專(zhuān)利名稱(chēng)：：純化抗Aβ抗體的方法純化抗A/3抗體的方法相關(guān)申請(qǐng)案本申請(qǐng)要求2005年6月17日提交的序號(hào)為60/691821的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)"純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白的方法(METHODSOFPURIFYINGFcREGIONCONTAININGPROTEINS)"的優(yōu)先權(quán)。該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本文。
背景技術(shù)：
：阿耳茨海默氏病("AD")是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征在于淀粉樣蛋白斑，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元大量丟失的出現(xiàn)。老年斑的主要組分/3淀粉樣蛋白(也稱(chēng)為A/3肽)與阿耳茨海默氏病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)(Selkoe(1989)Cell58:611-612;Hardy(1997)TrendsNeurosci.20:154-159)。已顯示/3淀粉樣蛋白不但對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元有直接毒性(LorenzoandYankner(1996)Ann.NYAcad.Sci.777:89-95)，而且還通過(guò)各種介質(zhì)而具有間接毒性(Kohetal.(1990)BrainResearch533:315-320;Mattsonetal.(1992)J.Neurosciences12:376-389)。另夕卜，體內(nèi)模型，包括PDAPP小鼠和大鼠模型表明，/3淀粉樣蛋白與學(xué)習(xí)能力缺失，認(rèn)知功能改變及海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的抑制有關(guān)(Chenetal.(2000)Nature408:975-985;Walshetal.(2002)Nature416:535-539)。因此，有很多興趣都集中在改變/3淀粉樣蛋白的水平，可能降低嚴(yán)重度甚至消滅該疾病本身的療法上。近來(lái)因在PDAPP小鼠和大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械某晒ρ芯慷霈F(xiàn)的一種AD治療策略在是個(gè)體被動(dòng)免疫，以提供免疫球蛋白，如i3淀粉樣蛋白的特異性抗體的策略(參見(jiàn)，例如，Bardetal.(2000)NatMed.6:916-919和Bardetal.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:2023-2028)。最近還顯示，被動(dòng)免疫引起的Abeta保護(hù)抵抗拮抗阿耳茨海默氏病轉(zhuǎn)基因小鼠模型突觸退變的進(jìn)行性丟失。(Buttinietal.(2005)J.Neurosci.25:9096-101)。重組技術(shù)的最新進(jìn)展使得事實(shí)上針對(duì)任何靶點(diǎn)，例如，癌細(xì)胞，細(xì)菌和病毒的抗體的產(chǎn)生成為可能。通常地，抗體用已被改造成表達(dá)高水平的所述抗體的細(xì)胞系產(chǎn)生。隨后，改造細(xì)胞系在包括糖，氨基酸和生長(zhǎng)因子及各種蛋白，包括例如，血清蛋白的復(fù)雜混合物的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。然而，從細(xì)胞副產(chǎn)物和培養(yǎng)物組分中分離完全抗體至足以用于研究或用作治療劑的純度形成了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。如果準(zhǔn)備將抗體用作藥物向人類(lèi)給藥，則抗體分子的純化尤為關(guān)鍵。傳統(tǒng)抗體純化方案(或系列)通常包括色譜步驟，所述色譜步驟利用了與多種雜質(zhì)的結(jié)合或截留相比，抗體分子優(yōu)先結(jié)合或被色譜柱的固相(或官能化固相)截留的能力。已建議或執(zhí)行的純化抗體的方案為首先將含有CH2/CH3區(qū)的蛋白結(jié)合在固相上所固定的A蛋白上，然后通過(guò)用疏水電解質(zhì)溶劑洗滌所述固相，除去固相上所結(jié)合的雜質(zhì)，接著從所述固相上回收所述含有CH2/CH3區(qū)的蛋白。然而，這些方案的限制在于用來(lái)優(yōu)先結(jié)合含有CH2/CH3區(qū)的蛋白的條件同樣支持雜質(zhì)(例如，具有不完全CH2/CH3區(qū)的抗體)的結(jié)合。在人用治療劑的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，這些雜質(zhì)是非常不希望有的。因此，存在著改進(jìn)對(duì)具有恒定區(qū)的蛋白或多肽，尤其是在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的含F(xiàn)c區(qū)蛋白(例如，抗體)的純化方法的需求。發(fā)明概述本發(fā)明的特征在于純化A/3結(jié)合蛋白，尤其A/3結(jié)合抗體的方法。本發(fā)明的方法特別適合為向人類(lèi)給藥而開(kāi)發(fā)的蛋白(例如，抗體)的純化。尤其是，本發(fā)明的特征在于具有恒定區(qū)蛋白，尤其是在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的具有Fc區(qū)蛋白(例如，抗體)的純化。在多個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于將具有Fc區(qū)A/3結(jié)合蛋白，如抗A^抗體從包括所述蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中分離的方法。在本發(fā)明的方法中，將A/3結(jié)合蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)。接著從洗脫溶液中的所述Fc結(jié)合劑上回收所述蛋白。本發(fā)明的方法對(duì)除去例如內(nèi)含子連讀變異體種類(lèi)(IRT)，二硫鍵缺失類(lèi)(UDB)和/或低分子量變異體類(lèi)(LMW)這樣的雜質(zhì)尤其有效。本發(fā)明的方法在除去例如宿主細(xì)胞蛋白(HCP)和DNA這樣的雜質(zhì)方面同樣有效。本發(fā)明的方法包括一個(gè)或多個(gè)色譜分離步驟，另外，還可以包括一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟。所述色譜分離步驟可以是連續(xù)或不連續(xù)的(例如，分批方法)，或者為兩者的組合。在多種實(shí)施方案中，本方法包括一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟，例如，來(lái)除去病毒，濃縮和緩沖含有靶蛋白的溶液，以及除去微生物污染物的過(guò)濾步驟。在多種實(shí)施方案中，抗A/3抗體是鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體和人抗體。在一些實(shí)施方案中，抗A/3抗體是與A/3的1-7，1-5，3-7，3-6，13-28，15-24，16-24，16-21，19-22，33-40，33-42殘基內(nèi)的表位特異性結(jié)合的抗體。例示性抗A/3抗體與A/3的l-10殘基內(nèi)，例如，A/3的1-7，1-5，3-7或3-6殘基內(nèi)的表位特異性結(jié)合。其它例示性抗A/3抗體與A/3的13-28殘基內(nèi)，例如，A/3的16-21或19-22殘基內(nèi)的表位特異性結(jié)合。其它例示性抗A/3抗體與A/3的C末端表位，例如，A|3的33-40或33-42特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗A/3抗體結(jié)合非連續(xù)表位，所述非連續(xù)表位包括A^的1-7和13-28殘基內(nèi)的表位。其它實(shí)施方案的特征在于抗A/3抗體的Fab,Fab'(2)或Fv片段。在一些這類(lèi)實(shí)施方案中，抗體是雙特異性抗體或通過(guò)國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO03/070760中所述方法制備的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是人源化抗A/3抗體，并且在某些實(shí)施方案中是選自3D6，10D5,12B4，12A11,15C11和266的抗A/3抗體?？贵w的同種型可以是IgM，IgGl,IgG2，IgG3，IgG4或任何其它藥學(xué)上可接受的同種型。在優(yōu)選實(shí)施方案中，同種型是人IgGl或人IgG4。在多種實(shí)施方案中，Aj8結(jié)合蛋白是重組產(chǎn)生的。在多種實(shí)施方案中，A/3結(jié)合蛋白是在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。在多種實(shí)施方案中，所述一種或多種雜質(zhì)包括一種或多種宿主細(xì)胞蛋白，宿主細(xì)胞DNA，細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白，非所需種類(lèi)的A/3結(jié)合蛋白及其混合物。例如，在多種實(shí)施方案中，非所需種類(lèi)的A/3結(jié)合蛋白包括一種或多種具有內(nèi)含子連讀序列的抗體鏈或其片段，一種或多種具有不正確二硫鍵的抗體鏈或其片段，半抗體或其片段，輕鏈二聚體或其片段和重鏈二聚體或其片段。在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法通過(guò)首先將結(jié)合蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的過(guò)程，從包括所述蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體。在多種實(shí)施方案中，將所述蛋白吸附到Fc結(jié)合劑的步驟和用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑的步驟在約2°C至約24°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在多種實(shí)施方案中，從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟包括用pH范圍為約2.0至約6.5的洗脫緩沖液洗脫所述蛋白。在多種實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)結(jié)合劑包括A蛋白和G蛋白的一種或多種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)合劑被固定在固相上。該固相可以包括，例如，珠，瓊脂糖基質(zhì)，二氧化硅及其混合物的一種或多種。用來(lái)洗滌Fc結(jié)合劑的緩沖液中所存在的二價(jià)陽(yáng)離子鹽可以包括，例如，離液序列高的鹽。適用于制備所述洗滌緩沖溶液的二價(jià)陽(yáng)離子鹽包括但不限于氯化鎂，氯化鈣，氯化鎳及其混合物。在多種實(shí)施方案中，適用于制備所述洗滌緩沖溶液的二價(jià)陽(yáng)離子鹽包括但不限于二價(jià)II族(例如，鎂，鈣，鋇等)陽(yáng)離子，二價(jià)過(guò)度金屬(例如，銅，鎳，錳等)陽(yáng)離子的硫氰酸鹽(SCN。，高氯酸鹽(CKV),硝酸鹽(NCV)，氯化鹽和溴化鹽及這些鹽的組合物。在多種實(shí)施方案中，含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液的pH值范圍為約4至約9，在一些實(shí)施方案中，為約4至約8，約4.5至約7.5或約6至約8。此處所述范圍內(nèi)所包括的值和范圍和/或中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽的pH值為約7.1至約7.9，約7.2至約7.9，約7.3至約7.7,約7.4至約7.6,約4至約5，約5至約6，約6至約7或約8至約9。此外，希望以此處所述值作為上限或下限的范圍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽的pH為至少約(或約)4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5或8。在多種實(shí)施方案中，緩沖溶液所含有的二價(jià)陽(yáng)離子鹽的濃度范圍為約0.1M至約5M，在一些實(shí)施方案中為約0.5M至約3M，約1.0M至約3M或約0.6M至約2.5M。例如，所述二價(jià)陽(yáng)離子緩沖液可以包括至少約0.6M的CaCl2或至少約2M的MgCl2或至少約2M的CaCl2。此處所述范圍內(nèi)所包括的值和范圍和/或中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述緩沖溶液所具有的二價(jià)陽(yáng)離子鹽的濃度為約0.5M至約0.75M，約0.5M至約0.8M，約0.5M至約0.9M，約0.5M至1.0M，約0.5M至2M，約1.5M至約2.0M，約1.5M至約2.5M，約1.5M至約3.0M或約2.5M至約3M。此外，希望以此處所述值作為上限或下限的范圍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述緩沖溶液所含有的二價(jià)陽(yáng)離子鹽的濃度為至少約(或約)0.6M，1M，1.5M，2M，2.5M或3M。在多種實(shí)施方案中，含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液的溫度范圍為約2°C至約24°C。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收抗體的步驟包括用pH范圍為約2.0至約6.5，優(yōu)選約2.0至約4.0，更優(yōu)選約2.5至約3.5的洗脫緩沖液洗脫所述抗體。此處所述范圍內(nèi)所包括的值和范圍和/或中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述洗脫緩沖液的pH為約2至約3或約3至約4。此外，希望以此處所述值作為上限或下限的范圍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述洗脫緩沖液的pH為至少約(或約)2，2.5，3，3.5或4。在多種實(shí)施方案中，所回收的蛋白可以在所述Fc結(jié)合劑色譜步驟之前或之后進(jìn)行另外的純化步驟。例如，例示性的進(jìn)一步的純化步驟包括但不限于陰離子交換色譜，陽(yáng)離子交換色譜，固定化金屬親和色譜，疏水相互作用色譜(HIC)，羥基磷灰石色譜，透析，親和色譜，硫酸銨沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)，色譜聚焦，超濾，滲濾，微濾和凝膠過(guò)濾。在多種實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)合劑色譜步驟后跟隨有陰離子交換色譜和HIC步驟。在多種實(shí)施方案中，所述色譜步驟后還跟隨著病毒過(guò)濾步驟，超濾/滲濾步驟和/或微生物污染物過(guò)濾步驟。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體從其含有雜質(zhì)的溶液中純化的方法。在多種實(shí)施方案中，所述方法包括，首先將所述蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白，以產(chǎn)生第一洗脫池(eluentpool)。在多種實(shí)施方案中，所述純化過(guò)程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過(guò)離子交換樹(shù)脂與所述第一洗脫池使靶蛋白不吸附到樹(shù)脂上的方式接觸，然后回收流過(guò)的靶蛋白，以產(chǎn)生第二洗脫池，而對(duì)所述第一洗脫池進(jìn)行離子交換色譜。在多種實(shí)施方案中，所述離子交換色譜步驟進(jìn)一步包括用緩沖洗滌液洗滌所述離子交換樹(shù)脂，以回收至少一部分任何被吸附的靶蛋白。在多種實(shí)施方案中，所述純化過(guò)程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過(guò)將所述耙蛋白吸附到疏水相互作用樹(shù)脂(例如，經(jīng)疏水配體官能化的固相)上，用離子強(qiáng)度幾乎不洗脫所述靶蛋白的緩沖洗滌液洗滌所述疏水相互作用樹(shù)脂，然后回收純化的靶蛋白(通常用離子強(qiáng)度低至足以使所述靶蛋白從所述疏水相互作用樹(shù)脂上解吸附的洗脫緩沖液)，而對(duì)所述第二洗脫池進(jìn)行疏水相互作用色譜。在本發(fā)明的多個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)合劑被固定在固相上，其優(yōu)選在與源液接觸之前先用適宜的緩沖液平衡。所述固相優(yōu)選為包括固定所述FC結(jié)合劑的瓊脂糖的柱。在多種實(shí)施方案中，所述柱涂覆有試劑，例如甘油，以減少或防止柱的非特異性附著。在多種實(shí)施方案中，經(jīng)本發(fā)明的方法純化的蛋白可以配制在藥學(xué)上可接受的載體中，并用于各種診斷，治療或其它已知的這類(lèi)分子的用途。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從含有A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體及其內(nèi)含子連讀變異體(IRT)的溶液中純化A/3結(jié)合蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來(lái)降低蛋白制品，例如，抗體制品中的一種或多種內(nèi)含子連讀變異體種類(lèi)的水平。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收的蛋白的內(nèi)含子連讀變異體水平比源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少5倍，并且在一些實(shí)施方案中，比源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少10倍。在多種實(shí)施方案中，在含有所述回收自Fc結(jié)合劑的蛋白的溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約1.0%，0.8%，0.5%，0.2%或0.1%的所述蛋白的種類(lèi)。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從含有A/5結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A0抗體及其低分子量變異體(LMW)的溶液中純化A/3結(jié)合蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來(lái)降低蛋白制品，如抗體制品中的一種或多種低分子量變異體類(lèi)的水平。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收的蛋白的低分子量變異體水平比源液中的低分子量變異體水平小至少5倍，在一些實(shí)施方案中比源液中的低分子量變異體水平小至少10倍。在多種實(shí)施方案中，在含有所述回收自Fc結(jié)合劑的蛋白的溶液中，所述低分子量變異體包括小于約1.0%，0.8%，0.5%，0.2%或0.1%的所述蛋白的種類(lèi)。