通過陽離子交換層析進行的抗體純化的制作方法
【專利說明】通過陽離子交換層析進行的抗體純化
[0001] 本申請是申請日為2008年10月29日、中國申請?zhí)枮?01310495290. 7、發(fā)明名稱 為"通過陽離子交換層析進行的抗體純化"的發(fā)明分案申請的再分案申請（原申請申請?zhí)?200880119331. X)。
[0002] 相關申請
[0003] 本申請要求2007年10月30日提交的美國臨時專利申請No. 60/983825的權益， 通過述及將其公開內容完整收入本文用于所有目的。 發(fā)明領域
[0004] 一般而言，本發(fā)明涉及蛋白質純化。具體而言，本發(fā)明涉及一種使用陽離子交換層 析自包含抗體和至少一種污染物的組合物純化所述抗體的方法，其中在使用電導率升高的 洗脫緩沖液來洗脫期望抗體之前使用高pH清洗步驟來清除污染物。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 大規(guī)模的、經濟的蛋白質純化日益成為生物技術產業(yè)的重要問題。一般而言，通過 細胞培養(yǎng)來生產蛋白質，使用通過插入含有感興趣蛋白質的基因的重組質粒而改造成生成 該蛋白質的真核或原核細胞系。由于通常所使用的細胞是活的有機體，因此必須給它們進 料含有糖、氨基酸、和生長因子（通常自動物血清的制備物來供應）的復合生長培養(yǎng)基。將 期望的蛋白質與進料給細胞的化合物混合物及與細胞自身的副產物分開至足以用作人治 療劑的純度提出了艱難的挑戰(zhàn)。
[0007] 用于自細胞碎肩純化蛋白質的規(guī)程首先取決于蛋白質表達的部位。一些蛋白質能 自細胞直接分泌入周圍的生長培養(yǎng)基中，其它蛋白質是胞內制備的。對于后一類蛋白質，純 化過程的第一步涉及裂解細胞，這可以通過多種方法來進行，包括機械剪切、滲壓震擾、或 酶處理。此類破壞將細胞的整個內含物釋放入勻漿中，而且另外生成由于尺寸小而難以清 除的亞細胞碎片。這些一般通過差速離心或通過過濾來清除。由于蛋白質生成運行的過程 中細胞的天然死亡和胞內宿主細胞蛋白質的釋放，直接分泌的蛋白質存在同樣的問題，只 是程度較小。
[0008] -旦獲得含有感興趣蛋白質的澄清溶液，通常使用不同層析技術的組合來試圖將 它與細胞生成的其它蛋白質分開。這些技術基于蛋白質的電荷、疏水性程度、或大小將蛋 白混合物分開。這些技術每一種可利用數(shù)種不同層析樹脂，從而容許為所涉及的具體蛋白 質精確剪裁純化方案。這些分離方法每一種的本質是能使蛋白質以不同速率沿長柱向下移 動，從而實現(xiàn)隨它們沿柱進一步向下移動時增大的物理分離，或者是能使蛋白質選擇性粘 附至分離介質，然后用不同溶劑差異洗脫。在一些情況中，當雜質特異性粘附至柱而感興趣 蛋白質不粘附至柱時，將期望蛋白質與雜質分開，也就是說，感興趣的蛋白質存在于"流出 液"中。
[0009] 離子交換層析是常用于純化蛋白質的一種層析技術。在離子交換層析中，溶質表 面上帶電荷的部分（patch)受到附著于層析基質的相反電荷的吸引，前提是周圍緩沖液的 離子強度低。一般通過提高緩沖液的離子強度（即電導率）以與溶質競爭離子交換基質帶 電荷的位點來實現(xiàn)洗脫。改變pH，由此改變溶質的電荷是實現(xiàn)溶質洗脫的另一種方式。電 導率或pH的變化可以是逐漸的（梯度洗脫）或逐步的（分步洗脫）。在過去，這些變化是 漸進的；即，pH或電導率以單一方向升高或降低。
[0010]美國專利 No. 6, 339, 142 ;6, 417, 355 ;6, 489, 447 ;和 7, 074, 404(Basey et al.)記載了用于純化多肽的離子交換層析。美國專利No. 6, 127,526 ;6, 333, 398 ;和 6, 797, 814 (Blank，G.)記載了通過蛋白A層析來純化蛋白質，諸如抗HER2抗體。美國申請 公開No. 2004/0082047中記載了通過離子交換層析來純化蛋白質（諸如抗體）的方法。 [0011] 美國專利No. 5, 110, 913涉及通過于第一 pH 4. 6使抗體結合至離子交換樹脂， 于第二pH 5. 5清洗，并于pH 6. 5洗脫抗體來純化水溶液中的抗體，其中這三個步驟的溶 液的離子強度保持恒定。Zhang et al.涉及人抗體的Q膜、陰離子交換層析（Zhang et al. "Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process,'，Poster presented at BioProduction, Oct. 26-27. Munich, Germany, 2004) 〇 其它關注蛋白質純化的出版物包括：Barnthouse et al.J. Biotech. 66:125-136 (1998); Blank et al.Bioseparation 10:65-71 (2001) ；Fo 11 man and Fahrner J. Chromatog. 