本公開提供了用于以高特異性和高均一性形成化學(xué)鎖定的雙特異性或異源二聚體抗體(優(yōu)選IgG類)的方法。更具體地，本公開提供了具有利用生物正交點(diǎn)擊化學(xué)(bio-orthogonalclickchemistry)連接的連接區(qū)的化學(xué)鎖定的雙特異性IgG類抗體。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本專利申請(qǐng)要求2014年5月10日提交的61/991,508號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：人免疫球蛋白G或IgG抗體以四個(gè)亞類存在，每個(gè)亞類具有不同的結(jié)構(gòu)和功能特性。IgG由兩個(gè)重鏈-輕鏈對(duì)(半抗體)組成，該重鏈-輕鏈對(duì)通過直接連接鉸鏈區(qū)中的Cys殘基(EU索引編號(hào)：半胱氨酸殘基226和229；Kabat編號(hào)：半胱氨酸殘基239和242)的重鏈間二硫鍵連接。人IgG4分子以各種分子形式存在，其通過重鏈間二硫鍵的存在或不存在而不同。已經(jīng)開發(fā)了多種多樣的重組抗體形式，例如通過融合IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價(jià)雙特異性抗體(Coloman等，NatureBiotech15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison，NatureBiotech25(2007)1233-1234)。另一種形式具有不再保留的抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，例如雙體抗體、三體抗體或四體抗體、微抗體、幾種單鏈形式(scFv、Bis-scFv)。但是這類形式能夠結(jié)合兩個(gè)或更多的抗原(Holliger等，NatureBiotech23(2005)1126-1136；Fischer和Leger，Pathobiology74(2007)3-14；Shen等，J.ImmunologicalMethods318(2007)65-74；和Wu等，NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。US2005/0163782中報(bào)道了用于從包含其中通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體和其中未通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體的該兩種類型混合物中將通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體與未通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優(yōu)先合成通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。雙特異性抗體是難以使用傳統(tǒng)的雜種雜交瘤和化學(xué)偶聯(lián)方法以足夠數(shù)量和質(zhì)量產(chǎn)生的材料。此外，WO2005/062916和美國(guó)專利申請(qǐng)2010/0105874描述了如何通過還原抗體“AA”和抗體“BB”以將二硫鍵分離成具有單一結(jié)合區(qū)域的單重鏈-輕鏈單元(A或B)(其中A和B兩者結(jié)合不同的靶標(biāo))來(lái)形成雙特異性抗體。然后，抗體允許二硫鍵發(fā)生異構(gòu)化，以使得抗體AB、BA、AA和BB各自以約25％的概率重組。然而，AB和BA兩者是相同的雙特異性抗體，且因此最多表現(xiàn)出約50％的產(chǎn)率。因此，這需要額外的步驟來(lái)將形成的所需的雙特異性抗體從原始的重組抗體分離。然而，美國(guó)專利申請(qǐng)2010/0105874指向具有CPSC序列的IgG4中的鉸鏈區(qū)，并且陳述：“CPSC序列導(dǎo)致更靈活的核心鉸鏈和形成鏈內(nèi)二硫鍵的可能性….據(jù)信具有IgG4樣核心鉸鏈序列的抗體可以具有用于重排二硫鍵的內(nèi)在活性，其通過本發(fā)明方法中使用的條件模擬”(第0013段)。此外，已經(jīng)制備了其他形式的雙特異性抗體，其具有通過改變抗體A和B的重鏈序列產(chǎn)生的“杵和臼”結(jié)構(gòu)。因此，本公開提供了產(chǎn)生化學(xué)鎖定的雙特異性IgG抗體的方法，其滿足本領(lǐng)域?qū)﹄p特異性抗體的很高產(chǎn)率的需要并且比改變固定的抗體區(qū)域中的氨基酸序列的杵和臼方法具有更好的穩(wěn)定性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開提供了用于從IgG1、IgG2或IgG4類抗體或其Fab2片段“A”和IgG1、IgG2或IgG4類抗體或其Fab2片段“B”產(chǎn)生化學(xué)鎖定的雙特異性抗體“AB”或“BA”的方法。該方法包括：(a)在足以切割鉸鏈區(qū)中重鏈之間的基本上所有二硫鍵的條件下使所述第一抗體“A”與還原劑接觸，以產(chǎn)生一對(duì)第一抗體片段A'，每個(gè)第一抗體片段A'包含連接于單一重鏈的單一輕鏈，其中所述重鏈具有一個(gè)或多個(gè)由所述二硫鍵的還原形成的反應(yīng)性巰基；(b)將第一異雙官能接頭連接到所述第一抗體片段A'，其中所述第一異雙官能接頭包含(i)用于與所述第一抗體片段A'的所述重鏈的反應(yīng)性巰基共價(jià)連接的第一巰基反應(yīng)性官能團(tuán)，和(ii)疊氮化物，從而形成疊氮化物官能化的第一抗體片段；(c)在足以切割鉸鏈區(qū)中重鏈之間的基本上所有二硫鍵的條件下使所述第二抗體“B”與還原劑接觸，以產(chǎn)生一對(duì)第二抗體片段B'，每個(gè)第二抗體片段B'包含連接于單一重鏈的單一輕鏈，所述重鏈具有一個(gè)或多個(gè)由所述二硫鍵的還原形成的反應(yīng)性巰基；(d)將第二異雙官能接頭連接到所述第二抗體片段B'，所述第二異雙官能接頭包含：(i)用于與所述第二抗體片段的所述重鏈的反應(yīng)性巰基共價(jià)連接的第二巰基反應(yīng)性官能團(tuán)，和(ii)炔；從而形成炔官能化的第二抗體片段；(e)使所述疊氮化物官能化的第一抗體片段與所述炔官能化的第二抗體片段反應(yīng)以通過所述疊氮化物與所述炔的1,3-偶極環(huán)加成將所述第一抗體片段共價(jià)連接于所述第二抗體片段，從而形成化學(xué)鎖定的雙特異性抗體“AB”或“BA”。還原鉸鏈區(qū)中二硫鍵的步驟優(yōu)選在基本上不還原重鏈和輕鏈之間的二硫鍵的條件下進(jìn)行，這意味著，在一些實(shí)施方式中，至少約90％或至少約95％或至少約99％的這類重鏈和輕鏈之間的二硫鍵在鉸鏈區(qū)中的二硫鍵裂解后保持完整。優(yōu)選地，第一異雙官能接頭具有Q-L-N3的形式，其中Q是巰基反應(yīng)性官能團(tuán)，L是烴接頭，且N3是疊氮化物。優(yōu)選地，該巰基反應(yīng)性官能團(tuán)Q是鹵代烷(例如，烷基氯、烷基溴或烷基碘)、芐基鹵、馬來(lái)酰亞胺、鹵代馬來(lái)酰胺(溴代馬來(lái)酰亞胺)或二鹵代馬來(lái)酰亞胺(二溴代馬來(lái)酰亞胺)。優(yōu)選地，L是在Q和N3之間直鏈中具有3-60個(gè)原子(例如，更典型地為6-50個(gè))的烴接頭。更優(yōu)選地，L是聚環(huán)氧烷(PEF)基團(tuán)或L是其中每個(gè)鏈節(jié)(mer)單元是–(CH2CH2–O)n或(O–CH2CH2)n–的聚合物(其中“n”獨(dú)立地是1-20的整數(shù)，更通常為1-8)。優(yōu)選地，第一異雙功能性接頭(連接到第一抗體片段)是：其中Q可以是適合于將接頭連接到抗體片段上的任何基團(tuán)，但優(yōu)選能夠與來(lái)自重鏈鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)鍵合。示例性基團(tuán)Q是：其中Z獨(dú)立地選自H、Br、I和SPh。優(yōu)選地，至少一個(gè)Z不是H，盡管在馬來(lái)酰亞胺的情況下，Z在每次出現(xiàn)時(shí)可以是氫。M獨(dú)立地為CR*或N。X1、X2、X3、X2、X4和X5獨(dú)立地選自鍵(即不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–(C＝O)–(CH2)n–、(C＝O)–O–(CH2)n–、(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中“n”為0或1-10的整數(shù)。Ra、Rb、Rc和Rd獨(dú)立地選自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和2-8元的環(huán)狀烴、雜環(huán)、芳基或雜芳基環(huán)；其中“n”獨(dú)立地為0或1-10的整數(shù)；和其中“l(fā)”、“p”、“q”和“r”獨(dú)立地為0或1-10的整數(shù)。