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從含有A0結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體及其二硫鍵缺失變異體(UDB)的溶液中純化A/3結(jié)合蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來(lái)降低蛋白制品，如抗體制品中的一種或多種二硫鍵缺失變異體類(lèi)的水平。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收的蛋白的二硫鍵缺失變異體水平比源液中的二硫鍵缺失變異體水平小至少5倍，在一些實(shí)施方案中比源液中的二硫鍵缺失變異體水平小至少10倍。在多種實(shí)施方案中，在含有所述回收自Fc結(jié)合劑的蛋白的溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約20%，15%，10%，5°/。，2%或1%的所述蛋白的種類(lèi)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了根據(jù)任何方法純化的Ai3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體，所述方法至少包括首先將所述蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟。在多種實(shí)施方案中，抗Ai3抗體是選自3D6，10D5,12B4，12A11,15Cll和266的人源化抗A/3抗體。在各種實(shí)施方案中，抗A/3抗體是選自3D6，10D5，12B4和12A11的人源化抗A/3抗體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了適用于實(shí)施任何方法的系統(tǒng)，所述方法至少包括首先將具有Fc區(qū)的結(jié)合蛋白，如抗A/3抗體吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟。在其它方面，本發(fā)明提供了用于實(shí)施任何方法的純化系列，所述方法至少包括首先將A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟。在多個(gè)方面，本發(fā)明的特征還在于用于實(shí)施本發(fā)明的一種或多種方法的試劑盒。在多種實(shí)施方案中，所述試劑盒包括至少一種試劑和所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。例如，試劑盒可以包括一種或多種試劑，如Fc結(jié)合劑，二價(jià)陽(yáng)離子鹽和用于制備含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖洗滌液的試劑，以及所述試劑盒用于，例如，純化A/3結(jié)合蛋白，如抗A/3抗體的使用說(shuō)明書(shū)。附圖簡(jiǎn)述圖1分別顯示了人源化3D6版本2(hu3D6.v2)抗Ai3抗體的輕鏈和重鏈的完整氨基酸序列SEQIDNOl和SEQIDNO:2。輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，艮口，CDR1，CDR2和CDR3分別位于氨基酸殘基24-39，55-61和94-102(上部分)。重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，即，CDR1，CDR2和CDR3分別位于氨基酸殘基40-44，50-65和99-108(下部分)。預(yù)測(cè)的分子內(nèi)二硫鍵通過(guò)相關(guān)半胱氨酸殘基的連接進(jìn)行說(shuō)明。在預(yù)計(jì)形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸下面劃線，并標(biāo)明連接?？贵w重鏈的N-連接糖基化共有位點(diǎn)位于氨基酸殘基299-301，以斜體字顯示(下部分)。預(yù)測(cè)的重鏈C末端賴(lài)氨酸用括號(hào)標(biāo)明。發(fā)明詳述在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，對(duì)本文將要使用的特定術(shù)語(yǔ)的定義進(jìn)行闡述有助于對(duì)本發(fā)明的理解。將本文所述定義分組只是為了方便參考而不是為了限制。蛋白相關(guān)定義本發(fā)明的特征在于純化A/3結(jié)合蛋白，尤其是結(jié)合抗體的方法。尤其是，本發(fā)明的特征在于具有恒定區(qū)蛋白，尤其是具有Fc區(qū)蛋白(例如，抗體)的純化。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從含有具有Fc區(qū)的A/3結(jié)合蛋白，如抗A/3抗體及其一種或多種連讀變異體，例如，內(nèi)含子連讀變異體的溶液中純化具有Fc區(qū)的A/5結(jié)合蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來(lái)降低蛋白制品，例如，抗體制品中一種或多種內(nèi)含子連讀(IRT)變異體類(lèi)的水平。本文中，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)含子連讀變異體"和"內(nèi)含子連讀變異體種類(lèi)"可以互換使用，指在A/3結(jié)合蛋白的合成中，多肽鏈延伸在編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄之前被編碼區(qū)前的內(nèi)含子中的終止密碼子終止的過(guò)程的產(chǎn)物。結(jié)果是具有一個(gè)或多個(gè)不完全或缺失結(jié)構(gòu)域的感興趣的蛋白的變異體(即，內(nèi)含子連讀變異體)。這種內(nèi)含子可以包含一個(gè)以上的終止密碼子，從而導(dǎo)致了產(chǎn)生數(shù)個(gè)不同內(nèi)含子連讀變異體的可能性。術(shù)語(yǔ)"二硫鍵缺失變異體"(或"UDB")是指任何缺失至少一個(gè)二硫鍵的種類(lèi)。缺失的二硫鍵可以是鏈間二硫鍵或鏈內(nèi)二硫鍵或這兩者的組合。術(shù)語(yǔ)"低分子量種類(lèi)"或"LMW"類(lèi)是指A/3結(jié)合蛋白，例如，抗A/3抗體的變異體，其包括由游離重鏈，游離輕鏈，IRT類(lèi)，半分子和四分之三分子或其混合物組成的蛋白種類(lèi)。A蛋白是在大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株中發(fā)現(xiàn)的約42kD的細(xì)胞壁蛋白，其以高親和力(與人IgG的親和力約為10—8M)與抗體的Fc區(qū)結(jié)合。本文所用術(shù)語(yǔ)"A蛋白"包括從其天然來(lái)源回收的A蛋白，合成產(chǎn)生的A蛋白(例如，通過(guò)肽合成，通過(guò)重組技術(shù)等)及其保留了結(jié)合具有CH2/CH3區(qū)蛋白的能力的變異體。G蛋白是G組鏈球菌的細(xì)胞壁蛋白。G蛋白是以高親和力與抗體,尤其igG抗體的Fc區(qū)結(jié)合的III型Fc受體。本文所用術(shù)語(yǔ)"G蛋白"包括從其天然來(lái)源回收的G蛋白，合成產(chǎn)生的G蛋白(例如，通過(guò)肽合成，通過(guò)重組技術(shù)等)及其保留了結(jié)合具有Fc區(qū)蛋白的能力的變異體。本文中，術(shù)語(yǔ)"/3淀粉樣蛋白"，"/3淀粉樣肽"，"/3淀粉狀蛋白"，"A/T和"A/5肽"可以互換使用。本文所用術(shù)語(yǔ)"A/3結(jié)合蛋白"意指能與A0肽或所述A/3肽內(nèi)的表位特異性結(jié)合，或?qū)/3具有可感知的結(jié)合親和力的蛋白。在例示性實(shí)施方案中，A/3結(jié)合蛋白含有Fc區(qū)，這樣其便可以根據(jù)本發(fā)明的方法結(jié)合Fc結(jié)合劑。術(shù)語(yǔ)"抗體'，或"免疫球蛋白"(本文中可以互換使用)是指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四肽鏈基本結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合蛋白，所述鏈通過(guò)例如，鏈間二硫鍵而被穩(wěn)定化，所述抗原結(jié)合蛋白具有特異性結(jié)合抗原的能力。重鏈和輕鏈都折疊成結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)"抗體"或"免疫球蛋白"包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，嵌合抗體，CDR移植抗體，人源化抗體，人抗體和單鏈抗體(scFvs)。本文所用術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"多克隆抗體組合物"是指僅含有一種能識(shí)別并與靶抗原的特定表位，例如，A^的表位結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群體。因此，單克隆抗體組合物通常對(duì)與之發(fā)生免疫反應(yīng)的特定靶抗原顯示出單一的結(jié)合特異性和親和性。非人抗體可以通過(guò)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,225,539中所述技術(shù)"人源化"。在一種方法中，將非人CDRs插入人抗體或共有抗體框架序列。然后可以向所述抗體框架中引入其它改變，以調(diào)節(jié)親和性或免疫原性。術(shù)語(yǔ)"抗A0抗體"意指對(duì)人淀粉樣前體蛋白(APP)的A/3肽具有結(jié)合特異性的抗體。A/3肽在本領(lǐng)域中也被稱(chēng)為/3淀粉樣肽。A/3肽是APP的第39-43個(gè)氨基酸內(nèi)部約4kD的片段(分別為A/339，A&o，A/341，A/3^和A&3)。術(shù)語(yǔ)"抗A^抗體"希望包括對(duì)任何這些形式的A/3肽具有結(jié)合特異性的抗體。感興趣的具體抗A/3抗體包括但不限于3D6，10D5，12B4，12A11,15C11和266及其人源化版本。例示性抗A/3抗體在2001年12月6日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/010,942(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20030165496A1;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO2002/46237A2);2003年3月12日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/388,389(美國(guó)專(zhuān)利出版物No.20040087777Al;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO2004/080419A2);2003年3月12日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/388,214(美國(guó)專(zhuān)利出版物No.20040082762A1;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO2003/077858A2);2004年6月1日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/858,855(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050118651A1;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO2004/108895A2);和2005年12月15日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/304,986(同時(shí)參見(jiàn)PCT/US05/45515)中描述，所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容均因此引入本文作為參考。其它例示性抗A/3抗體在2001年2月26日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.l0/226，435(美國(guó)專(zhuān)利出版物No.20040043418A1;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO01/062801A2)，2002年8月14日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/487,322(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20040192898Al;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO03/016466A2);2002年4月26日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/476,265(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050090648A1;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO02/088306A2);2002年4月26日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/497,475(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050142131A1;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO02/088307A2);禾卩2003年2月20日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/505,313(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050169925;同時(shí)參見(jiàn)PCT公開(kāi)No.WO03/070760A2)中描述。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"是指抗體或抗體鏈的一部分，其包括比完整或完全抗體或抗體鏈少的氨基酸殘基。片段可以通過(guò)化學(xué)或酶處理完整或完全抗體或抗體鏈而獲得。片段也可以通過(guò)重組方法獲得。例示性片段包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)abc和/或Fv片段。用于構(gòu)建Fab片段的方法在例如Huse，etal.(1989)Science246:12751281中描述。其它可以通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生的抗體片段包括但不限于(i)由抗體分子的胃蛋白酶消化而產(chǎn)生的F(ab')2片段；(ii)通過(guò)還原F(ab')2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab片段；(iii)通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而產(chǎn)生的Fab'片段和(iv)Fv片段。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合片段"是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，其結(jié)合抗原，或與其衍生自的完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性抗原結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"是指包括肽環(huán)(例如，包括3-4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈多肽的球形區(qū)，所述肽環(huán)通過(guò)例如，/3-折疊片和/或鏈內(nèi)二硫鍵而穩(wěn)定化。本文中，根據(jù)在"恒定"結(jié)構(gòu)域的情況下，由各類(lèi)成員組成的結(jié)構(gòu)域內(nèi)序列變異的相對(duì)缺乏，或在"可變"結(jié)構(gòu)域的情況下，由各類(lèi)成員組成的結(jié)構(gòu)域內(nèi)的顯著變異，結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步被稱(chēng)為"恒定"結(jié)構(gòu)域或"可變"結(jié)構(gòu)域。輕鏈上的"恒定"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱(chēng)為"輕鏈恒定區(qū)"，"輕鏈恒定域"，"CL"區(qū)或"CL"結(jié)構(gòu)域。重鏈上的"恒定"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱(chēng)為"重鏈恒定區(qū)"，"重鏈恒定域"，"CH"區(qū)或"CH"結(jié)構(gòu)域。輕鏈上的"可變"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱(chēng)為"輕鏈可變區(qū)"，"輕鏈可變域"，"VL"區(qū)或"VL"結(jié)構(gòu)域。重鏈上的"可變"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱(chēng)為"重鏈可變區(qū)"，"重鏈可變域"，"VH"區(qū)或"VH"結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)"區(qū)"也可以指抗體鏈和抗體鏈結(jié)構(gòu)域的一部分(例如，重或輕鏈的一部分或本文所定義的恒定或可變結(jié)構(gòu)域的一部分)及所述鏈或結(jié)構(gòu)域的更離散的部分。例如，輕和重鏈或輕和重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括散布在本文所定義的"框架區(qū)"或"FRs"的"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDRs"。術(shù)語(yǔ)"構(gòu)象"是指蛋白或多肽，例如，抗體，抗體鏈，其結(jié)構(gòu)域或區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，短語(yǔ)"輕(或重)鏈構(gòu)象"是指輕(或重)鏈可變區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，短語(yǔ)"抗體構(gòu)象"或"抗體片段構(gòu)象"是指抗體或其片段的三級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)抗體的"特異性結(jié)合"的意思是，所述抗體對(duì)特定抗原或表位表現(xiàn)出可感知的親和性，并且通常不表現(xiàn)出明顯交叉反應(yīng)性。在例示性實(shí)施方案中，所述抗體不表現(xiàn)交叉反應(yīng)性(例如，不與非A/3肽或A0的遠(yuǎn)側(cè)或遠(yuǎn)緣表位發(fā)生交叉反應(yīng))。"可感知"或優(yōu)選的結(jié)合包括親和力至少為l(T6，10-7，l(T8，10力M或l(r1QM的結(jié)合。大于10:M，優(yōu)選大于10—8M的親和力是更優(yōu)選的。