本發(fā)明屬于魚類細胞研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在魚類生殖系細胞中特異性表達基因的3'UTR區(qū)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牙鲆，俗稱牙片，為鲆鰈魚類，屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，該物種具有性別二態(tài)性。為了獲得更多的雌性個體，近年來針對牙鲆等鲆鰈魚類的養(yǎng)殖進行了性別控制育種、雌核發(fā)育和多倍體育種等多種育種方法的嘗試，但是對魚類生殖腺的發(fā)生和發(fā)育研究仍然面臨諸多困難。為此，對魚類原始生殖細胞(PGCs)進行特異性的識別和分離培養(yǎng)，并通過冷凍保存技術(shù)對優(yōu)良種質(zhì)魚類的PGCs進行保存，不僅可以為魚類生殖調(diào)控進行深入研究，也可為魚類優(yōu)良種質(zhì)的保存提供新的技術(shù)手段和方法。然而，有關(guān)于鲆鰈魚類PGCs特異性的識別和標記的相關(guān)研究尚未見到報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種在魚類生殖系細胞中調(diào)節(jié)基因表達的3′UTR區(qū)序列，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種3′UTR區(qū)序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1；

上述的3′UTR區(qū)序列用于調(diào)控基因在牙鲆原始生殖細胞中進行表達；

作為實施例的優(yōu)選，所述基因為標記基因，例如綠色或紅色等熒光蛋白基因；

本發(fā)明再一個方面提供一種重組報告載體質(zhì)粒，其中插入有上述的3′UTR區(qū)序列；

本發(fā)明另一個方面提供一種研究原始生殖細胞發(fā)生和發(fā)育的方法，是在原始生殖細胞中轉(zhuǎn)入上述的報告載體質(zhì)粒體外合成的mRNA。

本發(fā)明的3′UTR區(qū)序列為牙鲆魚特有的序列，可以用于鲆鰈魚、斑馬魚等魚類生殖系細胞的示蹤以及在魚類生殖系細胞中外源基因特異表達的定位；本發(fā)明為牙鲆等魚類原始生殖細胞的識別、標記、跟蹤、分離奠定了基礎(chǔ)，同時為開展魚類的性別分化機制以及生殖系細胞發(fā)生發(fā)育研究提供了技術(shù)方法。

附圖說明

圖1：3′UTR區(qū)序列的核苷酸序列圖；

圖2：3'UTR RACE第一輪電泳圖；

圖3：3'UTR RACE第二輪電泳圖；

圖4：胚胎早期對PGCs的跟蹤結(jié)果圖；

圖5：體節(jié)期跟蹤結(jié)果圖；

圖6：出膜前跟蹤結(jié)果圖；

圖7：出膜后跟蹤結(jié)果圖。

具體實施方式

原始生殖細胞(PGCs)是生殖細胞的祖細胞，在生殖腺形成之前便在胚胎的特定位置特化形成，之后遷移到原始生殖腺即性原基前的生殖細胞，在性腺分化過程中分化為卵原細胞和精原細胞，并進一步發(fā)育成卵母細胞和精母細胞，隨后經(jīng)過發(fā)育最終產(chǎn)生成熟的配子--卵子和精子。

UTR(Untranslated Regions)即非翻譯區(qū)，是信使RNA(mRNA)分子兩端的非編碼片段。3'UTR區(qū)是從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的末端。3'UTR區(qū)是miRNA作用時結(jié)合的主要位置，引起該基因mRNA的降解，與DNA轉(zhuǎn)錄不大相關(guān)，主要影響的是mRNA翻譯。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：3′UTR區(qū)序列的篩選