Ω是鍵(即，其不存在)或者是C3-26烴環(huán)或稠環(huán)系統(tǒng)，任選地包含至多四個(gè)稠合環(huán)，其中每個(gè)環(huán)具有3-8元和任選地在每個(gè)環(huán)中包含1-4個(gè)選自O(shè)、S和N的雜原子。優(yōu)選地，Ω是與環(huán)辛烷環(huán)稠合或與8元雜環(huán)或環(huán)系統(tǒng)稠合的1,2,3-三唑環(huán)。R*和RN在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H或C1-12烴，任選被1-6個(gè)選自鹵素、O、S和N的雜原子取代；和其中任何兩個(gè)基團(tuán)R*和/或RN可以一起形成3-8元環(huán)。所述第二異雙官能接頭具有Q-L-G的形式，其中Q是巰基反應(yīng)性官能團(tuán)，L是烴接頭，和G是含炔基團(tuán)。巰基反應(yīng)性官能團(tuán)Q選自烷基鹵(例如烷基氯、烷基溴或烷基碘)、芐基鹵、馬來(lái)酰亞胺、鹵代馬來(lái)酰胺(例如溴代馬來(lái)酰亞胺)和二鹵代馬來(lái)酰亞胺(如，二溴代馬來(lái)酰亞胺)。L是在Q和G之間直鏈中具有3-60個(gè)原子(例如，優(yōu)選6-50個(gè))的烴接頭。優(yōu)選地，L是聚環(huán)氧烷基團(tuán)(PEG)，優(yōu)選地，L是單元–(CH2CH2–O)n–或–(O–CH2CH2)n–(其中“n”獨(dú)立地為1-20的整數(shù)，更通常為1-8)的聚合物。G是能夠與疊氮化物發(fā)生環(huán)加成的任何含炔基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，G包含末端炔，例如-C≡CH。在其它的實(shí)施方式中，G包括在環(huán)中具有-C≡C-鍵的環(huán)或環(huán)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，G包含具有-C≡C-鍵的C8環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，含-C≡C-的環(huán)是應(yīng)變的(strained)。第二異雙功能接頭具有以下形式：Q與第一異雙功能接頭中的相同或不同。Q通常是以下形式的巰基反應(yīng)基團(tuán)：其中Z在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自H、Br、I和SPh。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)Z不是H，盡管在馬來(lái)酰亞胺的情況下，Z在每次出現(xiàn)時(shí)可以是氫。M在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為CR*或N。G通常是包含能夠與疊氮化物發(fā)生1,3偶極環(huán)加成反應(yīng)的-C≡C-鍵的C8-20烴基。在一些實(shí)施方式中，G具有-C≡C-H的形式。在其它實(shí)施方式中，G包含具有-C≡C-鍵的環(huán)。特別地，G可以包含具有三鍵的8-元環(huán)(例如環(huán)辛炔)。該環(huán)可任選地與一個(gè)、兩個(gè)或更多的另外的環(huán)稠合，該另外的環(huán)通常為C3-6環(huán)烴環(huán)，包括芳基、雜芳基和雜環(huán)。含三鍵的8-元環(huán)可以在環(huán)中包括一個(gè)或多個(gè)(例如1-4個(gè))雜原子，例如氮和氧。在一個(gè)實(shí)施方式中，8元環(huán)在環(huán)中含有氮原子，其提供與L的連接點(diǎn)，如在以下所示的示例性結(jié)構(gòu)中：優(yōu)選地，G具有以下形式：X1、X2、X3、X2、X4和X5在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自鍵(即，不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–、–NRN–(C＝O)–O–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中“n”為0或1-10的整數(shù)；Ra、Rb、Rc和Rd在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(順式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–或者2-8元環(huán)狀烴、雜環(huán)、芳基或雜芳基環(huán)；其中“n”在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為0或1-10的整數(shù)；和其中“l(fā)”、“p”、“q”和“r”獨(dú)立地為0或1-10的整數(shù)；Ω是鍵(即，不存在)或者為C3-26烴環(huán)或稠環(huán)系統(tǒng)，任選地包含至多四個(gè)稠合環(huán)，每個(gè)環(huán)具有3-8元和在每個(gè)環(huán)中任選地包含獨(dú)立地選自O(shè)、S和N的1-4個(gè)雜原子；在一個(gè)實(shí)施方式中，Ω將包括與環(huán)辛烷環(huán)稠合或者與8元雜環(huán)或環(huán)系統(tǒng)稠合的1,2,3-三唑環(huán)。R*和RN在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H或C1-12烴，任選地被1-6個(gè)選自鹵素、O、S和N的雜原子取代；并且其中兩個(gè)基團(tuán)R*和/或RN可以一起形成3-8元環(huán)。疊氮化物和炔之間的環(huán)加成反應(yīng)可以通過1,3偶極環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行。該反應(yīng)可以由銅離子催化。在一些實(shí)施方式中，環(huán)加成反應(yīng)在中性或生理pH下發(fā)生。本公開還提供了一種用于具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號(hào)：殘基226-229；Kabat編號(hào)：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的還原抗體“A”和具有鉸鏈殘基序列(殘基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第二抗體“B”以形成半抗體A和半抗體B的方法，該方法包括：(a)還原各個(gè)抗體A和抗體B，由此還原條件破壞具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號(hào)：殘基226-229；Kabat編號(hào)：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的各抗體鉸鏈區(qū)中的任何鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵；(b)將選自于以下的化合物連接于半抗體A的鉸鏈核心序列的一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基(EU索引編號(hào)：殘基226和229；Kabat編號(hào)：殘基239和242)以形成連接的半抗體A：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；(c)將選自以下的化合物連接于抗體B的鉸鏈核心序列的一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基226和229(EU索引編號(hào)：殘基226和229；Kabat編號(hào)：殘基239和242)以形成連接的抗體B：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh；和(d)在中性條件下溫育近似相等摩爾量的連接的抗體A與連接的抗體B以形成連接的雙特異性抗體AB。優(yōu)選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B是在還原劑中進(jìn)行的，其中所述還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。優(yōu)選地，具有一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基的抗體A的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分A連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N。