此處所述這些值的中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選的結(jié)合親和力可以以親和力的范圍表示，例如，10-6-10-10M，優(yōu)選10-7-10-|QM，更優(yōu)選10-8-10—1QM。"不表現(xiàn)出明顯交叉反應(yīng)性"的抗體是不與非所需實(shí)體(例如，非所需蛋白，多肽或肽)發(fā)生可感知的結(jié)合的抗體。例如，與A/3特異性結(jié)合的抗體將與A/3發(fā)生可感知的結(jié)合，但不與非A0蛋白或肽(例如，斑中所包括的非A/3蛋白或肽)發(fā)生明顯反應(yīng)。對(duì)特定表位具有特異性的抗體將不與相同蛋白或肽上的遠(yuǎn)緣或不同表位發(fā)生明顯交叉反應(yīng)。特異性結(jié)合可以根據(jù)任何本領(lǐng)域公認(rèn)的用于測(cè)定這種結(jié)合的方法來(lái)測(cè)定。優(yōu)選特異性結(jié)合根據(jù)Scatchard分析和/或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。除"雙特異性"或"雙官能性"免疫球蛋白或抗體之外，認(rèn)為免疫球蛋白或抗體具有其每個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)。"雙特異性"或"雙官能性抗體"是具有兩個(gè)不同重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜交抗體。雙特異性抗體可以通過(guò)多種方法，包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接等產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990);Kostelnyetal.,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。"抗原"是含有抗體與之特異性結(jié)合的抗原決定簇的分子(例如，蛋白，多肽，肽，碳水化合物或小分子)。術(shù)語(yǔ)"表位"或"抗原決定簇"是指免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)與之特異性結(jié)合的抗原上的位點(diǎn)。表位可以由鄰接氨基酸或通過(guò)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊而并列的非鄰接氨基酸形成。由鄰接氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑后通常能保留，而由三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理后丟失。表位通常包括獨(dú)特空間構(gòu)象中的至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸。測(cè)定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如，X射線晶體學(xué)和二維核磁共振。參見(jiàn)，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。除了上文所述抗A/3抗體外，其它A0結(jié)合蛋白包括抗體融合蛋白。術(shù)語(yǔ)"抗體融合蛋白"和"抗體融合"是指融合蛋白，其包括與至少一種非抗體蛋白部分或多肽融合的抗體的全部或一部分。融合通常通過(guò)編碼所述蛋白的基因的基因工程而完成。其它例示性抗體融合蛋白包括與另一可溶或細(xì)胞生物蛋白的全部或一部分，例如，受體(細(xì)胞受體或可溶受體)或其部分，細(xì)胞因子或其部分，酶或其部分等融合的抗體(包括Fc區(qū))的細(xì)胞受體結(jié)合部分。尤其是，本發(fā)明的抗體融合蛋白可以包括與能結(jié)合A/3的非抗體蛋白部分或多肽融合的抗體的Fc區(qū)。術(shù)語(yǔ)"Fc結(jié)合劑"是指能與抗體(例如，IgG抗體)的Fc區(qū)結(jié)合的分子，其包括但不限于補(bǔ)體蛋白，F(xiàn)c受體或由細(xì)菌衍生的對(duì)抗體的Fc區(qū)具有高親和力的蛋白，如A蛋白或G蛋白。術(shù)語(yǔ)"Fc區(qū)"是指IgG抗體的C末端區(qū)，尤其指所述IgG抗體的重鏈的C末端區(qū)。盡管IgG重鏈的Fc區(qū)的邊界可以細(xì)微地變化，但Fc區(qū)通常被定義為約從IgG重鏈的氨基酸殘基Cys226跨越到羧基端。色譜相關(guān)定義本文所用術(shù)語(yǔ)"源液"是指包含至少一種希望從其它同樣存在的物質(zhì)中純化出來(lái)的耙物質(zhì)的液體。源液可以是，例如，水溶液，有機(jī)溶劑系統(tǒng)或水/有機(jī)溶劑混合物或溶液。源液常常為含有許多生物分子(如蛋白，抗體，激素和病毒)，小分子(如鹽，糖，脂質(zhì)等)甚至顆粒物質(zhì)的復(fù)雜混合物或溶液。雖然生物起源的典型源液以水溶液或懸浮液開(kāi)始，但其也可以含有在例如溶劑沉淀，提取等早期分離步驟中所使用的有機(jī)溶劑。包含能通過(guò)本發(fā)明的多種實(shí)施方案純化的有價(jià)值的生物物質(zhì)的源液的例子包括但不限于來(lái)自生物反應(yīng)器的培養(yǎng)上清液，均化細(xì)胞懸液，血漿，血漿組分和牛乳。本文中，術(shù)語(yǔ)"耙物質(zhì)"或"耙蛋白"或"耙抗體"是指期望從源液中純化出來(lái)的一種或多種所需的A/3結(jié)合蛋白，例如，抗A0抗體。耙物質(zhì)可以存在于為懸浮液的源液或溶液中。術(shù)語(yǔ)"雜質(zhì)"是指源液中的不同于靶物質(zhì)，并且希望從最終的靶物質(zhì)產(chǎn)品中除去的物質(zhì)。典型的雜質(zhì)包括核酸，蛋白(包括內(nèi)含子連讀類(lèi)，低分子量種類(lèi)和二硫鍵缺失類(lèi))，肽，內(nèi)毒素，病毒和小分子。術(shù)語(yǔ)"副產(chǎn)物"包括減損或降低本發(fā)明的治療性蛋白的比例的非所需產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"高分子量類(lèi)"是指分子量大于本發(fā)明的預(yù)期蛋白的蛋白復(fù)合物。在抗體，例如，IgG抗體的情況下，這種聚集物大于約150kD。術(shù)語(yǔ)"低分子量種類(lèi)"是指分子量小于本發(fā)明的預(yù)期蛋白的蛋白，例如，降解產(chǎn)物。在抗體，例如，IgG抗體的情況下，這種降解產(chǎn)物小于約150kD。本文所用術(shù)語(yǔ)"固相"是指在純化過(guò)程中與耙物質(zhì)相互作用，或Fc結(jié)合劑可以附著其上的非水基質(zhì)。適宜的固相材料包括但不限于玻璃，二氧化硅(例如，硅膠)，多糖(例如，多糖基質(zhì))，如瓊脂糖和纖維素，有機(jī)聚合物，如聚丙烯酰胺，甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，例如，AmberliteTM樹(shù)脂(可購(gòu)自Rohm&HaasChemicalCo.,Philadelphia,Pa.)。固相可以選自通常被描述為親和樹(shù)脂，離子交換樹(shù)脂和離子俘獲樹(shù)脂的樹(shù)脂中的任何一種。固相可以是，例如，純化柱，離散顆粒的非連續(xù)相或其組合物。固相可以具有多孔或無(wú)孔特性，并且可以是可壓縮或不可壓縮的。在多種實(shí)施方案中，固相是聚合物基質(zhì)或瓊脂糖顆粒或珠。在多種實(shí)施方案中，固相可以涂覆有試劑(如甘油)，以防止例如雜質(zhì)在固相上的非特異性附著。Fc結(jié)合固相只需要具有允許Fc結(jié)合劑附著到所述固相表面的化學(xué)物或結(jié)合的配體。優(yōu)選固相材料對(duì)純化過(guò)程，包括抽濾和錯(cuò)流過(guò)濾中所采用的條件和所用液體的溫度，pH以及其它方面將具有物理和化學(xué)可恢復(fù)性。"親和配體"是指通過(guò)與源液組分的結(jié)合位點(diǎn)的特異性相互作用而與所述組分選擇性或優(yōu)先結(jié)合的分子。在本發(fā)明中，親和配體(例如，F(xiàn)c結(jié)合劑)通常被固定在固定相，如樹(shù)脂上?？梢越Y(jié)合至樹(shù)脂載體上，以提供可用于本發(fā)明的過(guò)程的色譜用樹(shù)脂的親和配體的例子包括但不限于A蛋白，G蛋白及其選擇性結(jié)合蛋白Fc區(qū)的類(lèi)似物。使親和配體與固體載體材料結(jié)合的方法是純化
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的。參見(jiàn)，例如，參考書(shū)AffinitySeparations:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),PaulMatejtschuk(Editor),IrlPr:1997;禾卩AffinityChromatography,HerbertSchott,MarcelDekker,NewYork:1997。"親和色譜用樹(shù)脂"或"親和樹(shù)脂"是指包括具有結(jié)合在固相或底物表面的親和配體的固相或底物的色譜用樹(shù)脂。"離子交換色譜用樹(shù)脂"或"離子交換樹(shù)脂"是指與帶有正或負(fù)電荷的配體共價(jià)結(jié)合，因而具有可用于與所述離子交換樹(shù)脂所接觸的溶液中的離子進(jìn)行交換的游離平衡離子的固體載體。"陽(yáng)離子交換樹(shù)脂"是指與帶負(fù)電荷的配體共價(jià)結(jié)合，因而具有用于與所述樹(shù)脂所接觸的溶液中的陽(yáng)離子進(jìn)行交換的游離陽(yáng)離子的離子交換樹(shù)脂。本領(lǐng)域已知有很多種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，例如，其中共價(jià)結(jié)合基團(tuán)是羧酸鹽或磺酸鹽的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。市場(chǎng)上可以買(mǎi)到的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括CMC-纖維素，SP-SephadexTM和FastS-SepharoseTM(后兩者可購(gòu)自Pharmacia)。"陰離子交換樹(shù)脂"是指與帶正電荷的基團(tuán)，如季銨基共價(jià)結(jié)合的離子交換樹(shù)脂。市場(chǎng)上可以買(mǎi)到的陰離子交換樹(shù)脂包括DEAE纖維素，TMAE，QAESephadex禾卩FastQSepharose(后兩者可購(gòu)自Pharmacia)。本文所用術(shù)語(yǔ)"離液序列高的鹽"是指包括一種或多種感膠離子序列低，能滲透蛋白水化層，并與其表面直接結(jié)合的離子組分的鹽。這破壞了共水合締合(cohydrativeassociation)，從而有利于蛋白的增溶。離液序列高的鹽的例子包括但不限于n族元素的鹵化鹽(例如，氯化鈣，氯化鎂，氯化鋇，溴化鈣，溴化鎂，溴化鋇，碘化鈣，碘化鎂，碘化鋇)。適宜二價(jià)陽(yáng)離子鹽的例子包括但不限于Mn2、N產(chǎn)或Ci^+，Mg2+，Ca2，nBa2+與硫氰酸根(SCN.)，高氯酸根(C104—)，硝酸根(N03_)，氯離子(CI.)和溴離子(Br—)的鹽及其組合物。在某些實(shí)施方案中，二價(jià)陽(yáng)離子鹽包括二價(jià)陽(yáng)離子(例如，Mg2+，Ca2+，N嚴(yán)或B^+)。優(yōu)選用于特征過(guò)程的離液序列高的鹽有MgCl2，NiCh和CaCl2。在二價(jià)陽(yáng)離子鹽洗滌步驟之后，靶蛋白從親和色譜基質(zhì)上洗脫下來(lái)。"緩沖劑"是其存在于溶液中時(shí)增加導(dǎo)致pH的單位變化所必須加入的酸或堿的量的物質(zhì)。緩沖液通過(guò)其酸-堿軛合物組分的作用而抵抗pH的變化。與生物試劑一起使用的緩沖液通常能維持恒定濃度的氫離子，以使溶液的pH在生理范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"生理pH"是指哺乳動(dòng)物血液的pH(即，7.38或約7.4)。因此，生理pH范圍是約7.2-7.6。傳統(tǒng)緩沖劑組分包括但不限于有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽，酸和堿。用于生物分子(例如，蛋白分子)純化的例示性緩沖劑包括兩性離子或"Good"緩沖劑，參見(jiàn)，例如，Goodetal.(1966)Biochemistry5:467禾口GoodandIzawa(1972)MethodsEnzymol.24:62。例示性緩沖劑包括但不限于TES，MES，PIPES,HEPES，MOPS，MOPSO,TRIC羅和BICINE。本文中的"平衡緩沖液"是用來(lái)制備Fc結(jié)合試劑，固相或此兩者，用于含有耙蛋白的源液的上樣的緩沖液。平衡緩沖液優(yōu)選是等滲的，并且pH通常在約6至約8的范圍內(nèi)。"上樣緩沖液"是用來(lái)將含有A/3結(jié)合蛋白，例如，抗A/3抗體和雜質(zhì)的源液上樣到Fc結(jié)合劑被固定于其上的固相上的緩沖液。通常，平衡和上樣緩沖液是相同的。"洗脫緩沖液"是用來(lái)從被固定的Fc結(jié)合劑上洗脫A/3結(jié)合蛋白的緩沖液。優(yōu)選洗脫緩沖液具有較低的pH，從而能破壞Fc結(jié)合劑與感興趣的蛋白間的相互作用。優(yōu)選低pH的洗脫緩沖液的pH在約2至約5，更優(yōu)選在約3至約4的范圍內(nèi)。能將pH控制在該范圍內(nèi)的緩沖液的例子包括甘氨酸，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽和銨緩沖液及其組合物。優(yōu)選的這類(lèi)緩沖液是檸檬酸鹽和醋酸鹽緩沖液，最優(yōu)選的是檸檬酸鈉或醋酸鈉緩沖液。涵蓋的其它洗脫緩沖液包括用于洗脫感興趣的蛋白的高pH緩沖液(例如，pH為9或9以上的緩沖液)或包括例如MgCl2(2mM)的化合物或組合物的緩沖液。本文用到的"洗滌液"或"洗滌緩沖液"在本文中都是指用來(lái)將雜質(zhì)從結(jié)合了靶物質(zhì)的色譜用樹(shù)脂上帶走的液體。可以相繼使用一種以上的洗滌液，例如，設(shè)計(jì)依次用具有不同特性，如pH，導(dǎo)電率，溶劑濃度等的洗滌液離解和除去與所述色譜用樹(shù)脂非特異性締合的不同類(lèi)型的雜質(zhì)。本文中的"洗脫液"或"洗脫緩沖液"是指用來(lái)從已經(jīng)一種或多種洗滌液洗滌過(guò)的色譜用樹(shù)脂上離解靶物質(zhì)的液體。洗脫液在不使耙物質(zhì)不可逆變性的條件下將其離解。典型的洗脫液是色譜
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公知的，其可以具有較高濃度的鹽，游離親和配體或類(lèi)似物，或其它促進(jìn)所述靶物質(zhì)從所述色譜用樹(shù)脂離解的物質(zhì)。"洗脫條件"是指加在被靶物質(zhì)結(jié)合的色譜用樹(shù)脂上的，從所述色譜用樹(shù)脂上離解所述靶物質(zhì)的處理?xiàng)l件，例如，使被所述靶物質(zhì)結(jié)合的色譜用樹(shù)脂與洗脫液或洗脫緩沖液接觸，以產(chǎn)生這種離解。本文中的"清洗液"或"清洗緩沖液"是指用來(lái)在純化過(guò)程完成之后洗滌色譜用樹(shù)脂的液體。清洗液可以含有洗滌劑，病毒滅活劑或相對(duì)高濃度的鹽，其pH可以比純化過(guò)程中所使用的液體高或低。其目的是凈化色譜用樹(shù)脂，以使其隨時(shí)可以再使用。典型的清洗液是色譜
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公知的。本文中的"保存液"或"保存緩沖液"是指色譜用樹(shù)脂在兩次使用之間懸浮于其中的液體。除了緩沖離子外，保存液還含有殺微生物劑或其它防腐劑。這類(lèi)保存液在色譜
技術(shù)領(lǐng)域：
是公知的。在多個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于通過(guò)將A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑上回收所述蛋白的過(guò)程，從包括所述蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化具有Fc區(qū)蛋白的方法。適宜的Fc結(jié)合劑包括但不限于A蛋白和G蛋白。本發(fā)明的特征在于純化A/3結(jié)合蛋白，尤其是抗A/3抗體的過(guò)程。例示性純化過(guò)程包括親和色譜步驟。所述親和色譜步驟可以是連續(xù)的，不連續(xù)的，或?yàn)閮烧叩慕M合。例如，親和色譜步驟可以作為不連續(xù)過(guò)程，例如，分批過(guò)程來(lái)進(jìn)行。親和色譜是耙化合物發(fā)生生物選擇性吸附，隨后從固定配體上回收的過(guò)程。該過(guò)程允許靶化合物的高度特異性和有效的純化。該過(guò)程需要使用具有適當(dāng)選擇性，在允許在溫和條件下回收的條件下，通常以10—4-10—s的離解常數(shù)范圍結(jié)合耙化合物(例如，抗A/3抗體)的配體(例如，F(xiàn)c結(jié)合劑)。所述配體通常被固定在珠狀和多孔基質(zhì)上，所述基質(zhì)可以是柱填料或分批吸附介質(zhì)的形式。優(yōu)選結(jié)合劑是A蛋白。A蛋白結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)。A蛋白由6個(gè)區(qū)組成，其中5個(gè)區(qū)結(jié)合IgG。其以高親和力與人IgGpIgG2和IgG4及小鼠IgG^，IgGa和IgG3結(jié)合。A蛋白以中等親和力與人IgD，IgM，IgA和IgE及小鼠IgG,結(jié)合。作為親和配體，A蛋白被使這些區(qū)可以自由結(jié)合的方式固定在基質(zhì)上。一分子的固定化A蛋白可以結(jié)合至少兩分子的IgG。天然和重組形式的A蛋白對(duì)IgG的Fc區(qū)共有類(lèi)似的特異性。重組A蛋白(rProteinA)可以改造成包括，例如，C末端半胱氨酸，并且可以通過(guò)硫酯偶聯(lián)固定至固相基質(zhì)上。這種偶聯(lián)導(dǎo)致A蛋白的結(jié)合能力增加。其它結(jié)合劑有G蛋白。G蛋白對(duì)IgG具有特異性，其以高親和力與人IgG,，IgG2，IgG3和IgG4及小鼠IgG,和IgG3結(jié)合。G蛋白PLUS對(duì)人IgG4和小鼠IgG2a，IgG化和IgG3具有中度親和力。重組G蛋白(rProteinG)可以被工程化成刪除天然蛋白的白蛋白結(jié)合區(qū)。重組G蛋白含有2個(gè)Fc結(jié)合區(qū)。其它結(jié)合劑有A/G蛋白。A/G蛋白是兼?zhèn)銩蛋白和G蛋白的IgG結(jié)合特性的基因工程化蛋白。A/G蛋白是由非病原形式的芽胞桿菌分泌的基因融合產(chǎn)物。A/G蛋白含有4個(gè)來(lái)自A蛋白和2個(gè)來(lái)自G蛋白的Fc結(jié)合域。A/G蛋白并不象A蛋白一樣具有pH依賴(lài)性，然而在別的方面卻具有A蛋白和G蛋白的累加特性。A/G蛋白與所有人IgG亞類(lèi)結(jié)合，尤其適合亞類(lèi)未確定的多克隆或單克隆IgG抗體的純化。另外，A/G蛋白還與IgA，IgE，IgM禾卩(在較小程度上)IgD結(jié)合。A/G蛋白還與所有小鼠IgG亞類(lèi)結(jié)合良好，尤其適合IgG亞類(lèi)小鼠單克隆抗體的純化，而不受到IgA，IgM和鼠血清白蛋白的干擾(參見(jiàn)，例如，Sikkema.(1989)Amer.Biotech.Lab7,42.)。個(gè)別小鼠單克隆抗體亞類(lèi)對(duì)嵌合A/G蛋白的親和力大于對(duì)A蛋白或G蛋白的親和力(參見(jiàn)，例如，Eliassonetal.(1988)J.Biol.Chem.263，4323-4327.)。在本發(fā)明中，固定化Fc結(jié)合劑(例如，A蛋白)用二價(jià)陽(yáng)離子鹽溶液洗滌，以除去雜質(zhì)。尤其是，我們發(fā)現(xiàn)，作為重組抗體表達(dá)技術(shù)的結(jié)果產(chǎn)生的非預(yù)期雜質(zhì)可以通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子鹽洗滌步驟除去。