1024:79-85(2004) ； Iyer et al. BioPharm 15 (1) : 14-16, 18, 20, 53 (2002)； US 2004/0082047A1 ；EP 333, 574 ；EP 460,426 B1 ；EP 556, 083 ；W0 89/05157 ；W0 92/22653 ；W0 93/06217 ；W0 95/22389 ；W0 96/33208 ；W0 96/40883 ；US 4,753,894； US 4, 966,851；US 5, 110,913；US 5, 112,951；US 5, 115, 101；US 5, 118,796；US 5, 169, 774；US 5, 196, 323 ；US 5, 256, 769 ；US 5, 279, 823 ；US 5, 429, 746 ；US 5,451,662； US 5, 525, 338 ；US 5, 677, 171 ；US 6, 005, 081 ；US 6, 054, 561 ；US 6, 127, 526 ；US 6, 267, 958；US 6, 339, 142 ；US 6, 417, 335 ；US 6, 489, 447 ；Adachi et al. , Journal of Chromatography. A. 763 (1-2) :57-63 (Feb 28,1997) ；Gagnon,P. , Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Tucson:Validated Biosystems, Inc. , Chapter 4,pps. 57-86 (1996) ；Graf et al., Bioseparation 4 (1) :7-20(Feb 1994)； Mhatre et al. , Journal of Chromatography A 707(2):225-231 (Jul 21,1995)； Neidhardt et al., Journal of Chromatography 590 (2):255-261 (1992) ；Protein Purification Applications-APractical Approach,Harris and Angal,IRL Press pps.151-156 (1995) ；Sofer et al. Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation, San Diego:Academic Press pps. 65-80(1997)； Tishchenko et al. , Journal of Chromatography B 706 (1):157-166 (Feb 27,1998)〇
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本文中的發(fā)明關注一種用于抗體陽離子交換層析的改良方法，其中在洗脫期望抗 體產物之前使用高pH清洗步驟來清除污染物。過程結果導致中國倉鼠卵巢蛋白質（CHOP) 污染物的清除得到改進等。
[0014] 依照第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于自包含抗體和至少一種污染物的組合物 純化所述抗體的方法，該方法包括下述按序步驟：
[0015] (a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于第一 pH ;
[0016] (b)用pH大于（a)中所述組合物的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其 中所述第一清洗緩沖液的pH為約6. 8至約9. 0 ;
[0017] (c)用pH小于所述第一清洗緩沖液的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料； 并
[0018] (d)用電導率顯著（substantially)大于所述第二清洗緩沖液的洗脫緩沖液自所
[0019] 述陽離子交換材料洗脫所述抗體。
[0020] 優(yōu)選的是，所述抗體結合人CD20,諸如利妥昔單抗（rituximab)，或結合人血管內 皮生長因子（VEGF)，諸如貝伐單抗（bevacizumab)。
[0021] 依照一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明關注一種用于自包含結合人CH20的抗體和 一種或多種污染物的組合物純化所述抗體的方法，所述污染物選自下組：中國倉鼠卵巢蛋 白質（CHOP)、浸出的（leached)蛋白A、DNA、和聚集的⑶20抗體，該方法包括下述按序步 驟：
[0022] (a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4. 0至約6. 0 的pH;
[0023] (b)用pH約6. 8至約9. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其中所述 第一清洗緩沖液的pH為約6. 8至約9. 0 ;
[0024] (c)用pH約5. 0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并
[0025] (d)用pH約5. 0至約6. 0且電導率約10mS/cm至約100mS/cm的洗脫緩沖液自所 述陽離子交換材料洗脫所述抗體。
[0026] 優(yōu)選的是，所述CD20抗體是利妥昔單抗。
[0027] -種另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于自包含結合人血管內皮生長 因子（VEGF)的抗體和一種或多種污染物的組合物純化所述抗體的方法，所述污染物選自 下組：細胞培養(yǎng)基成分、硫酸慶大霉素（Garamycin)、中國倉鼠卵巢蛋白質（CH0P)、DNA、病 毒污染物、和聚集的VEGF抗體，該方法包括下述按序步驟：