優(yōu)選地，具有一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基的抗體B的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分B連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，以形成連接的半抗體B。本公開還提供了一種化學(xué)鎖定的雙特異性抗體AB，其中連接的半抗體A其中N3是–N＝N＝N，結(jié)合于連接的抗體B以形成具有圖10所示結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體AB。本公開提供了來(lái)自IgG類抗體“A”或其片段和IgG類抗體“B”的化學(xué)鎖定的雙特異性抗體“AB”或“BA”，其包含具有選自以下結(jié)構(gòu)的半抗體A：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；和其中Z是離去基團(tuán)；和具有選自以下的結(jié)構(gòu)的半抗體B：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh。本公開進(jìn)一步提供了雙特異性抗體，其包含：(a)第一抗體片段A'，其包含來(lái)自抗體A的單一重鏈和輕鏈，所述重鏈具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性巰基基團(tuán)；(b)第二抗體片段B'，其包含單一重鏈和輕鏈，所述重鏈具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性巰基基團(tuán)；其中所述第一和第二抗體片段通過經(jīng)由疊氮化物和炔的環(huán)加成反應(yīng)形成的1,2,3-三唑共價(jià)連接，所述疊氮化物通過接頭連接于所述第一抗體片段的反應(yīng)性巰基，和炔通過接頭連接于所述第二抗體片段的反應(yīng)性巰基。上文描述了接頭?？贵w片段A'和B'衍生自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白或其Fab2片段。本公開進(jìn)一步提供了與接頭共價(jià)鍵合的抗體片段，其中所述接頭包含具有能夠與疊氮化物發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)的-C≡C-鍵的C8環(huán)。本公開還提供了與接頭共價(jià)鍵合的抗體片段，其中所述接頭包含能夠與-C≡C-鍵發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)的疊氮化物。優(yōu)選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B在還原劑中進(jìn)行，其中所述還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。優(yōu)選地，具有一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基的抗體A的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分A連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N連接于半抗體A的鉸鏈核心序列的一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基(EU索引編號(hào)：殘基226和229；Kabat編號(hào)：殘基239和242)以形成連接的半抗體A；(c)將選自以下的化合物連接于抗體B的鉸鏈核心序列的一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基226和229(EU索引編號(hào)：殘基226和229；Kabat編號(hào)：殘基239和242)以形成連接的抗體B：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh；和(d)在中性條件下溫育近似相等摩爾量的連接的抗體A與連接的抗體B以形成連接的雙特異性抗體AB。優(yōu)選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B是在還原劑中進(jìn)行的，其中所述還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合。優(yōu)選地，具有一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基的抗體A的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分A連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh其中N3是–N＝N＝N。優(yōu)選地，具有一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基的抗體B的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分B連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，以形成連接的半抗體B。本公開還提供了一種化學(xué)鎖定的雙特異性抗體AB，其中連接的半抗體A其中N3是–N＝N＝N；結(jié)合于連接的抗體B以形成具有圖10所示結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體AB。本公開提供了來(lái)自IgG類抗體“A”和IgG類抗體“B”的化學(xué)鎖定的雙特異性抗體“AB”或“BA”，其包含具有選自以下的結(jié)構(gòu)的半抗體A：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N，和其中Z是離去基團(tuán)，其結(jié)合于；和具有選自于以下的結(jié)構(gòu)的半抗體B：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh。附圖說(shuō)明圖1顯示了設(shè)置通過與IgG類抗體的鉸鏈區(qū)中的單個(gè)Cys殘基的化學(xué)偶聯(lián)來(lái)產(chǎn)生雙特異性mAb的示意圖。圖2顯示了根據(jù)本公開通過與IgG類抗體的鉸鏈區(qū)中的單個(gè)Cys殘基化學(xué)偶聯(lián)的鏈間交聯(lián)的示意圖。圖3顯示了與IgG類抗體的鉸鏈區(qū)內(nèi)的兩個(gè)Cys殘基鏈內(nèi)交聯(lián)的示意圖。圖4顯示(上和下)通過與IgG類抗體的鉸鏈區(qū)內(nèi)的兩個(gè)Cys殘基的鏈間交聯(lián)產(chǎn)生雙特異性mAb的示意圖。圖5顯示化學(xué)鎖定的半mAb片段的SDSPAGE分析。圖6顯示來(lái)自裸mAb(上)、疊氮化物偶聯(lián)的mAb片段(中間)和炔偶聯(lián)的mAb片段(下)的HCFab的MS分析。圖7顯示來(lái)自疊氮化物連接的半mAb和炔連接的半mAb片段的交聯(lián)產(chǎn)物的SDSPAGE。圖8顯示來(lái)自初始mAb(上)和交聯(lián)產(chǎn)物(下)的(Fab)2的MS分析。圖9顯示了本文實(shí)施例4中產(chǎn)生的化學(xué)修飾的半抗體片段的非還原SDSPAGE(泳道2和3)。圖10顯示通過兩個(gè)半抗體片段之間的點(diǎn)擊偶聯(lián)(Clickconjugation)產(chǎn)生雙特異性抗體。圖11顯示半抗體片段(a)和點(diǎn)擊產(chǎn)物(b)的非還原SDSPAGE。半抗體-疊氮化物在凝膠(a)的泳道2中，和半抗體-DBCO在凝膠(a)中的泳道3。點(diǎn)擊產(chǎn)物在凝膠(b)中的泳道2中。圖12顯示了示出雙特異性抗體CBA-0710的質(zhì)量的IdeS消化的點(diǎn)擊產(chǎn)物的質(zhì)譜。圖13顯示雙特異性抗體CBA-0710的SEC尺寸排阻色譜。圖14顯示雙特異性抗體CBA-0710在BIAcore上的結(jié)合。更具體地，圖14顯示雙特異性抗體CBA-0710與BIAcore上的兩種抗原的2個(gè)同時(shí)的結(jié)合。圖15顯示雙特異性抗體CBA-0710與三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231結(jié)合。該細(xì)胞表達(dá)抗原-1和抗原-2。STI-A0607是抗抗原-1單克隆抗體，和STI-A1010是抗抗原-2單克隆抗體。圖16顯示雙特異性抗體CBA-0710在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的拮抗活性。