本發(fā)明的方法在親和色譜和二價(jià)陽(yáng)離子洗滌步驟之后可以任選地包括純化步驟。隨后的純化步驟可以包括離子交換色譜步驟和/或疏水相互作用色譜(HIC)步驟。隨后的色譜步驟可以是連續(xù)的，不連續(xù)的(例如，分批過(guò)程)，或者為兩者的組合。離子交換色譜根據(jù)蛋白總電荷的不同而分離分子。為了結(jié)合，靶蛋白必須帶有與樹(shù)脂上所連官能團(tuán)相反的電荷。例如，通常帶有總正電荷的抗體將與含有帶負(fù)電荷官能團(tuán)的陽(yáng)離子交換劑結(jié)合良好。由于這種相互作用是離子性的，因此結(jié)合必須在低離子強(qiáng)度條件下進(jìn)行。洗脫通過(guò)增加離子強(qiáng)度以破壞所述離子相互作用，或通過(guò)改變所述蛋白的pH而完成。離子交換色譜依靠蛋白的電荷而將其分離，而疏水相互作用色譜則利用了一些蛋白的疏水特性。蛋白上的疏水基團(tuán)與柱上的親水基團(tuán)結(jié)合。蛋白的疏水性越強(qiáng)，其與柱的結(jié)合就越強(qiáng)。HIC步驟除去了，例如，由宿主細(xì)胞衍生的雜質(zhì)(例如，DNA及其它高和低分子量產(chǎn)物相關(guān)種類(lèi))。如本文所述，進(jìn)一步的純化步驟可以包括病毒去除步驟及超濾和/或滲濾步驟。在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是具有與Fc結(jié)合劑的Fc受體結(jié)合的Fc區(qū)的抗體或抗體融合蛋白。用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌Fc結(jié)合劑使得雜質(zhì)，例如，感興趣的蛋白(例如，源液中的耙物質(zhì))的連讀變異體和含有恒定區(qū)的片段(包括LMW和UDB類(lèi))被大量去除。本發(fā)明的方法包括一個(gè)或多個(gè)色譜分離步驟，另外，還可以包括一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟，用于從源液的雜質(zhì)中分離A/3結(jié)合蛋白("耙蛋白，，)。例如，在源液與FC結(jié)合劑接觸前，可以將所述源液過(guò)濾，離心或以其它方式處理，以除去顆粒碎屑等。例如，采用重組技術(shù)，蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)，壁膜間隙中產(chǎn)生，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果蛋白在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，則可以通過(guò)例如，離心或超濾除去顆粒碎屑，即，宿主細(xì)胞或溶解的碎片。在蛋白分泌入培養(yǎng)基的情況下，重組宿主細(xì)胞可以通過(guò)例如，切向流過(guò)濾從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。在多種實(shí)施方案中，含有靶蛋白的源液與FC結(jié)合劑(優(yōu)選固定在固相上，并用適宜緩沖液平衡)以使得所述靶蛋白吸附到所述Fc結(jié)合劑(例如，固定化Fc結(jié)合劑)上的方式接觸。源液與Fc結(jié)合劑(例如，固定化Fc結(jié)合劑)在上樣緩沖液中接觸，所述上樣緩沖液可以與平衡緩沖液相同。因?yàn)楹须s質(zhì)的源液流過(guò)固相，靶蛋白被吸附到Fc結(jié)合劑上，而其它多種雜質(zhì)(如所述靶蛋白在重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)的宿主細(xì)胞蛋白，或由其它過(guò)程衍生的雜質(zhì))則流過(guò)或非特異性地結(jié)合在固相上。在多種實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)合劑是A蛋白，并且平衡緩沖液可以是含0.15MNaCl的20mMTris(pH7.5)。其它適宜的平衡緩沖液包括，例如，具有生理濃度，如范圍為約0.5mM至約100mM(例如，10mM，20mM，50mM等)的濃度和生理鹽濃度(例如，約0.15mMNaCl)及5.0-9.0的pH的BIS，HEPES等。固相優(yōu)選為用于固定Fc結(jié)合劑的瓊脂糖(例如，Sepharose)珠或顆粒。在多種實(shí)施方案中，柱被涂覆以試劑，如甘油，以減少或防止對(duì)柱的非特異性附著。在多種實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)合劑是A蛋白。可購(gòu)自AmershamBiosciences的rmpA蛋白SepharoseTM快速(FF)柱是用于本特征方法的適宜A蛋白柱的例子。然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖洗滌液洗滌Fc結(jié)合劑，以除去固相或Fc結(jié)合劑上結(jié)合的蛋白變異體類(lèi)。尤其是，我們發(fā)現(xiàn)，二價(jià)陽(yáng)離子鹽洗滌步驟的應(yīng)用可以除去大量的非預(yù)期雜質(zhì)。具體地說(shuō)，我們發(fā)現(xiàn)，抗A/3抗體的內(nèi)含子連讀變異體，低分子量變異體和二硫鍵缺失變異體可以用二價(jià)陽(yáng)離子鹽洗漆除去。此外，宿主細(xì)胞蛋白(HCP)和DNA也可以用二價(jià)陽(yáng)離子鹽洗滌除去。在多種實(shí)施方案中，洗滌液中的二價(jià)陽(yáng)離子鹽包括離液序列高的鹽。適宜的離液序列高的鹽的例子包括但不限于氯化鈣(CaCl2)，氯化鎳(NiCl2)和氯化鎂(MgCl2)。雖然在洗滌液中可以?xún)H存在單一的二價(jià)陽(yáng)離子鹽，但在多種實(shí)施方案中，可以使用兩種或兩種以上的二價(jià)陽(yáng)離子鹽。在多種實(shí)施方案中，采用除含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的洗滌液之外的洗滌液除去雜質(zhì)。例如，在多種實(shí)施方案中，在用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的洗滌液洗滌Fc結(jié)合劑之前，之后或之前和之后都用含有20-50mMTris，0.75-2.0MNaCl，pH為5.0-9.0的溶液和/或含有10mMTris，pH為7.5的溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑。在多種實(shí)施方案中，二價(jià)陽(yáng)離子鹽優(yōu)選以約0.5M至約2.5M的濃度加入到pH范圍為約5至約9，優(yōu)選約7至約8的pH緩沖液中。二價(jià)陽(yáng)離子鹽的優(yōu)選濃度包括但不限于0.6M，2.0M和2.5M。適于該目的的緩沖液包括但不限于濃度為20-50mM的Tris或醋酸鹽緩沖液。在洗滌步驟之后，靶蛋白從Fc結(jié)合劑上回收。這通常用適宜的洗脫緩沖液完成。靶蛋白可以用例如，低pH，例如，范圍為約2至約6.5，優(yōu)選約2.5至約3.5的洗脫緩沖液從柱上洗脫。在多種實(shí)施方案中，這樣回收的靶蛋白可以在藥學(xué)上可接受的載體中進(jìn)行配制，用于各種診斷，治療或其它已知的這類(lèi)分子的用途。在多種實(shí)施方案中，被洗脫的靶蛋白制品在Fc結(jié)合劑色譜步驟之后可以進(jìn)行其它純化步驟。例如，例示性的進(jìn)一步的純化步驟包括但不限于陰離子交換色譜，陽(yáng)離子交換色譜，疏水相互作用色譜(HIC)，磷灰石色譜，透析，親和色譜(包括固定化金屬親和色譜)，分子排阻色譜，硫酸銨沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)，色譜聚焦，超濾，滲濾和凝膠過(guò)濾。在多種實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)合劑色譜步驟后跟隨有陰離子交換色譜和HIC步驟。在多種實(shí)施方案中，所述色譜步驟后還跟隨著病毒過(guò)濾步驟，超濾/滲濾步驟和/或微生物污染物過(guò)濾步驟。在多種實(shí)施方案中，這些另外的色譜步驟可以在所述Fc結(jié)合劑色譜步驟之前進(jìn)行。在多種實(shí)施方案中，純化A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體的方法從將所述靶蛋白吸附到包括固定在固相上的A蛋白的Fc結(jié)合劑上開(kāi)始，然后用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述A蛋白上回收所述蛋白，以產(chǎn)生第一洗脫池。在多種實(shí)施方案中，所述純化過(guò)程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂與所述第一洗脫池以使得雜質(zhì)被吸附在所述樹(shù)脂上，而所述靶蛋白不吸附至樹(shù)脂上的方式接觸，而對(duì)所述第一洗脫池進(jìn)行陰離子交換色譜。因此，所述靶蛋白可以從流過(guò)的液體中回收，以產(chǎn)生第二洗脫池。在多種實(shí)施方案中，所述陰離子交換色譜步驟進(jìn)一步包括用緩沖洗滌液洗滌所述陰離子交換樹(shù)脂，以回收至少一部分被吸附的靶蛋白，然后將其與所述第二洗脫池合并?；蛘撸龅谝幌疵摮乜梢耘c陰離子交換樹(shù)脂以抗體被吸附，卻允許任何雜質(zhì)流過(guò)這樣一種方式接觸，然后任選地進(jìn)行洗滌和洗脫被吸附的抗體。在多種實(shí)施方案中，所述純化過(guò)程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過(guò)將所述靶蛋白吸附至疏水相互作用樹(shù)脂(例如，經(jīng)疏水配體官能化的固相)上，用離子強(qiáng)度幾乎不洗脫所述耙蛋白的緩沖洗滌液洗滌所述疏水相互作用樹(shù)脂，然后在第三洗脫池上回收所述靶蛋白(通常用離子強(qiáng)度低至足以使所述靶蛋白從所述疏水相互作用樹(shù)脂上解吸附的洗脫緩沖液)，而對(duì)所述第二洗脫池進(jìn)行疏水相互作用色譜(HIC)?；蛘?，所述第二洗脫池可以與所述HIC柱以所述靶蛋白不被吸附的方式接觸，從而回收流過(guò)的靶蛋白作為第三洗脫池。在多種實(shí)施方案中，所述純化過(guò)程包括一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾步驟，例如，為了除去病毒，濃縮和緩沖含有靶蛋白的溶液，以及去除微生物污染物的過(guò)濾步驟。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包括A0結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體的方法，其中所述雜質(zhì)包括一種或多種IRT變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了源液中IRT變異體水平約2倍至約20倍的降低。優(yōu)選IRT變異體水平降低至少5倍，更優(yōu)選IRT變異體水平降低至少10倍。例如，在具有約3-5%化丁抗體變異體(為總的IRT抗體變異體類(lèi)占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，IRT抗體變異體類(lèi)可以降低至約0.3%至約0.5%。在多種實(shí)施方案中，IRT變異體類(lèi)被降低至小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%禾口/或小于0.1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過(guò)程中，IRT變異體被降低至總IRT變異體類(lèi)占所述源液的百分比小于1%，小于0.8%,小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%禾口/或小于0.1%。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包括A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A0抗體的方法，其中所述雜質(zhì)包括一種或多種LMW變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了源液中LMW變異體水平約2倍至約20倍的降低。優(yōu)選LMW變異體水平降低至少5倍，更優(yōu)選LMW變異體水平降低至少10倍。例如，在具有約3-5。/。LMW抗體變異體(為總的LMW抗體變異體類(lèi)占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，LMW抗體變異體類(lèi)可以降低至約0.3%至約0.5%。在多種實(shí)施方案中，LMW變異體類(lèi)被降低至小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%和/或小于0.1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過(guò)程中，LMW變異體被降低至總LMW變異體類(lèi)占所述源液的百分比小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%和/或小于0.1%。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包括A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗抗體和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化A/3結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗A/3抗體蛋白的方法，其中所述雜質(zhì)包括一種或多種UDB變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法提供了源液中UDB變異體水平約2倍至約20倍的降低。優(yōu)選UDB變異體水平降低至少5倍，更優(yōu)選UDB變異體水平降低至少10倍。例如，在具有約20。/。UDB抗體變異體(為總的UDB抗體變異體類(lèi)占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，UDB抗體變異體類(lèi)可以降低至約10%至約2%。在多種實(shí)施方案中，UDB變異體類(lèi)被降低至小于20%，小于15%，小于10%，小于5%，小于2%或小于1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過(guò)程中，UDB變異體被降低至總UDB變異體類(lèi)占所述源液的百分比小于小于20%，小于15%，小于10%，小于5%，小于2%或小于1%。同樣，例如，在具有約3-5y。UDB抗體變異體(為總的UDB抗體變異體類(lèi)占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，UDB抗體變異體類(lèi)可以降低至約0.3%至約0.5%。在多種實(shí)施方案中，UDB變異體類(lèi)被降低至小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%和/或小于0.1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過(guò)程中，UDB變異體被降低至總UDB變異體類(lèi)占所述源液的百分比小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%禾口/或小于0.1%。用于本發(fā)明的純化方法的A/3結(jié)合蛋白本文所述將根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化的A/3結(jié)合蛋白，例如，抗A/3抗體可以采用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括例如，合成技術(shù)(如重組技術(shù)和肽合成或這些技術(shù)的組合)制備，或者分離自所述蛋白的內(nèi)生性來(lái)源。在多種實(shí)施方案中，所述抗體可以是，例如，多克隆抗體制品，單克隆抗體，重組抗體，嵌合抗體，人源化抗體或人抗體。產(chǎn)生抗體的技術(shù)在下文中描述。在其它實(shí)施方案中，A/3結(jié)合蛋白可以是抗體融合蛋白，其包括與能結(jié)合A^的蛋白或多肽的一部分融合的抗體Fc區(qū)?？贵w融合蛋白的制備也在下文中描述。多克隆抗體多克隆抗體可以通過(guò)用免疫原免疫適宜的受試者來(lái)制備。免疫受試者的抗體效價(jià)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)用固定化靶抗原，隨著時(shí)間的推移進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如果需要，可以將耙向所述耙抗原的抗體分子從哺乳動(dòng)物(例如，從血液)中分離出來(lái)，并通過(guò)公知技術(shù)，如A蛋白瓊脂糖色譜進(jìn)一步純化，以獲得所述抗體，例如，IgG，片段。在免疫后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，例如，當(dāng)抗抗原抗體的效價(jià)最高時(shí)，可以從所述受試者獲取產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如最初由Kohler和Milstein((1975)Nature256:495-497)描述的雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體(也參見(jiàn)，Brownetal.(1981)J.Immunol.127:539-46;Brownetal.(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83;Yehetal.(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:2927-31;和Yehetal.(1982)Int.J.Cancer29:269-75)。嵌合多克隆抗體的制備請(qǐng)參見(jiàn)Buechler等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,420,113。單克隆抗體許多用于融合淋巴細(xì)胞和無(wú)限增殖化細(xì)胞系的公知方案中的任何一種都可以應(yīng)用于產(chǎn)生單克隆抗體的目的(參見(jiàn)，例如，G.Galfreetal.(1977)Nature266:55052;Gefteretal.SomaticCellGenet,上文已弓l用；Lerner,YaleJ.Biol.Med.，上文已引用；Kenneth,MonoclonalAntibodies上文已引用)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，這些方法的許多變體也將是有用的。通常，無(wú)限增殖細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)由與所述淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物種類(lèi)衍生而來(lái)。例如，鼠雜交瘤可以通過(guò)用無(wú)限增殖化小鼠細(xì)胞系融合經(jīng)本發(fā)明的免疫原制品免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞而制得。優(yōu)選無(wú)限增殖細(xì)胞系是對(duì)含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基("HAT培養(yǎng)基")敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。