1、RNA提取

牙鲆精巢或卵巢的總RNA采用Trizol(Invitrogen)法提取，具體步驟如下：取約0.1g牙鲆性腺，加入1mL Trizol，電動勻漿，室溫放置5min，使其充分裂解后12,000rpm離心5min。將上清轉(zhuǎn)移到新的干凈離心管，加入氯仿0.2mL，溫和混勻，室溫放置15min。4℃12,000rpm離心15min，吸取上層水相，至另一離心管中。加入0.5ml異丙醇,輕輕混勻，-20℃放置20min。4℃12,000rpm離心10min，棄上清，RNA沉于管底。加入預(yù)冷的75％乙醇1mL，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃,8,000rpm離心5min，盡量棄上清。置于超凈臺中使乙醇揮發(fā)。加入DEPC水(無RNA酶)50ul，55℃水浴10min使RNA溶解，取出后置于冰上。加入DNAaseI，37℃水浴2h，去除DNA。利用博邁德的RNA clean清潔純化試劑盒去除蛋白質(zhì)(具體步驟見說明書)，最后用30ulDEPC水溶解RNA。取1ul電泳檢測質(zhì)量及完整度，取1ul測吸光度檢測樣品濃度。剩余RNA樣品-80℃保存。

2、SMARTer 3’RACE cDNA文庫的建立

SMARTer 3’RACE cDNA文庫的合成利用BD SMART^TMRACE cDNA Amplification試劑盒進行，具體操作如下：

配制反應(yīng)體系:RNA 1ug，3’CDS Primer 1ul，Rnase-free H₂O補足5ul?；靹?，瞬時離心；70℃，2min；冰上2min,瞬時離心；加入5ul反應(yīng)體系：5*First-strand Buffer 2ul，DTT(20mM)1ul,dNTP(10mM)1ul,BD PowerScript^TMReverse Transcriptase 1ul。輕輕吹吸混勻，瞬時離心；42℃，90min；72℃，7min；冰上冷卻后，稀釋10倍，至20ng/ul。分裝后，-20℃保存。

3、基因3'UTR的獲得

利用巢式PCR擴增基因的3’UTR區(qū)，PCR所用的引物如下：

Nested Universal Primer A(NUP)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT，(10uM)

3’-GSP-1 GACCTCCCTGTGAACTTGGATGGAAATG

3’-GSP-2 AGCGATGCTGCAGAGATGGAGAAA

擴增反應(yīng)體系(25ul)如下：

3’RACE模板1ul,

10x Taq酶buffer 2.5ul,

dNTP 2.0ul,

NUP 0.5ul,

基因特異性引物0.5ul,

ddH₂0 18.375ul。

將RACE一輪PCR產(chǎn)物跑檢測膠(圖2),RACE二輪PCR產(chǎn)物跑回收膠(圖2)，將目的條帶回收純化。連接到PMD19-T載體上，送測序；獲得了3′UTR區(qū)序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。

實施例2：針對基因3′UTR區(qū)序列構(gòu)建重組報告載體

1、構(gòu)建基因3'UTR報告載體

1)針對基因3’UTR區(qū)設(shè)計一對兩端帶有限制性內(nèi)切酶位點的PCR引物，其中5’和3’引物上加入了一個BamHI和SacI的酶切位點，進行PCR。其引物如下：

5’-primer:CGCGGATCCATTGTTCGCTCCACGCA

3’-primer:CGAGCTCCTCCTGCTCACTCTGGAAAC

PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30s，循環(huán)35次，72℃后延伸10min PCR獲取目的片段，

2)利用膠回收試劑盒(TM16090646)回收擴增的基因3’UTR片段，連接在pMD19-T載體上，利用氨芐抗性篩選帶有目的片段的陽性菌。

3)利用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI分別切開帶有牙鲆基因3’UTR的質(zhì)粒和帶有SP6啟動的EGFP-nanos3 3’UTR在體質(zhì)粒，并分別使用膠回收試劑盒(TM1609 0646)回收基因3’UTR和除去nanos3 3’UTR的載體片段；