STI-A0607是抗抗原-1單克隆抗體，和STI-A1010是抗抗原2單克隆抗體。HGF是抗原-1的天然配體。圖17顯示了響應(yīng)于雙特異性抗體CBA-0710的IFN-γ釋放增加。STI-A1010是抗抗原-2(免疫檢查點(diǎn))單克隆抗體。競(jìng)爭(zhēng)mAb是人源化抗抗原-2(免疫檢查點(diǎn))單克隆抗體。圖18顯示響應(yīng)于雙特異性抗體CBA-0710的IL-2釋放增加。STI-A1010是抗抗原-2(免疫檢查點(diǎn))單克隆抗體。競(jìng)爭(zhēng)mAb是人源化抗抗原-2(免疫檢查點(diǎn))單克隆抗體。圖19顯示與常規(guī)抗-c-MetIgG1和抗-PD-L1IgG1抗體相比，由A抗c-Met抗體和B抗PD-L1抗體組成的化學(xué)鎖定雙特異性抗體改善的功效。圖20顯示通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生雙特異性F(ab)'2的示意圖。圖21顯示F(ab)'2和F(ab)'的SDS_PAGE凝膠分析。第1列是用IdeS消化的抗體A。第2列是用IdeS消化的抗體B。第3列是經(jīng)消化并除去FC的抗體A。第4列是經(jīng)消化并除去FC的抗體B。第5列是經(jīng)消化并去除FC，用2MEA和TCEP還原和與DBCO(二苯并環(huán)辛基)-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的抗體A。第6列是經(jīng)消化并去除FC，用2MEA和TCEP還原和與疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的抗體B。圖22顯示通過兩個(gè)F(ab)'片段之間的點(diǎn)擊偶聯(lián)產(chǎn)生F(ab)'2化學(xué)鎖定雙特異性抗體的示意圖。圖23顯示了來(lái)自本文實(shí)施例7的點(diǎn)擊F(ab)'2的SEC。圖24顯示點(diǎn)擊雙特異性F(ab)'2片段分析SDSPAGE。第1列是經(jīng)消化并除去FC的抗體A，并用與DBCO(二苯并環(huán)辛基)-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的2MEA和TCEP還原。第2列是經(jīng)消化并且除去FC的抗體B，并用與疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的2MEA和TCEP還原。第3列是點(diǎn)擊_雙特異性F(ab)'2。圖25顯示了點(diǎn)擊產(chǎn)物的質(zhì)譜，其示出了雙特異性F(ab)'2的質(zhì)量。圖26示出了點(diǎn)擊F(ab)'2的SEC。圖27顯示雙特異性F(ab)'2與OctetRed上的兩種抗原的同時(shí)結(jié)合。圖28顯示了通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生雙特異性IgG2的示意圖。圖29顯示IgG2片段分析SDSPAGE。第1列是抗體A。第2列是用TCEP還原并與疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的抗體A。第3列是抗體B。第4列是用TCEP還原并與疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的抗體B。圖30A-C顯示了質(zhì)譜圖，其示出了與接頭偶聯(lián)的IgG2_A(圖30A)、與接頭偶聯(lián)的IgG2_B(圖30B)和IgG2_A與IgG2_B之間形成的雙特異性IgG2(圖30C)的質(zhì)量。圖31顯示了IgG2_A、IgG2_B和點(diǎn)擊產(chǎn)物的SEC。具體實(shí)施方式雙特異性抗體(BsAb)由在鉸鏈區(qū)化學(xué)連接的兩個(gè)半抗體片段組成(圖1)。初始抗體是IgG1或IgG4同種型。初始抗體可以含有修飾的鉸鏈區(qū)，其中Cys殘基首先突變?yōu)镾er，在鉸鏈處僅留下一個(gè)二硫鍵。雙特異性抗體的產(chǎn)生涉及三個(gè)主要步驟。第一步是選擇性地還原抗體A和B兩者以形成半抗體片段。第二步是通過基于半胱氨酸的偶聯(lián)將功能性部分X或Y引入每個(gè)半抗體片段的鉸鏈區(qū)中，分別導(dǎo)致化學(xué)修飾的抗體片段半體A'和B'。在最后一步中，兩個(gè)抗體片段半體通過X和Y部分之間的化學(xué)接合連接在一起，以形成雙特異性抗體。本公開提供了用于從IgG類抗體“A”和IgG類抗體“B”產(chǎn)生化學(xué)鎖定的雙特異性抗體“AB”或“BA”的方法，其包括：(a)還原具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號(hào)：殘基226-229；Kabat編號(hào)：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第一抗體“A”和具有鉸鏈殘基序列(EU索引編號(hào)：殘基226-229；Kabat編號(hào)：殘基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第二抗體“B”以形成半抗體A和半抗體-B，其中抗體A結(jié)合第一靶標(biāo)和抗體B結(jié)合第二靶標(biāo)，由此還原條件破壞具有鉸鏈殘基序列(殘基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的一類抗體的鉸鏈區(qū)中的任何鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵；(b)將來(lái)自式I的化合物連接于半抗體A的鉸鏈核心序列的一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基(EU索引編號(hào)：殘基226和229；Kabat編號(hào)：殘基239和242)以形成連接的半-抗體A，其具有選自于以下的結(jié)構(gòu)：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；(c)將來(lái)自式II的化合物連接于抗體B的鉸鏈核心序列的一個(gè)或兩個(gè)Cys殘基(EU索引編號(hào)：殘基226和229；Kabat編號(hào)：殘基239和242)以形成連接的抗體B，其具有選自于以下的結(jié)構(gòu)：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh；和(d)在中性條件下溫育近似相等摩爾量的連接的抗體A與連接的抗體B以形成連接的雙特異性抗體AB。優(yōu)選地，在還原劑，如L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合中進(jìn)行抗體A的還原以形成半抗體A和抗體B的還原以形成半抗體B。優(yōu)選地，具有兩個(gè)Cys殘基的抗體A的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分A連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh其中N3是–N＝N＝N。優(yōu)選地，具有兩個(gè)Cys殘基的抗體B的鉸鏈區(qū)與具有選自以下的結(jié)構(gòu)的部分B連接：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh。本公開進(jìn)一步提供了一種化學(xué)鎖定的雙特異性抗體AB，其中連接的半抗體A其中N3是–N＝N＝N；結(jié)合于連接的抗體B以形成具有圖10所示結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體AB。本公開提供了來(lái)自IgG類抗體“A”和IgG類抗體“B”的化學(xué)鎖定的雙特異性抗體“AB”或“BA”，其包含具有選自以下的結(jié)構(gòu)的半抗體A：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh，其中N3是–N＝N＝N；和具有選自于以下的結(jié)構(gòu)的半抗體B：M＝N、CM’＝N、CZ＝I、Br、SPh。優(yōu)選地，抗體A還原以形成半抗體A和抗體B還原以形成半抗體B是在還原劑如，L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合中進(jìn)行的。優(yōu)選地，抗體A和B是單克隆抗體。單克隆抗體可以通過雜交瘤方法或通過重組DNA和蛋白質(zhì)表達(dá)方法產(chǎn)生。此外，抗體A和B是全長(zhǎng)抗體或是抗體片段?？贵wA和B具有CPPC核心鉸鏈區(qū)序列或CPSC核心鉸鏈區(qū)序列或SPPC核心鉸鏈區(qū)序列或SPSC核心鉸鏈區(qū)序列(EU索引編號(hào)：殘基226-229；Kabat編號(hào)：殘基239-242)。