詳述分成下述亞部分
1.定義；
2.抗體生成；
3.抗體生產(chǎn)；
4.抗體純化；
5.測定樣品純度的方法；
6.進一步修飾；
7.藥物組合物；和
8.抗體用途。1.定義
為了本發(fā)明可以更容易理解，首先定義了特定術語。術語“抗體”包括免疫球蛋白分子，其包含通過二硫鍵互連的4條多肽鏈一一 2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。重鏈恒定區(qū)包括3個結構域一一 CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個結構域一一 CL。VH和VL區(qū)可以進一步再分成稱為互補性決定區(qū)(CDRs)的高變區(qū)，由稱為構架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域點綴。 每個VH和VL由3個⑶Rs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語抗體的“抗原結合部分”(或“抗體部分”)包括抗體的片段，其保留與抗原(例如，hIL-18)特異性結合的能力。已顯示抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段執(zhí)行。在術語抗體的“抗原結合部分”內(nèi)包含的結合片段例子包括(i) Fab片段，包括VL、VH、 CL和CHl結構域的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包括在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的2個Fab 片段的二價片段；(iii )包括VH和CHl結構域的Fd片段；(iv)包括抗體單臂的VL和VH結構域的Fv片段，(ν)包括VH結構域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544 546, 其完整教導引入本文作為參考);和(vi)分離的互補性決定區(qū)(⑶R)。此外，盡管Fv片段的 2個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組法通過合成接頭進行連接，所述合成接頭使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈 Fv (scFv);參見例如，Bird 等人(1988)Science 242 423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 855879-5883，其完整教導引入本文作為參考)。此種單鏈抗體也意欲包含在術語抗體的“抗原結合部分”內(nèi)。還包含其他形式的單鏈抗體，例如雙抗體。 雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單條多肽鏈上表達，但使用太短而不允許相同鏈上的2個結構域之間配對的接頭，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對，并且產(chǎn)生2個抗原結合部位(參見例如，Holliger，P.，等人(1993)ftx)C. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ;Poljak，R. J.，等人(1994)Mructure 2:1121-1123，其完整教導引入本文作為參考)。再進一步地，抗體或其抗原結合部分可以是通過抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價結合形成的較大免疫粘附分子的部分。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)，以制備四聚scFv分子(Kipriyanov， S. Μ.，等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101，其完整教導引入本文作為參考)，以及使用半胱氨酸殘基、標記肽和C末端多組氨酸標簽，以制備二價和生物素化的 scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058，其完整教導引入本文作為參考)?？贵w部分例如Fab和F (ab’)2片段可以使用常規(guī)技術由完整抗體制備， 例如完整抗體分別地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可以使用標準重組DNA技術獲得，如本文描述的。在一個方面，抗原結合部分是完整結構域或完整結構域?qū)?。如本文使用的，短語“人白細胞介素18”(本文縮寫為hIL-18或IL-18)包括最初作為無生物學活性的193氨基酸前體蛋白質(zhì)合成的人細胞因子，以及例如但不限于通過例如胱天蛋白酶-1或胱天蛋白酶-4切割前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生的156氨基酸成熟蛋白質(zhì)，其顯示包括T細胞增殖的共刺激、NK細胞細胞毒性的增強、通過T細胞和NK細胞的IFN- γ生產(chǎn)的誘導、和T輔助1型(Thl)分化的加強的生物學活性。編碼IL-18的核酸可作為(ienBank登記號NM_001562獲得，并且多肽序列可作為GenBank登記號NP_001553獲得。術語人IL-18 意欲包括重組人IL-18 (rh IL-18)，其可以通過標準重組表達方法進行制備。術語“Kabat編號”、“ Kabat定義”和“Kabat標記”在本文中可互換使用。本領域公認的這些術語指編號氨基酸殘基的系統(tǒng)，所述氨基酸殘基比抗體或其抗原結合部分的重和輕鏈可變區(qū)中的其他氨基酸殘基更可變(即高變XKabat等人(1971 )Arm. NY Acad, Sci. 190:382-391 禾口 Kabat，Ε· A.，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242, 其完整教導引入本文作為參考)。對于重鏈可變區(qū)，高變區(qū)范圍為關于CDRl的氨基酸位置 31 - 35、關于⑶R2的氨基酸位置50 - 65、和關于⑶R3的氨基酸位置95 - 102。對于輕鏈可變區(qū)，高變區(qū)范圍為關于⑶Rl的氨基酸位置M - 34、關于⑶R2的氨基酸位置50 -56、和關于⑶R3的氨基酸位置89 - 97。術語“人抗體”包括具有與人種系免疫球蛋白序列對應的可變和恒定區(qū)的抗體，如 ^ Kabat ^AffiiiW Kabat, ^A (1991 )Sequences of proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH
發(fā)明者J.熱爾韋, Q.黃, R.K.?？寺?申請人:雅培制藥有限公司