許多骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種都可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伙伴，例如，P3-NSl/l-Ag4-l，P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可獲自ATCC。通常，用聚乙二醇("PEG")將對(duì)HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合至小鼠脾細(xì)胞。然后用HAT培養(yǎng)基對(duì)該融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇，所述HAT培養(yǎng)基殺死未融合及非生產(chǎn)性己融合骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞在數(shù)天后由于其未轉(zhuǎn)化而死亡)。采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析法，通過(guò)從所述雜交瘤培養(yǎng)上清液中篩選結(jié)合靶抗原的抗體而檢測(cè)產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。重組抗體除了制備分泌單克隆抗體的雜交瘤外，單克隆抗體還可以通過(guò)用耙抗原篩選重組免疫球蛋白組合文庫(kù)(例如，抗體噬菌體展示文庫(kù))，以由此分離結(jié)合所述靶抗原的免疫球蛋白文庫(kù)成員而得到鑒定和分離。產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒可以在市場(chǎng)上買(mǎi)到(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體洗脫，目錄號(hào)27-9400-01;禾PStratageneSurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。另外，尤其經(jīng)得起檢驗(yàn)的用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的例子可以在，例如，Ladneretal.美國(guó)專(zhuān)利No.5,223,409;Kangetal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO92/18619;Doweretal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO91/17271;Winteretal.PCT國(guó)際公開(kāi)WO92/20791;Marklandetal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO92/15679;Breitlingetal.PCT國(guó)際公開(kāi)WO93/01288;McCaffertyetal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO92/01047;Garrardetal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO92/09690;Ladneretal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO90/02809;Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Griffithsetal.(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMol.Biol.226:889-896;Clarksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)Pro"Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580;Garradetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)Nuc.AcidRes.19:4133-4137;Barbasetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982;禾BMcCaffertyetal.Nature(1990)348:552-554中找到。嵌合和人源化抗體另外，重組抗體，如可以采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備的包括人和非人部分的嵌合和人源化單克隆抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗體"是指包括至少一條人源化免疫球蛋白或抗體鏈(即，至少一條人源化輕鏈或重鏈)的免疫球蛋白或抗體。術(shù)語(yǔ)"人源化免疫球蛋白鏈"或"人源化抗體鏈"(即，"人源化免疫球蛋白輕鏈"或"人源化免疫球蛋白重鏈")是指具有包括基本上來(lái)自人免疫球蛋白或抗體的可變框架區(qū)和基本上來(lái)自非人免疫球蛋白或抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)(例如，至少1個(gè)CDR，優(yōu)選2個(gè)CDRs，更優(yōu)選3個(gè)CDRs)的可變區(qū)，并進(jìn)一步包括恒定區(qū)(例如，在輕鏈的情況下，至少l個(gè)恒定區(qū)或其部分，及在重鏈的情況下，3個(gè)恒定區(qū))的免疫球蛋白或抗體鏈(分別即，輕鏈和重鏈)。術(shù)語(yǔ)"人源化可變區(qū)"(例如，"人源化輕鏈可變區(qū)"或"人源化重鏈可變區(qū)")是指包括基本上來(lái)自人免疫球蛋白或抗體的可變框架區(qū)和基本上來(lái)自非人免疫球蛋白或抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)"基本上來(lái)自人免疫球蛋白或抗體"或"基本上人的"的意思是，當(dāng)為了對(duì)比的目的而與人免疫球蛋白或抗體氨基酸序列比對(duì)時(shí)，該區(qū)與人框架或恒定區(qū)序列享有至少80-90%，90-95%或95-99%的同一性(即，局部序列同一性)，從而允許例如，保守置換，共有序列置換，種系置換，回復(fù)突變等。保守置換，共有序列置換，種系置換，回復(fù)突變等的引入通常被稱(chēng)為人源化抗體或鏈的"最優(yōu)化"。術(shù)語(yǔ)"基本上來(lái)自非人免疫球蛋白或抗體"或"基本上非人的"表示具有與非人生物，例如，非人哺乳動(dòng)物的同一性為至少80-95%，優(yōu)選至少90-95%，更優(yōu)選96%，97%，98%或99%的免疫球蛋白或抗體序列。因此，人源化免疫球蛋白或抗體或人源化免疫球蛋白或抗體鏈的所有區(qū)或殘基，除CDRS夕卜，都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的相應(yīng)區(qū)或殘基基本同一。術(shù)語(yǔ)"相應(yīng)區(qū)"或"相應(yīng)殘基"是指當(dāng)?shù)谝缓偷诙蛄袨榱藢?duì)比的目的而進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，與所述第一氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)或殘基占有相同(即，等同)位置的所述第二氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)或殘基。術(shù)語(yǔ)"顯著同一"表示兩個(gè)多肽序列通過(guò)例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省間隙權(quán)重(defaultgapweights)進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，享有至少50-60%的序列同一性，優(yōu)選至少60-70%的序列同一性，更優(yōu)選至少70-80%的序列同一性，更優(yōu)選至少80-90%的序列同一性，更優(yōu)選至少90-95%的序列同一性，更優(yōu)選至少95%的序列同一性或更高(例如，99%的序列同一性或更高)。術(shù)語(yǔ)"基本同一"表示兩個(gè)多肽序列通過(guò)例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省間隙權(quán)重進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，享有至少80-90%的序列同一性，優(yōu)選至少90-95%的序列同一性，更優(yōu)選至少95%的序列同一性或更高(例如，99%的序列同一性或更高)。為了序列對(duì)比，通常將一個(gè)序列作為參考序列，與測(cè)試序列進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)采用某種序列對(duì)比算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，如果需要，指定序列運(yùn)算程序參數(shù)。然后序列對(duì)比算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的百分序列同一性。對(duì)比序列的最優(yōu)比對(duì)可以通過(guò)例如，Smith和Waterman的局部同源法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，Needleman和Wunsch的同源對(duì)比法(J,Mol.Biol.48:443(1970))，Pearson和Lipman的相似性搜索法(Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988))，這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(Wisconsin基因軟件包中的GAP,BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)，或目檢(參見(jiàn)Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology)進(jìn)行。適于石角定百分序列同一性和序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST法，其在Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403(1990)中有描述。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心(可通過(guò)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院NCBI互連網(wǎng)服務(wù)器公開(kāi)進(jìn)入)公開(kāi)獲得。盡管也可以使用用戶(hù)參數(shù)，但進(jìn)行序列對(duì)比時(shí)通常使用缺省程序參數(shù)。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序所使用的缺省值是字長(zhǎng)(W)為3，期望值(E)為10及BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見(jiàn)，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。優(yōu)選不同源的殘基位置是因保守氨基酸置換而不同。為了將氨基酸置換分為保守或非保守置換的目的，將氨基酸分類(lèi)如下I類(lèi)(疏水側(cè)鏈):leu，met，ala，val，leu，ile;II類(lèi)(中性親水側(cè)鏈):cys，ser，thr;III類(lèi)(酸性側(cè)鏈):asp，glu;IV類(lèi)(堿性側(cè)鏈):asn，gln，his，lys，arg;V類(lèi)(影響鏈取向的殘基)gly，pro;和VI類(lèi)(芳香族側(cè)鏈)trp，tyr，phe。保守置換涉及同類(lèi)氨基酸間的置換。非保守置換通過(guò)某一類(lèi)氨基酸的成員與另一類(lèi)氨基酸的成員交換來(lái)構(gòu)成。優(yōu)選人源化免疫球蛋白或抗體結(jié)合抗原的親和力在相應(yīng)非人源化抗體親和力的為3，4或5的因數(shù)內(nèi)。例如，如果非人源化抗體的結(jié)合親和力為1(T9M，人源化抗體將具有至少3xl0—8M，4xl(T8M，5xl(T8M或10—9M的結(jié)合親和力。當(dāng)免疫球蛋白鏈賦予完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)特異性結(jié)合特性或結(jié)合親和力時(shí)，則認(rèn)為其"直接結(jié)合抗原"。當(dāng)與包括無(wú)所述突變的等效鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)相比，所述突變(例如，回復(fù)突變)以至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的程度影響(例如，降低)包括所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)的結(jié)合親和力時(shí)，則認(rèn)為所述突變大大影響了重或輕鏈直接結(jié)合抗原的能力。如果突變對(duì)包括所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)的結(jié)合親和力的影響(例如，降低)僅為包括無(wú)所述突變的等效鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)的親和力的為2，3或4的因數(shù)時(shí)，則認(rèn)為其"幾乎不影響(例如，降低)鏈直接結(jié)合抗原的能力，，。術(shù)語(yǔ)"嵌合免疫球蛋白"或抗體是指可變區(qū)衍生自第一物種，并且恒定區(qū)衍生自第二物種的免疫球蛋白或抗體。嵌合免疫球蛋白或抗體可以通過(guò)例如基因工程由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建。如下文定義的那樣，術(shù)語(yǔ)"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗體"不希望包括嵌合免疫球蛋白或抗體。盡管人源化免疫球蛋白或抗體在其結(jié)構(gòu)上是嵌合的(即，包括來(lái)自一種以上蛋白的區(qū))，但如本文所述，其包含在嵌合免疫球蛋白或抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的其它特征(S卩，包括供體CDR殘基和受體框架殘基的可變區(qū))。這種嵌合和人源化單克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如，采用Robinsonetal.國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US86/02269;Akira,etal.歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)184,187;Taniguchi，M.，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)171,496;Morrisonetal.歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)173,494;Neubergeretal.PCT國(guó)際公開(kāi)No.WO86/01533;Cabillyetal.美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567;Cabillyetal.歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)125,023;Betteretal.(1988)Science240:1041-1043;Liuetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443;Liuetal.(1987)J.Immunol.139:3521-3526;Sunetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218;Nishimuraetal.(1987)Cane.Res.47:999-1005;Woodetal.(1985)Nature314:446-449;及Shawetal.(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559;Morrison,S,L.(1985)Science229:1202-1207;Oietal.(1986)BioTechniques4:214;Winter,美國(guó)專(zhuān)利5,225,539;Jonesetal.(1986)Nature321:552-525;Verhoeyanetal.(1988)Science239:1534;禾PBeidleretal.(1988)J.Immunol.141:4053-4060中所描述的方法。來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和噬菌體展示的人抗體或者，在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，現(xiàn)在可能產(chǎn)生經(jīng)免疫后能產(chǎn)生組成完全的人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)。例如，已有人描述，嵌合和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導(dǎo)致了對(duì)內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。這種種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移在抗原攻擊后導(dǎo)致了人抗體的產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,150,584;6,114,598;和5,770,429。完全人抗體也可以衍射自噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboometal.,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marksetal.，J.Mol.Biol"222:581-597(1991))。嵌合多克隆抗體也可以獲自噬菌體展示文庫(kù)(Buechler等，美國(guó)專(zhuān)利6,420,113)。雙特異性抗體和抗體軛合物雙特異性抗體(BsAbs)是對(duì)至少2個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。這種抗體可以衍生自全長(zhǎng)抗體和抗體片段(例如，F(xiàn)(ab)'2雙特異性抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域己知的。傳統(tǒng)的全長(zhǎng)雙特異性抗體的產(chǎn)生以?xún)蓷l免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)為基礎(chǔ)，其中所述兩條鏈具有不同的特異性(Millsteinetal.,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤)產(chǎn)生不同抗體分子的可能混合物(參見(jiàn)，WO93/08829和Trauneckeretal.,EMBOJ.,10:3655-3659(1991))。