此外，步驟(d)溫育還包括添加還原劑的步驟，其中還原劑選自L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巰基乙胺)及其組合?？梢允褂贸Ｒ?guī)生物化學(xué)技術(shù)如吸光度測(cè)量、HP-SEC、SDS-PAGE、非變性PAGE和RP-HPLC來(lái)分析所得的雙特異性抗體的質(zhì)量和純度。應(yīng)當(dāng)注意，因?yàn)槭絀的接頭對(duì)式II的接頭的親和性的特異性，所公開的方法通常避免任何純化步驟。然而，在US2010/0105874中提供了各種純化步驟，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。所公開的方法還包括配制雙特異性抗體用于治療用途的步驟。這通過在適合人類使用的，特別是適于腸胃外或靜脈內(nèi)施用的水性溶液中有效量的雙特異性抗體的制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。圖2顯示了通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體(mAb)的方案。本文所述的雙特異性mAb由在鉸鏈區(qū)化學(xué)連接的兩個(gè)半抗體片段組成。雙特異性mAb產(chǎn)生的過程包括三個(gè)主要步驟(圖2)。第一步是分別在兩種不同mAbA和B中選擇性還原鉸鏈二硫鍵。第二步是通過接頭X或Y誘導(dǎo)每個(gè)mAb中相同重鏈上的兩個(gè)半胱氨酸之間的鏈內(nèi)連接。鏈內(nèi)連接過程產(chǎn)生兩個(gè)化學(xué)鎖定的mAb片段A'和B'。在最后一步中，兩個(gè)mAb片段通過X和Y之間的化學(xué)接合連接在一起，以形成雙特異性抗體AB。具有鉸鏈突變(CPSC)的IgG1、wtIgG4和具有鉸鏈突變(SPSC)的IgG4用于本研究中。第一步是還原抗體A和抗體B中的每一個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM的二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩爾當(dāng)量的2-巰基乙胺(2-MEA)在37℃下處理抗體(10mg)2小時(shí)。過量的2-MEA使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM的離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進(jìn)行總共三次洗滌。蛋白質(zhì)濃度對(duì)于1.0mg/mL溶液使用在280nm處1.58的吸光度值來(lái)定量，并且使用150,000g/mol的分子量測(cè)定摩爾濃度。在還原步驟的另一個(gè)實(shí)施方式中，將抗體(10mg)用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩爾當(dāng)量的二硫蘇糖醇(DTT)在24℃下處理2小時(shí)。過量的DTT使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘，從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進(jìn)行總共3次洗滌。在還原步驟的另一個(gè)實(shí)施方式中，將mAb(10mg)用在0.1MPBSpH8.0，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0摩爾當(dāng)量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下處理2小時(shí)。mAb濃度為8.0mM。在不純化的情況下，部分還原的mAb直接用于偶聯(lián)步驟。第二步是偶聯(lián)步驟。將在0.1MPBS中的來(lái)自還原步驟的部分還原的mAb“抗體A”加入到2.5摩爾當(dāng)量的交聯(lián)劑Z-X-Z中(圖2和圖3)。交聯(lián)劑取自預(yù)制備的DMSO儲(chǔ)備溶液(1mg/mL)。在反應(yīng)混合物中，部分還原抗體濃度為8.0mg/mL，和DMSO含量為5％(v/v)。在24℃下進(jìn)行偶聯(lián)2小時(shí)。用半胱氨酸(1mM終濃度)來(lái)淬滅任何未反應(yīng)的過量交聯(lián)劑。使用磷酸鹽緩沖鹽水平衡的PD-10柱純化偶聯(lián)的mAb。偶聯(lián)的mAb結(jié)構(gòu)示于圖4中。在相同條件下，將第二mAb(抗體B)與交聯(lián)劑Z-Y-Z(圖5和圖6)偶聯(lián)并純化。偶聯(lián)的mAb結(jié)構(gòu)示于圖7和圖8中。第三步是鏈間偶聯(lián)步驟。在圖9中說(shuō)明了用于鏈間交聯(lián)的點(diǎn)擊偶聯(lián)。簡(jiǎn)言之，對(duì)于在0.5mLPBS(0.1M，pH7.4)中的疊氮化修飾的抗體片段(3.0mg)，加入0.5mLPBS(0.1M，pH7.4)中的3.0mg的炔修飾的抗體片段。向該混合物中加入50μL乙腈且乙腈的最終含量為5％(v/v)。在室溫下反應(yīng)3小時(shí)后，使用100kDa過濾器離心管在3,000RPM下離心20分鐘來(lái)純化混合物。將混合物用PBS洗滌3次，并將所得產(chǎn)物進(jìn)行體外表征。實(shí)施例1該實(shí)施例表明了根據(jù)所公開的方法的雙特異性抗體的合成。圖4顯示了通過與IgG類抗體的鉸鏈區(qū)中的兩個(gè)Cys殘基的化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體(mAb)的方案。所公開的雙特異性mAb由在其各自鉸鏈區(qū)處化學(xué)連接的兩個(gè)半抗體片段組成。合成雙特異性mAb的方法包括圖5中所示的三個(gè)主要步驟。第一步是分別在兩種不同的mAb(A和B)中選擇性地還原鉸鏈二硫鍵。第二步是通過接頭X或Y在每個(gè)mAb中誘導(dǎo)相同重鏈上的兩個(gè)半胱氨酸之間的鏈內(nèi)連接。鏈內(nèi)連接過程產(chǎn)生兩個(gè)化學(xué)鎖定的mAb片段A'和B'。在最后一步中，兩個(gè)mAb片段通過X和Y之間的化學(xué)接合連接在一起以形成雙特異性抗體AB。更具體地，我們獲得了抗體“A”，一種具有鉸鏈突變(CPSC)的IgG1，和抗體“B”，一種野生型IgG4。第一步是抗體還原。條件1：將抗體(10mg)單獨(dú)地用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩爾當(dāng)量的2-巰基乙胺(2-MEA)在37℃下處理2小時(shí)。過量的2-MEA使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb中純化掉。用0.1MPBS進(jìn)行總共三次洗滌。對(duì)于1.0mg/mL溶液使用280nm處1.58的吸光度值對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量，并使用150,000g/mol的分子量測(cè)定摩爾濃度。條件2：用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩爾當(dāng)量的二硫蘇糖醇(DTT)在24℃下處理抗體(10mg)2小時(shí)。過量的DTT使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進(jìn)行總共3次洗滌。條件3：用在0.1MPBSpH8.0，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0M摩爾當(dāng)量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下處理mAb(10mg)2小時(shí)。mAb濃度為8.0mM。在不純化的情況下，部分還原的mAb直接用于偶聯(lián)。實(shí)施例2該實(shí)施例顯示，在實(shí)施例1中制備的雙特異性抗體保留了其原始半Mab的兩種結(jié)合特征。1-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮的合成：向在60mLTHF中的2.5g3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)和1gNMM滴加MeOCOCl(10mmol，940mg，在10mlDCM中)，攪拌20分鐘，然后將反應(yīng)溶液用60mLDCM稀釋，用水洗滌3次，將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉攪拌，濃縮，得到2.65g3,4-二溴-2,5-二氧代-2H-吡咯-1(5H)-羧酸甲基酯。