[0028] (a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4. 0至約6. 0 的pH;
[0029] (b)用pH約6. 8至約8. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；
[0030] (C)用pH約5. 0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并
[0031] (d)用pH約5. 0至約6. 0且電導率約10mS/cm至約100mS/cm的洗脫緩沖液自所 述陽離子交換材料洗脫所述抗體。
[0032] 優(yōu)選的是，所述VEGF抗體是貝伐單抗。
[0033] 本發(fā)明還關注一種組合物，其在包含約25mM HEPES、pH約7. 8的緩沖液中包含利 安昔單抗。
[0034] 另外，本發(fā)明提供了一種組合物，其在包含約25mM MOPS、pH約7. 0的緩沖液中包 含貝伐單抗。
[0035] 本發(fā)明涉及下述各項。
[0036] 1. 一種用于自包含抗體和至少一種污染物的組合物純化所述抗體的方法，該方法 包括下述按序步驟：
[0037] (a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于第一 pH ;
[0038] (b)用pH大于（a)中所述組合物的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其 中所述第一清洗緩沖液的pH為約6. 8至約9. 0 ;
[0039] (c)用pH小于所述第一清洗緩沖液的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料； 并
[0040] (d)用電導率顯著大于所述第二清洗緩沖液的洗脫緩沖液自所述陽離子交換材料 洗脫所述抗體。
[0041] 2.項1的方法，其中所述第二清洗緩沖液的pH和所述洗脫緩沖液的pH大致相同。
[0042] 3.項1的方法，其中所述抗體結合人⑶20。
[0043] 4.項1的方法，其中所述抗體結合人血管內皮生長因子（VEGF)。
[0044] 5.項1的方法，其中（a)中所述組合物的pH為約4. 0至約6. 0,所述第一清洗緩 沖液的pH為約6. 8至約8. 0,所述第二清洗緩沖液的pH為約5. 0至約6. 0,而所述洗脫緩 沖液的pH為約5. 0至約6. 0。
[0045] 6.項1的方法，其中所述洗脫緩沖液的電導率為約10mS/cm至約100mS/cm。
[0046] 7.項1的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約100至約300mM NaCl。
[0047] 8.項1的方法，其中所述陽離子交換材料包括經磺丙基官能化多羥基化聚合物包 被的交聯(lián)聚（苯乙烯-二乙烯基苯）流通顆粒。
[0048] 9.項1的方法，其中所述污染物選自下組：中國倉鼠卵巢蛋白質（CHOP)、浸出的蛋 白A、DNA、聚集的抗體、細胞培養(yǎng)基成分、硫酸慶大霉素、和病毒污染物。
[0049] 10.項1的方法，進一步包括在步驟（a)至（d)之前、期間、或之后將包含所述抗體 的組合物進行一個或多個進一步的純化步驟以獲得所述抗體的均質制備物。
[0050] 11.項10的方法，進一步包括將純化的抗體與異源分子偶聯(lián)。
[0051] 12.項10或11的方法，進一步包括通過組合所述抗體的均質制備物或所述偶聯(lián)的 抗體與醫(yī)學可接受載體來制備藥物組合物。
[0052] 13. -種用于自包含結合人CH20的抗體和一種或多種污染物的組合物純化所述 抗體的方法，所述污染物選自下組：中國倉鼠卵巢蛋白質（CHOP)、浸出的蛋白A、DNA、和聚 集的CD20抗體，該方法包括下述按序步驟：
[0053] (a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4. 0至約6. 0 的pH;
[0054] (b)用pH約6. 8至約9. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其中所述 第一清洗緩沖液的pH為約6. 8至約9. 0 ;
[0055] (c)用pH約5. 0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并
[0056] (d)用pH約5. 0至約6. 0且電導率約10mS/cm至約100mS/cm的洗脫緩沖液自所 述陽離子交換材料洗脫所述抗體。
[0057] 14.項13的方法，其中所述抗體是利妥昔單抗。
[0058] 15.項13的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約100至約300mM NaCl。
[0059] 16. -種用于自包含結合人血管內皮生長因子（VEGF)的抗體和一種或多種污染 物的組合物純化所述抗體的方法，所述污染物選自下組：細胞培養(yǎng)基成分、硫酸慶大霉素、 中國倉鼠卵巢蛋白質（CHOP)、DNA、病毒污染物、和聚集的VEGF抗體，該方法包括下述按序 步驟：
[0060] (a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4. 0至約6. 0 的pH;
[0061] (b)用pH約6. 8至約8. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；