雙特異性抗體還包括交聯(lián)和"異共軛對(duì)配合物(heteroconjugate)"抗體。例如，異共軛對(duì)配合物中的一個(gè)抗體可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一個(gè)與生物素或其它有效負(fù)載偶聯(lián)。異共軛對(duì)配合物抗體可以用任何合適的交聯(lián)方法制備。適宜的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域公知的，并在美國(guó)專(zhuān)利No.4,676,980中與許多交聯(lián)技術(shù)一起被公開(kāi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以以化學(xué)方法或基因方法與有效負(fù)載，如反應(yīng)性，可檢測(cè)性或官能性分子，例如，免疫毒素軛合，產(chǎn)生抗體軛合物。這種有效負(fù)載包括，例如，免疫毒素，化學(xué)治療劑和放射性同位素，所有這些都是本領(lǐng)域公知的?？贵w融合蛋白用于本發(fā)明的具有Fc區(qū)的A/3結(jié)合蛋白可以是至少含有與能結(jié)合的非抗體蛋白或多肽融合的抗體的Fc部分的融合蛋白。這樣，便產(chǎn)生了能結(jié)合A^，并且具有Fc相關(guān)功能(如血清穩(wěn)定性，F(xiàn)c受體結(jié)合性等)的可溶性融合蛋白?？贵w融合蛋白(本領(lǐng)域中也稱(chēng)作Fc融合蛋白或Ig融合蛋白)可以采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備，并且在本領(lǐng)域中己有描述，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No.5,116,964，美國(guó)專(zhuān)利No.5,225,538，美國(guó)專(zhuān)利No.5,336,603和美國(guó)專(zhuān)利No.5,428,130，這些都是Capon等人的專(zhuān)利?？笰^抗體通常，本發(fā)明的抗體包括通過(guò)靶向A/3肽用于治療淀粉樣疾病(amyloidogenicdiseases)，尤其是阿耳茨海默氏病的多種抗體。本文中，術(shù)語(yǔ)"A/S抗體"，"抗A/5抗體"和"抗A/T可以互換使用，指與人淀粉樣前體蛋白(APP)，A/3蛋白或此兩者的一個(gè)或多個(gè)表位或抗原決定簇結(jié)合的抗體。例示性表位或抗原決定簇可以在APP內(nèi)找到，但優(yōu)選在APP的A/3肽內(nèi)找到。APP存在多個(gè)亞型，例如APP695，APP751和APP77G。APP內(nèi)的氨基酸根據(jù)APP77Q亞型的序列進(jìn)行編號(hào)(參見(jiàn)，例如，基因庫(kù)序列號(hào)P05067)。目前已知存在于人類(lèi)的APP的具體同種型的例子有Kanget.al.(1987)Nature325:733-736所述被命名為"正常"APP的含695個(gè)氨基酸的多肽；Ponteetal.(1988)Nature331:525-527(1988)和Tanzietal.(1988)Nature331:528-530所述含751個(gè)氨基酸的多肽；及Kitaguchiet.al.(1988)Nature331:530-532所述含770個(gè)氨基酸的多肽。作為不同體內(nèi)或原位分泌酶對(duì)APP蛋白酶解加工的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為40個(gè)氨基酸的"短型"A/5和長(zhǎng)度范圍為42-43個(gè)氨基酸的"長(zhǎng)型"A/3。短型A/34Q由APP的殘基672-711組成。長(zhǎng)型A/3，例如，A&2或A/43分別由殘基672-713或672-714組成。APP的疏水結(jié)構(gòu)域部分發(fā)現(xiàn)在A0的羧基端，并可能對(duì)A/3聚合的能力負(fù)責(zé)，尤其是在長(zhǎng)型的情況下。A/3肽可以在人和其它動(dòng)物，包括正常個(gè)體和患有淀粉樣病癥的個(gè)體的體液，例如腦脊液中找到，或者從其中純化出來(lái)。術(shù)語(yǔ)"/3淀粉樣蛋白"，"/3淀粉樣肽"，"/3淀粉狀蛋白"，"A/T和"A/3肽"在本文中可以互換使用。Ai3肽(例如，A/339，A/340，Ai841，A/342和AjS43)是APP的第39-43個(gè)氨基酸內(nèi)部約4kD的片段。例如，A/340由APP的殘基672-711組成，A]S42由APP的殘基672-713組成。A/3肽包括由APP的分泌酶裂解產(chǎn)生的肽和與所述裂解產(chǎn)物具有相同或基本上相同的序列的合成肽。A0肽可以衍生自多種來(lái)源，例如，組織，細(xì)胞系或體液(例如血清或腦脊液)。例如，A/3可以衍生自表達(dá)APP的細(xì)胞，如，例如Walshetal.，(2002),Nature,416,pp535-539中所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP717V—p的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。A/3制品可以采用先前所述方法(參見(jiàn)，例如，Johnson-Woodetal,(1997),Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1550)從組織源衍生?；蛘?，A/3肽可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法合成。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ieldsetal.,SyntheticPeptides:AUser'sGuide,ed.Grant,W.H.Freeman&Co.,NewYork,NY,1992,p77。因此，肽可以采用固相合成的自動(dòng)化Merrifield技術(shù)，用經(jīng)t-Boc或F-moc化學(xué)保護(hù)的a氨基，側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的氨基酸在例如460A或431型應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成器(AppliedBiosystemsPeptideSynthesizer)上合成。更長(zhǎng)的肽抗原可以采用公知的重組DNA技術(shù)合成。例如，可以合成或分子克隆編碼肽或融合肽的多核苷酸，并將其插入適宜的表達(dá)載體，用于適宜宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和異源表達(dá)。A/3肽還指由正?；虻膮^(qū)的突變產(chǎn)生的相關(guān)A/3序列。抗體與之結(jié)合的例示性表位或抗原決定簇可以在人淀粉樣前體蛋白(APP)內(nèi)找到，但優(yōu)選在APP的A/3肽內(nèi)找到。A/5內(nèi)的例示性表位或抗原決定簇位于A/3的N末端，中心區(qū)或C末端。"N末端表位"是位于或包括Ai3肽的N末端的表位或抗原決定簇。例示性N末端表位包括Ai3的氨基酸1-10或1-12內(nèi)的殘基，優(yōu)選來(lái)自A/342的殘基1—3，1-4，1-5，1-6，1-7，2-6，2-7，3-6或3-7。其它例示性N末端表位起始于A/3的殘基1-3，結(jié)束于A/3的殘基7-11。其它例示性N末端表位包括A0的殘基2-4，5，6，7或8，A/3的殘基3-5，6，7，8或9，或A/342的殘基4-7，8，9或10。"中心表位"是包括位于A]S肽的中心或中間部分的殘基的表位或抗原決定簇。例示性中心表位包括A/3的氨基酸13-28內(nèi)的殘基，優(yōu)選來(lái)自A/3的殘基14-27，15-26，16-25，17-24，18-23或19-22。其它例示性中心表位包括A/3的氨基酸16-24，16-23，16-22，16-21，18-21，19-21，19-22，19-23或19-24內(nèi)的殘基。"C末端"表位或抗原決定簇位于或包括A/3肽的C末端，并且包括A/3的氨基酸33-40，33-41或33-42內(nèi)的殘基。"C末端表位"是包括位于肽的C末端(例如，位于A/3的約氨基酸30-40或30-42內(nèi))的殘基的表位或抗原決定簇。其它例示性C末端表位或抗原決定簇包括A/3的殘基33-40或33-42。當(dāng)說(shuō)到某抗體與指定殘基，如A/33-7內(nèi)的表位結(jié)合時(shí)，其意味著所述抗體與含有所指定殘基(在此例子中即，A^3-7)的多肽特異性結(jié)合。這樣的抗體不一定與A/33-7內(nèi)的每一個(gè)殘基接觸。A/33-7內(nèi)的每單個(gè)氨基酸置換或缺失不一定顯著影響結(jié)合親和力。在多種實(shí)施方案中，抗體是末端特異性的。本文所用術(shù)語(yǔ)"末端特異性"是指與A/3肽的N末端或C末端殘基特異性結(jié)合，但不識(shí)別存在于包括所述殘基的更長(zhǎng)A/3類(lèi)或APP中的相同殘基的抗體。在多種實(shí)施方案中，Ai3抗體是"C末端特異性"的。本文所用術(shù)語(yǔ)"C末端特異性"的意思是特異性識(shí)別A/3肽的游離C末端的抗體。C末端特異性A/3抗體的例子包括識(shí)別結(jié)束于殘基40的A/3肽但不識(shí)別結(jié)束于殘基41，42和/或43的肽的抗體；識(shí)別結(jié)束于殘基42的A/3肽但不識(shí)別結(jié)束于殘基40，41和/或43的A/3肽的抗體；等。在一個(gè)實(shí)施方案中，A/3抗體可以是3D6抗體或其變異體，或10D5抗體或其變異體，兩者均在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20030165496Al，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20040087777A1，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO02/46237A3和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO04/080419A2中描述。對(duì)3D6和10D5抗體的說(shuō)明還可以在例如，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO02/088306A2和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO02/088307A2中找到。其它3D6抗體在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/303,478和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45614中描述。3D6是與位于人]S淀粉樣肽的N-末端表位，具體為殘基l-5特異性結(jié)合的單克隆抗體(mAb)。相比之下，10D5是與位于人/3淀粉樣肽中的N-末端表位，具體為殘基3-6特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生3D6單克隆抗體的細(xì)胞系(RB963D6.32.2.4)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2003年4月8日保藏在位于美國(guó)Manassas，VA20108的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為PTA-5130。產(chǎn)生10D5單克隆抗體的細(xì)胞系(RB4410D5.19.21)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2003年4月8日保藏在ATCC,保藏號(hào)為PTA-5129。例示性變異3D6抗體是那些具有例如，包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDN0:3或SEQIDNO:5的人源化輕鏈和包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的人源化重鏈的抗體。其它例示性變異3D6抗體是那些具有例如，人源化輕鏈氨基酸序列SEQIDNO:7和人源化重鏈氨基酸序列SEQIDNO:8的抗體。例示性變異10D5抗體是那些具有例如，包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:9或SEQIDNO:ll的人源化輕鏈和包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:10或SEQIDNO:12的人源化重鏈的抗體。其它例示性變異10D5抗體是那些具有例如，人源化輕鏈氨基酸序列SEQIDNO:13和人源化重鏈氨基酸序列SEQIDNO:14的抗體。這類(lèi)變異抗體在WO02/088307A2中進(jìn)一步描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20040082762A1和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO03/077858A2中所述12B4抗體或其變異體。12B4是與位于人/3淀粉樣肽的N末端表位，具體為殘基3-7特異性結(jié)合的mAb。例示性變異12B4抗體是那些具有例如，包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的人源化輕鏈(或輕鏈)和包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:16，SEQIDNO:18或SEQIDNO:19的人源化重鏈的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050118651Al，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/303,478，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO04/108895A2和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45614中所述12A11抗體或其變異體。12A11是與位于人/淀粉樣肽的N末端表位，具體為殘基3-7特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生12A11單克隆抗體的細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2005年12月13日保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-7271。例示性變異12A11抗體是那些具有例如，包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:20的人源化輕鏈和包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:21，SEQIDNO:22，SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:31，SEQIDNO:32，SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，SEQIDNO:35，SEQIDNO:36，SEQIDNO:37，SEQIDNO:38，SEQIDNO:39，SEQIDNO:40或SEQIDNO:41的人源化重鏈的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/305,899和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45860中所述6C6抗體或其變異體。6C6是與位于人/3淀粉樣肽的N末端表位，具體為殘基3-7特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生6C6抗體的細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2005年11月1日保藏在ATCC，登錄號(hào)為PTA-7200。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/305,899和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45860中所述2H3抗體。2H3是與位于人/3淀粉樣肽的N末端表位，具體為殘基2-7特異性結(jié)合的mAb。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/305,899和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45860中所述3A3抗體。3A3是與位于人/3淀粉樣肽的N末端表位，具體為殘基3-7特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生抗體2H3禾B3A3，分別具有ATCC登錄號(hào)PTA-7267和PTA-7269的細(xì)胞系在2005年12月13日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/304,986和標(biāo)題為"識(shí)別/3淀粉樣肽的人源化抗體"的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45515中所述15C11抗體或其變異體。15C11是與位于人/5淀粉樣肽的中心表位，具體為殘基19-22特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生15C11單克隆抗體的細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2005年12月13日保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-7270。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050249725A1和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO01/62801A2中所述266抗體。266是與位于人/3淀粉樣肽的中心表位，具體為殘基16-24特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生266單克隆抗體的細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2004年7月20日保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-6123。例示性變異266抗體是那些具有例如，包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的人源化輕鏈和包括可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:43或SEQIDNO:45的人源化重鏈的抗體。其它例示性變異266抗體是那些具有例如，人源化輕鏈氨基酸序列SEQIDNO:46和人源化重鏈氨基酸序列SEQIDNO:47的抗體。這類(lèi)變異抗體在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20050249725A1和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO01/62801A2中進(jìn)一步描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/305,899和標(biāo)題為"用于提高認(rèn)知的A/3抗體"的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45860中所述2B1抗體或其變異體。