向311mg，1mmol該化合物中加入2-(2-疊氮基乙氧基)乙胺(130mg，1mmol)和5mLDCM，TLC顯示反應(yīng)在20分鐘內(nèi)完成，然后通過DCM和鹽水萃取，用NH4Cl溶液洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，且然后濃縮用于柱純化，用2:1己烷和乙酸乙酯閃蒸，得到230mg的1-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮。1HNMR：3.32ppm(t，J＝5.0Hz，1H)，3.40ppm(t，J＝5.0Hz，1H)，3.50ppm(q，J＝5.0Hz，1H)，3.62ppm(t，J＝，1H)，3.63-3.69ppm(m，3H)，3.84ppm(t，J＝5Hz，1H)。Fw：365.9，C8H8Br2N4O3；質(zhì)譜峰(1:2:1)：366.9,368.9,370.9。實(shí)施例3該實(shí)施例說(shuō)明了使用位于IgG類抗體的鉸鏈區(qū)中的單個(gè)Cys殘基來(lái)化學(xué)產(chǎn)生雙特異性抗體。本文所述的起始mAb含有工程化的鉸鏈區(qū)，其中各條鏈上相同位置處的一個(gè)Cys突變?yōu)镾er，從而產(chǎn)生僅留下單一二硫鍵的鉸鏈。雙特異性mAb產(chǎn)生的過程包括三個(gè)主要步驟(圖1)。第一步是分別在兩種不同的mAbA和B中選擇性地還原鉸鏈二硫鍵。第二步是通過基于半胱氨酸的偶聯(lián)引入功能性基團(tuán)X或Y。Cys-連接步驟產(chǎn)生兩個(gè)化學(xué)鎖定的mAb片段A'和B'。在最后一步中，兩個(gè)mAb片段通過X和Y之間的化學(xué)接合連接在一起以形成雙特異性抗體AB。在本研究中使用具有鉸鏈區(qū)突變(SPPC)的IgG1單克隆抗體。條件1：用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩爾當(dāng)量的2-巰基乙胺(2-MEA)在37℃下處理抗體(10mg)2小時(shí)。過量的2-MEA使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1MPBS進(jìn)行總共三次洗滌。對(duì)于1.0mg/mL溶液使用在280nm處1.58的吸光度值來(lái)定量蛋白質(zhì)濃度，并且使用150,000g/mol的分子量測(cè)定摩爾濃度。條件2：用在0.1MPBSpH7.4，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩爾當(dāng)量的二硫蘇糖醇(DTT)在24℃下處理抗體(10mg)2小時(shí)。過量的DTT使用50kDa過濾器離心管伴隨3,000RPM下離心20分鐘從部分還原的mAb純化掉。用0.1M的PBS進(jìn)行總共3次洗滌。條件3：用在0.1MPBSpH8.0，1.0mM二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0M摩爾當(dāng)量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下處理mAb(10mg)2小時(shí)。mAb濃度為8.0mM。在不純化的情況下，部分還原的mAb直接用于偶聯(lián)。實(shí)施例4該實(shí)施例顯示了根據(jù)本文公開的方法制備雙特異性抗體且具有將各個(gè)半抗體片段的鉸鏈區(qū)彼此連接的所公開的化學(xué)連接結(jié)構(gòu)的方法?？贵w支架是：具有鉸鏈突變(SPSC)的IgG4。我們首先通過化學(xué)修飾改變各Ig抗體以產(chǎn)生半抗體。具體地，緩沖液交換反應(yīng)將抗體(0.5-3mg)加入到15mL的過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，并添加適當(dāng)量的pH8.0的PBS1mMDTPA(二亞乙基三胺五乙酸)緩沖液至管上的50mL標(biāo)記。將管在5℃下以3,000RPM離心20分鐘。將抗體轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料小瓶中并使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度計(jì))檢查濃度。最終抗體濃度在5-8mg/mL之間。制備在pH8.0PBS(1.0mMDTPA)緩沖液中1mg/mLTCEP((三(2-羧乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的儲(chǔ)備溶液。我們使用下表計(jì)算需要加入到抗體中的TCEP溶液的體積，這取決于緩沖液交換后回收的抗體的當(dāng)量數(shù)和最終質(zhì)量。將適當(dāng)量的TCEP溶液(通過上表計(jì)算)加入到抗體溶液中，輕輕渦旋，并將小瓶置于轉(zhuǎn)盤上。在室溫下進(jìn)行還原反應(yīng)90分鐘?；谏媳淼挠?jì)算制備在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的DBCO-馬來(lái)酰亞胺(ClickChemistryTools，A108-100)儲(chǔ)備溶液。將DMSO中的DBCO-馬來(lái)酰亞胺加入到抗體樣品(無(wú)TCEP的純化)中?？贵w樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下在通過轉(zhuǎn)盤的混合條件下將偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。將每個(gè)樣品置于單獨(dú)的15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，并加入適當(dāng)量的1XDPBS(Corning，21-031-CM，無(wú)鈣或鎂)緩沖液至管上的50mL標(biāo)記。將樣品以3,000RPM在5℃下離心20分鐘。再次重復(fù)洗滌步驟。洗滌后，將樣品轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的1.5mL塑料小瓶中，并置于冰箱(5℃)中。對(duì)于IgG4抗體，4.0當(dāng)量的TCEP提供了大量的半抗體。對(duì)于IgG1抗體，3.5當(dāng)量的TCEP提供了大量的半抗體。對(duì)于兩種類型的抗體使用5.0當(dāng)量的DBCO。向在DMSO(0.12mL)中的DBCO-馬來(lái)酰亞胺(1.0mg，1.0當(dāng)量)溶液中加入在DMSO(0.6mL)中的疊氮基-PEG4-疊氮化物(2.5mg，5.0當(dāng)量)。將混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。如通過LC/MS所示反應(yīng)完成。所得疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺的分子量為627.65g/mol。疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺合成(方案1)：方案1.疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺的合成將DMSO中的疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺(5.0當(dāng)量)加入到抗體樣品中?？贵w樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在通過轉(zhuǎn)盤的混合下將偶聯(lián)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。如前所述洗滌樣品。通過疏水相互作用柱(HIC)純化各半抗體片段。HIC分析使用TOSOH丁基-NPR柱在40℃柱溫和0.6mL/min流速下進(jìn)行。在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中降低的鹽濃度(從1.5至0M硫酸銨)和增加的有機(jī)改性劑(從0％至25％異丙醇)的30分鐘梯度實(shí)現(xiàn)洗脫。通過SDSPAGE分析半抗體片段。具體地，對(duì)于每個(gè)待分析的樣品，需要0.6mg/mL濃度的20μL。我們遵循建立方案運(yùn)行SDS-PAGE凝膠(RTPAD001-01和AD002-01)。圖9顯示化學(xué)修飾的半抗體片段(泳道2和3)的非還原SDSPAGE。實(shí)施例5該實(shí)施例說(shuō)明了通過點(diǎn)擊反應(yīng)產(chǎn)生雙特異性抗體。圖10顯示通過兩個(gè)半抗體片段之間的點(diǎn)擊偶聯(lián)產(chǎn)生雙特異性抗體。兩個(gè)半抗體片段之間的點(diǎn)擊反應(yīng)示于圖10中。向在PBS中的半抗體疊氮化物片段(500μg)(5.0mg/mL)中加入PBS中的半抗體-DBCO片段(500μg)(5.0mg/mL)。