4)使用T4連接酶將牙鲆基因3’UTR基因片段和載體片段鏈接起來，構(gòu)建成由SP6啟動的并帶有所述基因3'UTRE的熒光報告載體。

實施例3：帶有綠色熒光的基因3′-UTR區(qū)序列特異性識別斑馬魚原始生殖細胞

1、體外合成帶有綠色熒光的基因的3′-UTR mRNA

1)對實例2的第4)步獲得的報告載體進行線性化，使用KpnI對載體進行線性化，應(yīng)用酚氯仿法對線性化的載體進行回收，用10ul DEPC水溶解。

2)體外合成RNA

使用mMESSAGESP6Kit(Ambion)試劑盒體外合成mRNA。2×NTP/CAP 10ul,10×Reaction Buffer 2ul,Linear template DNA 1ug，SP6Enzyme Mix 2ul,加DEPC水補至20ul，混勻瞬離后，37℃反應(yīng)2h。想反應(yīng)體系中加入1ul DnaseI，37℃孵育15min，取1ul跑膠檢測。加入115ul的DEPC水和15ul的NH₄AC，終止反應(yīng)。加入150ul氯仿：苯酚(1:1)渦旋震蕩后12000rpm離心1min，取上清加入新的1.5mL離心管中,并向原管中加入50ulDEPC水，渦旋震蕩后12000rpm離心1min，取上清加入上一步的1.5mL離心管中。加入200ul的氯仿，渦旋震蕩后12000rpm離心1min，取上清加入新的1.5mL離心管中，并加入200ul異丙醇，放入-80℃沉淀至少1h。4℃，12000rpm離心15min，吸棄異丙醇后再加入200ul 75％乙醇。4℃，12000rpm離心5min，吸棄上清，晾干后加入10ulDEPC水溶解RNA。取1ul電泳檢測質(zhì)量及完整度，取1ul測吸光度檢測樣品濃度。剩余RNA樣品分裝8管(每管1ul)-80℃保存。

2、顯微注射驗證基因的3'UTR功能

分別取1ul帶有綠色熒光的基因的3'UTR mRNA和1ul RFP-P.O nanos3 3'UTR mRNA稀釋至400ng/ul，然后兩者1:1混勻，吸取2ul混和好的RNA溶液在一細胞時期共注射到斑馬魚胚胎中，對基因3'UTR功能驗證，nanos3 3'UTR已有報道能標記斑馬魚PGCs細胞，用來作為陽性對照。注射后放在28℃的恒溫箱中孵育，并每隔一段時間對注射的斑馬魚胚胎進行綠色和紅色熒光檢查，基因3'UTR功能驗證。

結(jié)果顯示，在桑葚胚期就可以檢測到綠色熒光見圖4a,其中b和c分別是原腸晚期正面和側(cè)面熒光照片，結(jié)果顯示這一時期已經(jīng)能清清晰的看到PGCs簇。

在體節(jié)期，可清晰的看到基因3'UTR所標記的帶有綠色熒光的PGCs簇和nanos3 3'UTR所標記的帶有綠紅色熒光的PGCs簇完全重合見圖5；其中d、e、f為帶有綠色熒光基因3'UTR標記PGCs結(jié)果，d’、e’、f’為帶有紅色熒光的nanos3 3'UTR標記PGCs結(jié)果。

出膜前以及出膜后的跟蹤結(jié)果分別見圖6和圖7，其中g(shù)、h、i為帶有綠色熒光基因3'UTR標記PGCs結(jié)果，g’、h’、i’為帶有紅色熒光的nanos3 3'UTR標記PGCs結(jié)果。

以上結(jié)果證明帶有綠色熒光的基因3'UTR能和RFP-P.O nanos3 3'UTR實現(xiàn)共定位，其中帶有基因3'UTR的質(zhì)粒表達產(chǎn)物能成功的識別、標記斑馬魚PGCs，實現(xiàn)斑馬魚PGCs活體標記，并且熒光結(jié)果顯示比nanos3 3'UTR特異性更強。