2B1是與位于人]8淀粉樣肽的中心表位，具體為殘基19-23特異性結(jié)合的mAb。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/305,899和標(biāo)題為"用于提高認(rèn)知的A/3抗體"的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45860中所述1C2抗體或其變異體。1C2是與位于人)S淀粉樣肽的中心表位，具體為殘基16-23特異性結(jié)合的mAb。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/304,986和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US05/45515中所述9G8抗體或其變異體。9G8是與位于人/3淀粉樣肽的中心表位，具體為殘基16-21特異性結(jié)合的mAb。產(chǎn)生抗體2B1，1C2和9G8的細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2005年11月1日保藏在ATCC，登錄號(hào)分別為PTA-7202，PTA-7199和PTA-7201。用于本發(fā)明的與位于人/3淀粉樣肽的C末端表位特異性結(jié)合的抗體包括但不限于標(biāo)題為"/3A4肽的特異性單克隆抗體369.2B"的美國(guó)專(zhuān)利No.5,786,180中所述369.2B。對(duì)用于本發(fā)明的抗體的進(jìn)一步說(shuō)明可以在例如，Bussiereetal.,Am.J.Pathol.165(3):987-95(2004)，BardetaLPNAS100(4):2023-8(2003)，Kajkowskietal"J.Biol.Chem.276(22):18748-56(2001》Gamesetal.，Ann.NYAcad.Sci.920:274-84(2000)，Bardetal.,Nat.Med.6(8):916-9(2000)和標(biāo)題為"在患有阿耳茨海默氏病，唐恩綜合征，腦淀粉樣血管病或輕度認(rèn)知功能損傷的受試者中實(shí)現(xiàn)認(rèn)知功能的快速提高，包括施予抗A/5抗體"的國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO03015691A2中找到。對(duì)用于本發(fā)明的抗體的進(jìn)一步說(shuō)明可以在例如，Balesetal.(摘要P4-396,第S587頁(yè)，呈現(xiàn)于海報(bào)P4:療法和治療策略-基于淀粉樣蛋白的治療策略)和Zameeretal.(摘要P4-420，第S593頁(yè)，呈現(xiàn)于海報(bào)P4:療法和治療策略-基于淀粉樣蛋白的治療策略)中找到。用于本發(fā)明的抗體可以重組或合成產(chǎn)生。例如，抗體可以通過(guò)重組細(xì)胞法，用例如，CHO細(xì)胞，NIH3T3細(xì)胞，PER.C6⑧細(xì)胞，NS0細(xì)胞，VERO細(xì)胞，雞胚成纖維細(xì)胞或BHK細(xì)胞產(chǎn)生。另外，保留了結(jié)合A^肽的主要功能特性的修飾很少的抗體也為本發(fā)明所涵蓋。在特定實(shí)施方案中，所述抗體是選擇性結(jié)合A/3肽的人源化抗A/3肽3D6抗體。更具體地是，人源化抗A)3肽3D6抗體被設(shè)計(jì)成與位于人/3淀粉樣1-40或1-42肽的NH2-末端表位，例如，氨基酸殘基l-5特異性結(jié)合，所述人/3淀粉樣1-40或1-42肽在腦部(例如，在阿耳茨海默氏病患者中)的沉著斑塊中被發(fā)現(xiàn)。例示性人源化抗A/3肽抗體是人源化3D6版本2(h3D6v2)。根據(jù)相應(yīng)表達(dá)載體的DNA序列預(yù)測(cè)的h3D6v2輕和重鏈的完全氮基酸序列顯示在圖1中(其中殘基編號(hào)從輕和重鏈的NH2末端編以殘基號(hào)1開(kāi)始)，分別為SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。由重鏈DNA序列編碼的最后的氨基酸殘基Lys,未曾在成熟，分泌型的h3D6v2中觀測(cè)到，在不希望受到任何特定理論的限制的前提下，推測(cè)其可能在CHO細(xì)胞蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)加工期間被去除。因此，h3D6v2重鏈的COOH末端任選為Gly448。在重組和得自血漿的抗體中觀察到COOH末端賴(lài)氨酸加工，這未影響其功能(Harris(1995)J.Chromatogr.A.705:129-134)。純化的h3D6v2通過(guò)向公知含有單個(gè)N-糖基化共有位點(diǎn)的重鏈的Fc部分加入N-連接聚糖而進(jìn)行翻譯后修飾。N-糖基化位點(diǎn)展示出3種主要的常見(jiàn)于哺乳動(dòng)物IgG蛋白的類(lèi)似N-糖基化位點(diǎn)的復(fù)雜二天線中性寡糖結(jié)構(gòu)。其它例示性人源化抗A/3肽抗體是人源化3D6版本1(hu3D6vl)，具有圖1中所示序列，但輕鏈的第1位由D置換為Y，重鏈的第75位(根據(jù)Kabat編號(hào)方式為第74位)由S置換為A，重鏈的第78位(根據(jù)Kabat編號(hào)方式為第77位)由T置換為S，重鏈的第93位(根據(jù)Kabat編號(hào)方式為第89位)由V置換為L(zhǎng)。本發(fā)明的多個(gè)方面和實(shí)施方案將通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例只是為了例證而不是為了限制而提供。實(shí)施例下列實(shí)施例僅為了說(shuō)明性的目的而提供。實(shí)施例用2種不同抗單克隆抗體提供。描述了6個(gè)各自代表抗體與雜質(zhì)去除的組合的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。材料和方法除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施通常采用化學(xué)，分子生物學(xué)，重組DNA技術(shù)，免疫學(xué)(特別是，例如，免疫球蛋白技術(shù))的常規(guī)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)。參見(jiàn)，例如，Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);antibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology),510,Paul,S.,HumanaPr(1996);antibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169),McCafferty,Ed"IrlPr(1996);Antibodies:ALaboratoryManual,Harlowetal"C.S.H丄.Press,Pub.(1999);CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal"JohnWiley&Sons(1992);Bousseetal.,ProteinSizingonaMicrochip,Anal.Chem.73，1207-1212(2001);Knappetal"CommercializedandEmergingLab-on-a-ChipApplications;In:Proceedingsofthe/xTAS2001Symposium,Ramsey,J.M.&vandenBerg,A.,7-10(2001);禾口Mhatreetal"Strategiesforlocatingdisulfidebondsinamonoclonalantibodyviamassspectrometry,RapidCommun.MassSpectrom,13(24)2503-2510(1999)。耙蛋白的產(chǎn)生靶蛋白可以用例如，在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生。包含感興趣的抗體的條件培養(yǎng)基在生產(chǎn)用生物反應(yīng)器中產(chǎn)生。所得產(chǎn)物收集，并用任何適當(dāng)?shù)某吻宀襟E，例如，微濾和0.22/mi膜過(guò)濾或離心，或襯墊過(guò)濾和0.22/mi膜過(guò)濾使之澄清。耙蛋白的純化這里所例示的耙單克隆抗體(AAB或12A11)的純化由A蛋白親和色譜上耙分子的俘獲組成。這可以由rmpA蛋白SepharoseTM快速流色譜，A蛋白SepharoseTM快速流色譜或MabSelectA蛋白色譜組成。然后如各實(shí)驗(yàn)所述洗滌樹(shù)脂，洗脫產(chǎn)物并測(cè)試雜質(zhì)水平。靶蛋白的分析用反相HPLC(RP-HPLC)測(cè)定AAB單克隆抗體樣品中存在的IRT的量。用分子排阻色譜法(SEC-HPLC)測(cè)定單體蛋白(單體IgG)，高分子量(HMW)和低分子量(LMW)類(lèi)的百分比。進(jìn)行變性SEC-HPLC分析，以確定樣品中二硫鍵缺失(UDB)類(lèi)的相對(duì)量。供試樣品中的HCP水平用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定。分析測(cè)定IRT和UDB反相HPLC(AABIRT分析)如下法進(jìn)行RP-HPLC。各樣品在4(TC于2.5mMDTT存在下孵育60min，使二硫化物還原。在室溫于5.5mM碘乙酸存在下孵育，完成垸基化。還原和垸基化之后，所有樣品均用5/zl1M的DTT淬滅。該測(cè)定法的定量限是0.5%。將約40pg的各還原，垸基化后的樣品注入POROSRl/HRP-HPLC柱，在下列條件下運(yùn)行70min:柱PorosRl/HRP-HPLC柱溫50°C流動(dòng)相A:0.1%(w/v)TFA的水溶液流動(dòng)相B:0.1%(w/v)TFA的95%乙腈溶液流速1.0mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)217nm運(yùn)行時(shí)間70minutes進(jìn)樣重復(fù)3次，每次40Mg梯度時(shí)間表列于表1中。表l:RP-HPLC法的梯度時(shí)間表<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>dSEC-HPLC(AABUDB分析)變性SEC-HPLC如下法進(jìn)行。用于變性SEC測(cè)定的樣品的預(yù)處理涉及最終濃度為200yg/mL蛋白，3M胍鹽酸鹽和100mMpH7.4的Tris的試劑/樣品混合物。樣品在80。C加熱20min，同時(shí)在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中混合。對(duì)于本試驗(yàn)，采用了2個(gè)對(duì)照來(lái)確定UDB水平。用含有低和高水平UDB的內(nèi)標(biāo)作為對(duì)照。色譜/分析條件如下.-柱TosohBioSepG3000SWxl柱溫室溫流動(dòng)相3M胍鹽酸鹽，25mMNaP04，pH6.8梯度等梯度流速0.5mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)280nm運(yùn)行時(shí)間50min進(jìn)樣50mL(io將)，重復(fù)3次實(shí)施例l:用于去除IRT的洗滌緩沖液的對(duì)比在本實(shí)驗(yàn)中，含有抗A/3單克隆抗體AAB的不純?nèi)芤和ㄟ^(guò)吸附到A蛋白柱上，然后用含有CaCl2，MgCl2，NaCl或丙二醇的洗滌緩沖液進(jìn)行第一次洗滌而得到純化。含有所述單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的rmpA蛋白SepharoseFF柱(8.9mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。試驗(yàn)1中所述所有rmpA蛋白SepharoseFF色譜步驟均采用下列條件(例外情況在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明中指出)。柱尺寸-1.0cmxll.4cm操作流速-150cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(l倍柱體積)洗滌1-可變(見(jiàn)表2)，但1號(hào)運(yùn)行除外，其未進(jìn)行洗滌1洗滌2-20mMTris，1.0MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pli7.5(7倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.1(6倍柱體積)凈化1-20mM檸檬酸鈉，pH2.7(5倍柱體積)凈化2-6M胍鹽酸鹽(2倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度2-8。CrmpA蛋白SepahroseTMFF柱用5倍體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。以約10mg產(chǎn)物/mL樹(shù)脂的量向該柱上樣。上樣后，用1倍體積的平衡緩沖液沖洗和5倍體積的洗滌1的溶液洗滌。所測(cè)試的所有洗滌1的溶液都在表2中概述。除1號(hào)運(yùn)行外，所有運(yùn)行都包括洗滌1。洗滌1之后，用5倍體積的pH7.5，含l.OMNaCl的20mMTris和7倍體積的pH7.5，含75mMNaCl的10mMTris洗滌。用pH3.1，含75mMNaCl的50mM甘氨酸將單克隆抗體從柱中洗脫出來(lái)。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.9-8.1。然后將柱凈化，洗滌和保存。表2列出了由不同運(yùn)行得到的產(chǎn)物池中所存在的IRT類(lèi)和LMW的水平。氯化鎂和氯化鈣洗滌降低了IRT和LMW類(lèi)的水平。表2:不同洗滌1的緩沖液的IRT和LMW值<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>結(jié)果顯示，氯化鎂和氯化鈣洗滌降低了IRT和LMW類(lèi)的水平，而氯化鈉和丙二醇洗滌未減少I(mǎi)RT或LMW類(lèi)。實(shí)施例2:用A蛋白色譜結(jié)合CaCl2洗滌去除IRT在本實(shí)驗(yàn)中，用A蛋白色譜和CaCl2洗滌進(jìn)行了大規(guī)模的抗體純化，以除去IRT類(lèi)。含有單克隆抗體的培養(yǎng)物用與MilliporeK-Prime400色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(2.4L)進(jìn)行中試規(guī)模的純化。如下文所述完成兩次MabSelect運(yùn)行。柱尺寸-13cmxl8cm操作流速-150cm/hr，300cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(2倍柱體積)洗滌1-1號(hào)運(yùn)行，50mMTris，2MCaCl2，pH7.5;2號(hào)運(yùn)行無(wú)洗滌1洗滌2-20mMTris，l.OMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，25mMNaCl，pH3.1(6倍柱體積)凈化1-50mM甘氨酸，0.5MNaCl，pH2.7(5倍柱體積)凈化2-6M胍鹽酸鹽(2倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度2-8°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后該柱以約10mg產(chǎn)物/mL樹(shù)脂的量上樣。然后用2倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，5倍柱體積的洗滌1的溶液洗滌。對(duì)于運(yùn)行1，該洗滌1的溶液由50mMTris，2.0MCaCl2組成，pH為7.5，對(duì)于運(yùn)行2，則將此步完全刪去。洗滌1之后，用5倍柱體積的pH7.5，含1.0MNaCl的50mMTris和5倍柱體積的pH7.5，含75mMNaCl的10mMTris洗滌。用pH3.1，含25mMNaCl的50mM甘氨酸將單克隆抗體從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來(lái)。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.8-8.2。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見(jiàn)表3。表3:有或無(wú)氯化鈣洗滌的中試規(guī)模運(yùn)行的％IRT水平<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>結(jié)果顯示，在中試規(guī)模下，氯化鈣洗滌從產(chǎn)物池中去除了IRT。實(shí)施例3:DNA的去除本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了CaCl2洗滌從含有AAB單克隆抗體的制品中除去宿主細(xì)胞DNA的能力。含有所述單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(19mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。如下文所述完成三次MabSelect運(yùn)行。柱尺寸-1.1cmx20cm操作流速-300cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(2倍柱體積)洗漆1-50mMTris，2.0MCaCl2，pH7.5(5倍柱體積)(僅用于運(yùn)行2和3)洗滌2-20mMTris，1.0MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)(僅用于運(yùn)行1和3)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pH7.5(7倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.0(6倍柱體積)凈化-50mM甘氨酸，0.5MNaCl，pH2.7(5倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度18-24°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后該柱以約40mg產(chǎn)物/mL樹(shù)脂的上樣量上樣。隨后用2倍體積的平衡緩沖液沖洗。對(duì)于運(yùn)行2和3，該步驟后接著用5倍柱體積的洗滌1的溶液洗滌。對(duì)于運(yùn)行1和3，用5倍柱體積的洗滌2的溶液洗滌。所有3次運(yùn)行均用7倍柱體積的洗滌3的溶液洗滌。用pH3.0，含75mMNaCl的50mM甘氨酸將所述單克隆抗體從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來(lái)。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.5-8.0。然后將柱凈化，洗漆和保存。結(jié)果見(jiàn)表4。表4:用氯化鈣洗滌去除DNA<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>結(jié)果顯示，與在洗滌液中使用NaCl相比，pH7.5，含2.0M氯化鈣的50mMTris的加入使DNA的減少量增大了10倍。實(shí)施例4:宿主細(xì)胞蛋白的去除本實(shí)驗(yàn)在純化運(yùn)行中使用了第二種抗A/3單克隆抗體12All，并測(cè)試了不同洗滌條件去除宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的能力。