反應(yīng)在室溫下在通過轉(zhuǎn)盤的混合條件下進(jìn)行2小時(shí)。將混合物進(jìn)行SDSPAGE分析(圖11)并通過離子交換色譜純化。在Agilent1200HPLC上使用ThermoWCX-10柱以0.6mL/min流速純化雙特異性抗體。用在pH5.7的10mMMES緩沖液中增加的鹽濃度(從0至100mMNaCl)的30分鐘梯度實(shí)現(xiàn)洗脫。通過IdeS蛋白酶消化雙特異性抗體STICBA-0710，并在WaterXevoG-2QTOF質(zhì)譜上進(jìn)行分析和確認(rèn)(圖12)。通過雙特異性抗體的尺寸排阻色譜(SEC)確定雙特異性抗體STICBA-0710的生物物理性質(zhì)(圖13)。具體地，在Agilent1200HPLC上使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)分析雙特異性抗體。緩沖液為0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。表2.雙特異性抗體CBA-0710的SEC數(shù)據(jù)主HMWSLMWS98.3％1.2％0.5％圖14顯示雙特異性抗體CBA-0710在BIAcore上的結(jié)合。使用標(biāo)準(zhǔn)NHS/EDC偶聯(lián)方法將第一抗原固定在CM5傳感器芯片上至約1500RU。運(yùn)行緩沖液用作基線。加載雙特異性抗體，然后緩沖液，然后進(jìn)行針對(duì)第二抗原的結(jié)合。實(shí)施例6該實(shí)施例顯示了本文產(chǎn)生的雙特異性抗體的各種測(cè)定結(jié)果。存在雙特異性抗體的基于細(xì)胞的結(jié)合和功能。雙特異性抗體CBA-0710結(jié)合MDA-MB-231(人乳腺癌)細(xì)胞(圖15)，如通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的。測(cè)定了抗體的EC50值。用無(wú)酶細(xì)胞解離緩沖液(GIBCO)收獲表達(dá)抗原-1和抗原-2兩者的MDA-MB-231三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至V-形底96孔板(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)。將細(xì)胞與FACS緩沖液(PBS+2％FBS)+NaN3中的雙特異性抗體CBA-0710或者親本單特異性抗抗原-1或抗抗原-2抗體的系列稀釋物在冰上溫育45分鐘。在FACS緩沖液中洗滌2次后，加入1：1000稀釋的藻紅蛋白偶聯(lián)抗人IgG(γ-鏈特異性的)，并溫育30分鐘。在最后洗滌后，在Intellicyt高通量流式細(xì)胞儀(HTFC)上測(cè)量熒光強(qiáng)度。使用GraphpadPrism軟件和非線性回歸擬合分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示為陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的中值熒光強(qiáng)度(MFI)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。EC50值報(bào)告為達(dá)到與細(xì)胞的50％最大結(jié)合的抗體濃度。結(jié)果示于表3和圖15中，并且顯示與親本類型相比，雙特異性抗體與MDA-MB-231細(xì)胞的結(jié)合改善，具有類似于抗-抗原-2抗體的亞納摩爾EC50值，和與抗抗原-1抗體一樣高的結(jié)合強(qiáng)度。表3.雙特異性抗體和親本型抗體的結(jié)合數(shù)據(jù)顯示了雙特異性抗體CBA-0710的拮抗活性。具體來(lái)說(shuō)，按照Phospho-Met(panTyr)SandwichELISA試劑盒#7333方案運(yùn)行雙特異性抗體CBA-0710對(duì)c-MET磷酸化的抑制。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞裂解物加入重構(gòu)的檢測(cè)抗體并溫育，然后加入重構(gòu)的HRP-接頭二級(jí)抗體。洗滌后，加入TMB底物并溫育。加入STOP溶液后，讀取結(jié)果。圖16顯示雙特異性抗體CBA-0710在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的拮抗活性。STI-A0607是抗-抗原-1單克隆抗體，和STI-A1010是抗-抗原2單克隆抗體。HGF是抗原-1的天然配體。存在雙特異性抗體CBA-0710的免疫調(diào)節(jié)活性。為了測(cè)量雙特異性抗體CBA-0710調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)性的能力，將純化的CD4+細(xì)胞與同種異基因樹突細(xì)胞一起培養(yǎng)，其通過在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)單核細(xì)胞7天而制備。設(shè)置平行平板以允許在第3天和第5天收集上清液而使用商業(yè)ELISA試劑盒分別測(cè)量IL-2和IFNγ。競(jìng)爭(zhēng)的人源化抗-抗原-2(免疫檢查點(diǎn))mAb內(nèi)部產(chǎn)生并用作陽(yáng)性對(duì)照IgG1，并且不相關(guān)的STI人mAb用作陰性對(duì)照IgG抗體。圖17顯示響應(yīng)于雙特異性抗體CBA-0710的IFN-γ釋放增加。STI-A1010是抗-抗原-2(免疫檢查點(diǎn))單克隆抗體。競(jìng)爭(zhēng)mAb是人源化抗-抗原-2(免疫檢查點(diǎn))單克隆抗體。實(shí)施例7該實(shí)施例說(shuō)明了使用F(ab)'2抗體A'和B'合成所公開的雙特異性抗體的方案。本文所述的雙特異性F(ab)'2由在鉸鏈區(qū)化學(xué)連接的兩個(gè)F(ab)'片段組成(圖20)。起始抗體是IgG1或IgG4同種型。起始抗體含有修飾的鉸鏈區(qū)，其中Cys殘基突變?yōu)镾er殘基，從而在鉸鏈區(qū)僅留下一個(gè)二硫鍵。雙特異性F(ab)'2化學(xué)鎖定雙特異性抗體的產(chǎn)生涉及四個(gè)主要步驟。第一步是除去Fc片段。第二步是分別選擇性還原抗體A和B。第三步是通過基于半胱氨酸的偶聯(lián)在鉸鏈區(qū)中引入功能性部分X或Y，從而分別產(chǎn)生化學(xué)修飾的抗體片段A'和B'。在最后一步中，兩個(gè)抗體片段通過X和Y之間的化學(xué)接合連接在一起以形成雙特異性F(ab)'2。該合成的方案示于圖21中。具體地，我們進(jìn)行了用具有鉸鏈突變(SPPC)的IgG1A抗體和具有鉸鏈突變(SPSC)的IgG4B抗體合成F(ab)'2化學(xué)鎖定雙特異性抗體的方法。使用酶IdeS(其是僅在鉸鏈區(qū)之下的一個(gè)特異性位點(diǎn)切割I(lǐng)gG的消化酶)，將抗體(1.5mg)加入到IdeS(A0-FR1-008)的各個(gè)管中，并在37℃下在翻轉(zhuǎn)式搖床(headtoheadspinner)上溫育過夜。然后使用蛋白A純化除去Fc片段。將抗體(1-10mg)加入到15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，并加入適當(dāng)量的50mM磷酸鈉，150mMNaCl，5mMEDTA，pH7.7緩沖液至管上的50mL標(biāo)記。將管在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。將抗體轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料小瓶中，并使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度計(jì))檢查濃度。最終抗體濃度高達(dá)10mg/mL。向含有6mg2-巰基乙胺·HCl的一個(gè)小瓶中加入1mL的50mM磷酸鈉，150mMNaCl，5mMEDTA，pH7.7緩沖液(得到50mM2-MEA)。加入50mM2-MEA至F(ab)'2終濃度15mM，充分混合。在37℃下溫育15分鐘。使用NAP-5(GE17-0853-02)脫鹽柱從還原的F(ab)'2分離2-MEA。制備在pH8.0的PBS(1.0mMDTPA)緩沖液中的1mg/mLTCEP((三(2-羧乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的儲(chǔ)備溶液。取決于蛋白A純化后回收的F(ab)'2的當(dāng)量數(shù)和最終質(zhì)量，將5當(dāng)量的TCEP加入到脫鹽的F(ab)'中，充分振搖，并在室溫下溫育5分鐘。對(duì)于DBCO(二苯并環(huán)辛基)-馬來(lái)酰亞胺和疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)，制備DBCO-馬來(lái)酰亞胺(ClickChemistryTools，A108-100)在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的儲(chǔ)備溶液，并且將在DMSO中的20當(dāng)量的DBCO-馬來(lái)酰亞胺加入到F(ab)'(A)樣品(沒有TCEP的純化)中?？贵w樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉(zhuǎn)盤的混合進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。將在DMSO中的疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺(20當(dāng)量)加入到F(ab)'(B)樣品中?？贵w樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉(zhuǎn)盤的混合進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)。對(duì)于洗滌步驟，將每個(gè)樣品置于單獨(dú)的15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，并加入適當(dāng)量的1XDPBS(Corning，21-031-CM，無(wú)鈣或鎂)緩沖液至管上的50mL標(biāo)記。將樣品在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。再次重復(fù)洗滌步驟。洗滌后，將樣品轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的1.5mL塑料小瓶中，并置于冰箱(5℃)中或用于點(diǎn)擊步驟。對(duì)于F(ab)'片段分析，使用SDSPAGE程序。對(duì)于每個(gè)待分析的樣品，需要濃度為0.6mg/mL的20μL。遵循已建立的方案運(yùn)行SDS-PAGE凝膠(RTPAD001-01和AD002-01)(圖21)。兩個(gè)F(ab)'片段之間的點(diǎn)擊反應(yīng)方案示于圖23中。向PBS中的F(ab)'-疊氮化物片段(500μg)(5.0mg/mL)中加入PBS中的F(ab)'-DBCO片段(500μg)(5.0mg/mL)。在室溫下通過轉(zhuǎn)盤的混合進(jìn)行反應(yīng)過夜。將混合物進(jìn)行SEC分析(圖24)。使用尺寸排阻色譜(SEC)分析在本實(shí)施例中制備的雙特異性抗體的生物物理性質(zhì)。使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)的尺寸排阻色譜(SEC)Agilent1200HPLC分析F(ab)'_A、F(ab)'_B和雙特異性點(diǎn)擊_F(ab)'2(圖24)。緩沖液0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。通過質(zhì)譜法證實(shí)雙特異性F(ab)'2。在WaterXevoG-2QTOF9上分析雙特異性F(ab)'2(圖25)。使用尺寸排阻色譜(SEC)純化雙特異性F(ab)'2。使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)的尺寸排阻色譜(SEC)Agilent1200HPLC用于純化雙特異性點(diǎn)擊_F(ab)'2(圖26)。緩沖液0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。體外親和力測(cè)量是使用OctetRed的測(cè)量(圖27)。傳感器AR2G用于測(cè)量OctetRed(ForteBio，Inc.)上的雙特異性F(ab)'2抗原相互作用。簡(jiǎn)言之，測(cè)量方案如下：300秒基線；300秒加載10μg/ml雙特異性F(ab)'2，120秒基線；300秒抗原A；300秒解離；300秒抗原B和300秒解離(圖27)。在PBS中進(jìn)行傳感器水合及基線-和解離測(cè)量。實(shí)施例8該實(shí)施例說(shuō)明了使用IgG2抗體A'和B'合成所公開的雙特異性抗體的方案。本文所述的雙特異性IgG2由在鉸鏈區(qū)化學(xué)連接的兩個(gè)IgG2片段組成(圖29)。起始抗體是IgG2同種型。雙特異性IgG2的產(chǎn)生涉及三個(gè)主要步驟。第一步是還原IgG2抗體鉸鏈區(qū)中的(四個(gè)中的)一個(gè)或兩個(gè)二硫鍵，其仍然保持同源二聚體結(jié)構(gòu)。第二步是通過基于半胱氨酸的偶聯(lián)在鉸鏈中引入功能性部分X或Y，從而分別導(dǎo)致化學(xué)修飾的抗體片段A'和B'。在最后一步中，通過X和Y之間的化學(xué)接合將兩種抗體連接在一起以形成雙特異性IgG2。具體地，我們進(jìn)行了用于合成IgG2化學(xué)鎖定的雙特異性抗體的方法。將抗體(1-10mg)加入到15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，并加入適當(dāng)量的50mM磷酸鈉、150mMNaCl、5mMEDTA，pH7.7緩沖液至管上的50mL標(biāo)記。將管在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。將抗體轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料小瓶中，并使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度計(jì))檢查濃度。最終抗體濃度高達(dá)10mg/mL。制備在pH8.0的PBS(2.0mMDTPA)緩沖液中的1mg/mL的TCEP((三(2-羧基乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的儲(chǔ)備溶液。根據(jù)IgG2的當(dāng)量數(shù)和所得質(zhì)量，將2當(dāng)量的TCEP加入到IgG2溶液中，充分搖動(dòng)并在室溫下溫育90分鐘。DBCO(二苯并環(huán)辛基)-馬來(lái)酰亞胺和疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺為了偶聯(lián)，制備DBCO-馬來(lái)酰亞胺(ClickChemistryTools，A108-100)在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的儲(chǔ)備溶液，并將DMSO中的5當(dāng)量的DBCO-馬來(lái)酰亞胺加入到IgG2_A樣品(沒有TCEP的純化)。抗體樣品中的DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉(zhuǎn)盤的混合進(jìn)行1小時(shí)偶聯(lián)反應(yīng)。將DMSO中的疊氮化物-馬來(lái)酰亞胺(5當(dāng)量)加入到IgG2(B)樣品中。抗體樣品中DMSO的最終量為約5％(v/v)。在室溫下通過轉(zhuǎn)盤的混合進(jìn)行1小時(shí)偶聯(lián)反應(yīng)。對(duì)于洗滌步驟，將每個(gè)樣品置于單獨(dú)的15mL過濾器離心管(Millipore，UFC903024)中，并加入適當(dāng)量的1XDPBS(Corning，21-031-CM，無(wú)鈣或鎂)緩沖液至管上的50mL標(biāo)記。將樣品在22℃下以3,000RPM離心20分鐘。再次重復(fù)洗滌步驟。洗滌后，將樣品轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的1.5mL塑料小瓶中，并置于冰箱(5℃)中或用于點(diǎn)擊步驟。對(duì)于每個(gè)待分析的樣品，需要0.6mg/mL濃度的20μL。遵循已建立的方案運(yùn)行SDS-PAGE凝膠(RTPAD001-01和AD002-01)(圖29)。對(duì)于質(zhì)譜，用TCEP還原抗體A，并與DBCO偶聯(lián)，在WaterXevoG-2QTOF上進(jìn)行分析。該數(shù)據(jù)表明2個(gè)DBCO(僅一個(gè)二硫鍵還原)或4個(gè)DBCO(兩個(gè)二硫鍵還原)與我們的IgG2偶聯(lián)(圖30A-C)。使用尺寸排阻色譜(SEC)分析在該實(shí)施例中制備的雙特異性抗體的生物物理性質(zhì)。使用TSK凝膠SuperSW3000柱(4.6mmID×30cm，4μm)的尺寸排阻色譜(SEC)Agilent1200HPLC來(lái)分析雙特異性IgG2(圖31)。緩沖液0.2M磷酸鉀，0.25MKCl，pH6.2。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3