以96孔濾板格式進(jìn)行高通量篩選(HTS)，以確定MabSelect步驟的去除雜質(zhì)，如HCP的最佳洗滌條件。該篩選改變洗滌用輔料，輔料濃度和pH，以確定其對(duì)過(guò)程相關(guān)雜質(zhì)，如HCP的影響。MabSelect樹(shù)脂用pH7.3，含10mMNaCl的5mMTris平衡，并在柱中將產(chǎn)物上樣。然后取出樹(shù)脂，混合，向96孔濾板的各孔中分配50yL樹(shù)脂。各孔中的樹(shù)脂用pH為7.3，含有5mMTris和10mMNaCl的溶液平衡，然后用各自含有不同輔料的洗滌液分3個(gè)階段進(jìn)行洗滌，每階段使用300gL洗滌緩沖液。輔料洗滌之后，用pH7.3，含有5mMTris禾t]10mMNaCl的緩沖液分4個(gè)階段進(jìn)行第二次洗滌，每階段300^L。然后產(chǎn)物分3個(gè)階段，每階段300^L從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。合并第l和第2階段的洗脫液，測(cè)試HCP水平。樹(shù)脂體積-50/iL洗滌用輔料-氯化鈉，氯化鈣，氯化鎂輔料濃度-100，250，500，1000，1500和2000mM輔料pH-6.0和7.5洗脫緩沖液-25mMHepes，10mMNaCl，pH3.0，25mMHepes，100mMNaCl，pH3.0，50mM甘氨酸，10mMNaCl，pH3.0，50mM甘氨酸，100mMNaCl，pH3.0和100mM精氨酸，10mMNaCl,pH3.0，100mM精氨酸，lOOmMNaCl，pH3.0運(yùn)行溫度18-24°C結(jié)果見(jiàn)表5和6。表5:用pH6.0的氯化鈉，氯化鈣或氯化鎂洗滌MabSelect樹(shù)脂時(shí)的HCP值<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表6:用pH7.5的氯化鈉，氯化鈣或氯化鎂洗滌MabSelect樹(shù)脂時(shí)的HCP值<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>結(jié)果顯示，pH6.0(表5)和pH7.5(表6)時(shí)，與氯化鈉相比，氯化鈣和氯化鎂都降低了MabSelect峰池中HCP的水平。實(shí)施例5:二硫鍵缺失類(lèi)(UDB)的去除本實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)了CaCl2洗漆去除二硫鍵缺失類(lèi)(UDB)的能力?；旧习磳?shí)施例1中所述完成兩次rmpA蛋白SepharoseFF運(yùn)行。柱尺寸-1.0cmxll.4cm操作流速-150cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(1倍柱體積)洗滌1-對(duì)于運(yùn)行l(wèi)，50mM醋酸鹽，2.0MCaCl2，pH5.0;運(yùn)行2無(wú)洗滌1洗滌2-20mMTris，l.OMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pH7.5(7倍柱體積)洗脫-SOmM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.1(6倍柱體積)凈化1-20mM檸檬酸鈉，pH2.7(5倍柱體積)凈化2-6M胍鹽酸鹽(2倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度2-8。CrmpA蛋白SepahroseFF柱用5倍體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后以約10mg產(chǎn)物/mL樹(shù)脂的上樣量向該柱上樣。然后用1倍體積的平衡緩沖液沖洗，接著用5倍體積的洗滌1的溶液洗滌。對(duì)于運(yùn)行1，該洗滌1的溶液由50mM醋酸鹽，2.0MCaCl2組成，pH為5.0，而對(duì)于運(yùn)行2，則將此步完全刪去。洗滌1完成后，接著用5倍體積的pH7.5，含1.0MNaCl的20mMTris和7倍體積的pH7.5，含75mMNaCl的10mMTris洗滌。用pH3.1，含75mMNaCl的50mM甘氨酸將單克隆抗體從rmpA蛋白SepharoseTMFF柱中洗脫出來(lái)。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.8-8.2。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見(jiàn)表7。表7:用或未用鈣洗滌過(guò)的樣品的y。UDB<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>觀察到額外用pH5.0，含2.0MCaCl2的50mM醋酸鹽洗滌過(guò)的樣品中UDB水平減少了兩倍。實(shí)施例6:用其它二價(jià)陽(yáng)離子鹽洗滌除去HCP和IRT本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了含有MnCl2或NiCl2的洗滌液從含有抗A/3單克隆抗體AAB的制品中去除雜質(zhì)的能力。進(jìn)行兩次運(yùn)行，以評(píng)價(jià)含有其它二價(jià)陽(yáng)離子鹽，如MnCl2或NiCl2的洗滌液的作用。同樣完成兩次對(duì)照運(yùn)行——一次用pH7.5，含1.0MNaCl的50mMTris洗滌(期望無(wú)IRT或HCP被去除)，另一次用pH7.5，含2.0MCaCl2的50mMTris洗滌。含有所述單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(9mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。按下文所述完成MabSelect運(yùn)行。如下文所描述的那樣，4次運(yùn)行的所有操作參數(shù)除了洗滌l是可變的外，其余都相同(表8)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>操作流速-300cm/hr(平衡，洗滌2,洗脫，再生，保存)操作流速-230cm/hr(上樣，沖洗，洗滌1)平衡1-50mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5.0倍柱體積)洗滌1-可變(組合物見(jiàn)表8)洗滌2-50mMTris，10mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，10mMNaCl，pH3.0(3倍柱體積)再生-50mMNaOH，0.5MNa2S04(5倍柱體積)保存-16%乙醇，50mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)運(yùn)行溫度18-24°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的50mMTris平衡。將該柱以約40mg產(chǎn)物/mL樹(shù)脂的量上樣。柱上多余的樣品用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的50mMTris沖洗出去。然后用表11所述溶液中的一種洗滌該柱。洗脫該柱之前，用5倍柱體積的pH7.5，含10mMNaCl的50mMTris洗滌。用pH3.0，含10mMNaCl的50mM甘氨酸將產(chǎn)物從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來(lái)。然后產(chǎn)物池用pH9.0的2MTris中和至pH8.0。將柱用5倍柱體積的50mMNaOH，0.5MNa2S04凈化，然后用5倍柱體積的pH7.5的16%乙醇，50mMTris,150mMNaCl保存。結(jié)果見(jiàn)表8(HCP的去除)和表9(IRT的去除)。表8:用不同洗滌液去除HCP<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*基于MnCl2和NiCl2的溶解性選擇pH5.0表9:用不同洗滌液去除IRT<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*基于MnCl2和NiCl2的溶解性選擇pH5表8顯示，用含有二價(jià)陽(yáng)離子的溶液洗滌的運(yùn)行中存在的HCP類(lèi)的水平對(duì)比照(1.0mMNaCl洗滌)小1.5-3.5倍。表9顯示，與含有1.0mMNaCl的洗滌液相比，包含用二價(jià)陽(yáng)離子鹽溶液洗滌的步驟的運(yùn)行也提供了大于3.5倍的IRT去除量。因此，這些結(jié)果證明了用其它不同于CaCl2的二價(jià)陽(yáng)離子(例如，用MnCl2或NiCl2)進(jìn)行鹽洗滌也能有效去除雜質(zhì)。等同體通過(guò)不超出常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或能確定本文所述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同體。這些等同體希望為所附權(quán)利要求書(shū)所包括。權(quán)利要求1.從包括具有Fc區(qū)Aβ結(jié)合蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中將所述蛋白純化的方法，其包括步驟將所述Aβ結(jié)合蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上；用含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑；和從洗脫溶液中的所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)選自?xún)?nèi)含子連讀變異體種類(lèi)(IRT),二硫鍵缺失類(lèi)(UDB)和低分子量種類(lèi)(LMW)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)是IRT。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述Ai3結(jié)合蛋白是抗體。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體選自抗體融合，鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體和人抗體。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述A/3結(jié)合蛋白是人源化抗A/3抗體。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述人源化抗A/3抗體選自3D6，10D5，12A11和12B4。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述具有Fc區(qū)的A/3結(jié)合蛋白是重組產(chǎn)生的。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有Fc區(qū)的A^結(jié)合蛋白是在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fc結(jié)合劑包括A蛋白和G蛋白的一種或多種。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述FC結(jié)合劑被固定在固相上。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述固相包括珠，凝膠，樹(shù)脂和顆粒的一種或多種。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽包括離液序列高的鹽。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價(jià)陽(yáng)離子鹽選自CaCl2，NiCl2,MgCl2及其混合物。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液的pH值在約4至約8的范圍內(nèi)。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液的pH值在約4.5至約7.5的范圍內(nèi)。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖溶液的二價(jià)陽(yáng)離子鹽濃度在約0.1M至約5M的范圍內(nèi)。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述緩沖溶液的二價(jià)陽(yáng)離子鹽濃度在約0.5M至約3M的范圍內(nèi)。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液包括至少約0.6M的CaCl2。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液包括至少約2M的MgCl2。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽(yáng)離子鹽的緩沖溶液包括至少約2M的CaCl2。22.權(quán)利要求1的方法，其中將所述結(jié)合蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上和洗滌所述Fc結(jié)合劑的步驟在約2°C至約24°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括宿主細(xì)胞蛋白，宿主細(xì)胞DNA，細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白及其混合物的一種或多種。24.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括Fc區(qū)的非所需種類(lèi)的蛋白。25.權(quán)利要求1的方法，其中所述非所需種類(lèi)的A^結(jié)合蛋白包括一種或多種具有內(nèi)含子連讀序列的抗體鏈或其片段，一種或多種具有不正確二硫鍵的抗體鏈或其片段，半抗體或其片段，輕鏈二聚體或其片段和重鏈二聚體或其片段。26.權(quán)利要求1的方法，其中從所述Fc結(jié)合劑回收所述A/3結(jié)合蛋白的步驟包括用pH范圍為約2.0至約6.5的洗脫緩沖液洗脫所述蛋白。27.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括選自如下的色譜步驟陰離子交換色譜，陽(yáng)離子交換色譜，固定化金屬親和色譜和疏水相互作用色譜(HIC)。28.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括選自如下的色譜步驟羥基磷灰石色譜，透析，親和色譜，硫酸銨沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)和色譜聚焦。29.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種內(nèi)含子連讀變異體，并且含有所述蛋白的洗脫溶液的內(nèi)含子連讀變異體水平比所述源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少5倍。30.權(quán)利要求29的方法，其中含有在所述洗脫溶液中回收的蛋白的溶液的內(nèi)含子連讀變異體水平比所述源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少10倍。31.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種內(nèi)含子連讀變異體，并且在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約1%的所述蛋白的種類(lèi)。32.權(quán)利要求31的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約0.8%的所述蛋白的種類(lèi)。33.權(quán)利要求32的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約0.5%的所述蛋白的種類(lèi)。34.權(quán)利要求33的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約0.2%的所述蛋白的種類(lèi)。35.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種低分子量種類(lèi)，并且在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類(lèi)包括小于約1%的所述蛋白的種類(lèi)。36.權(quán)利要求35的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類(lèi)包括小于約0.8%的所述蛋白的種類(lèi)。37.權(quán)利要求36的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類(lèi)包括小于約0.5%的所述蛋白的種類(lèi)。38.權(quán)利要求37的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類(lèi)包括小于約0.2%的所述蛋白的種類(lèi)。39.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種二硫鍵缺失變異體，并且在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約15%的所述蛋白的種類(lèi)。40.權(quán)利要求39的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約10%的所述蛋白的種類(lèi)。41.權(quán)利要求40的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約5%的所述蛋白的種類(lèi)。42.權(quán)利要求41的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約2%的所述蛋白的種類(lèi)。43.根據(jù)權(quán)利要求1的方法純化的A/5結(jié)合蛋白。44.權(quán)利要求43的蛋白，其中所述蛋白是抗體。45.包括用于從雜質(zhì)中純化具有Fc區(qū)的A/3結(jié)合蛋白的試劑的試劑盒，所述試劑盒包括選自如下的試劑和使用說(shuō)明書(shū)二價(jià)陽(yáng)離子鹽和Fc結(jié)合劑。全文摘要本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^(guò)將具有Fc區(qū)Aβ結(jié)合蛋白，吸附到Fc結(jié)合劑，例如，A蛋白或G蛋白上，然后用二價(jià)陽(yáng)離子鹽緩沖液洗滌，以除去雜質(zhì)，隨后回收被吸附的Aβ結(jié)合蛋白來(lái)純化所述具有Fc區(qū)Aβ結(jié)合蛋白，例如，抗Aβ抗體或抗體融合的方法。本申請(qǐng)的特征還在于洗脫被純化Aβ結(jié)合蛋白的方法及純化系列中所述方法的并入。本申請(qǐng)還提供了包括執(zhí)行所述方法的組分和使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒。文檔編號(hào)C07K16/18GK101365722SQ200680021639公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2006年6月16日優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日發(fā)明者蘭加納坦·戈達(dá)瓦蒂,蒂莫西·伊斯克拉申請(qǐng)人:艾蘭制藥國(guó)際有限公司;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