特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞的DNA適配子GCA-5及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,具體是一種特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞的DNA寡核苷酸適配子GCA-5的序列和修飾，以及修飾后的GCA-5在識(shí)別胃癌細(xì)胞方面的應(yīng)用，包括用于臨床胃癌組織標(biāo)本的輔助診斷、胃癌分子靶向診斷、胃癌生物導(dǎo)向治療，基礎(chǔ)研究中胃癌細(xì)胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別和鑒定。

背景技術(shù)：
已證實(shí)，胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康。盡管早期胃癌的治療效果較好，但診斷率低；由于胃癌早期的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已屬進(jìn)展期，手術(shù)及放化療效果都不理想?？梢?jiàn)，胃癌的預(yù)后主要依賴(lài)于分期，其診斷和治療的重點(diǎn)是早期。目前，早期胃癌診治的主要手段（金標(biāo)準(zhǔn)）仍然是內(nèi)鏡活檢和內(nèi)鏡粘膜下切除術(shù)（YadaT,etal.DiagnTherEndosc2013;2013:241320）。然而，這需要特殊的儀器設(shè)備、較高的費(fèi)用和施術(shù)者的經(jīng)驗(yàn)積累，患者的耐受性和依從性也難以保證，因而仍然面臨普及難和不易實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷的問(wèn)題。因此，更可靠、更方便、更廉價(jià)和更容易普及的胃癌診治手段亟待發(fā)現(xiàn)和制備應(yīng)用。近年來(lái)，眾多的高通量生物技術(shù)方法不斷涌現(xiàn)，其中細(xì)胞-SELEX技術(shù)可篩選特異性結(jié)合于細(xì)胞的核酸適配子，這為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的可能。SELEX是指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment）的英文縮寫(xiě)，利用該技術(shù)通過(guò)多次反復(fù)的擴(kuò)增和篩選循環(huán)，可以從隨機(jī)單鏈DNA或RNA庫(kù)中獲取特異性結(jié)合于靶物質(zhì)的核酸序列，稱(chēng)為適體（aptamer）或適配子；適配子具有精確識(shí)別、高特異性、高親和力結(jié)合靶標(biāo)等特性，且容易在體外合成和修飾、理化性質(zhì)穩(wěn)定、費(fèi)用低廉、獲取周期短等優(yōu)勢(shì)。隨著SELEX技術(shù)本身的不斷發(fā)展以及靶標(biāo)范圍的不斷拓展，近年出現(xiàn)了以活細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行的SELEX篩選，即細(xì)胞-SELEX（cell-SELEX或cell-basedSELEX）技術(shù)（徐發(fā)良,等.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2012;33:432-435）。通過(guò)細(xì)胞-SELEX篩選而獲得的適配子，可用于腫瘤細(xì)胞的富集與檢測(cè)、腫瘤診斷、靶向治療和腫瘤標(biāo)志物研究（FangX,etal.AccChemRes2010;43:48-57）。我們利用細(xì)胞-SELEX的篩選原理和實(shí)驗(yàn)方法（SefahK,etal.NatProtoc2010;5:1169-1185），以胃癌細(xì)胞株為陽(yáng)性篩選細(xì)胞、以正常胃粘膜細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞，建立了篩選腫瘤細(xì)胞DNA適配子的方法；該技術(shù)的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)在于，研究者無(wú)須事先明確腫瘤細(xì)胞特定的靶分子，就可以篩選出特異性結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的適配子。借助蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)，可對(duì)適配子結(jié)合的靶標(biāo)進(jìn)行分離、鑒定，進(jìn)而成為潛在的腫瘤標(biāo)志物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提出特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞的DNA適配子GCA-5,以及修飾后的GCA-5在識(shí)別胃癌細(xì)胞方面的應(yīng)用，包括用于臨床胃癌組織標(biāo)本的輔助診斷、胃癌靶向診斷、基礎(chǔ)研究中胃癌細(xì)胞的分離、純化、鑒定和胃癌的生物導(dǎo)向治療。本發(fā)明是結(jié)合了國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展以及發(fā)明人自身的工作積累，以胃癌細(xì)胞株為靶標(biāo)、以正常胃粘膜為消減靶標(biāo)，通過(guò)成功建立細(xì)胞-SELEX技術(shù)篩選到一個(gè)適配子GCA-5（gastriccanceraptamer）。經(jīng)鑒定，GCA-5能特異性識(shí)別并結(jié)合胃癌細(xì)胞株，而不與正常胃粘膜細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞株結(jié)合；尤其重要的是，GCA-5也能特異性識(shí)別并結(jié)合來(lái)自臨床胃癌手術(shù)標(biāo)本的癌細(xì)胞；而對(duì)照核酸序列與上述細(xì)胞均無(wú)結(jié)合。這對(duì)于胃癌的臨床輔助診斷、分子靶向診斷和生物導(dǎo)向治療中所需試劑盒和藥物的制備具有重要意義。由于經(jīng)過(guò)FITC或TAMRA標(biāo)記的GCA-5可以直接用于熒光方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，其操作比傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法更簡(jiǎn)單。另外，GCA-5可能通過(guò)特定的靶標(biāo)分子結(jié)合于胃癌細(xì)胞，從而在胃癌細(xì)胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標(biāo)志物的鑒定方面得到應(yīng)用。因此，本發(fā)明可以在臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，一種特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞的DNA適配子GCA-5的核苷酸序列為:SEQIDNO.1。進(jìn)一步可以再在所述核苷酸序列SEQIDNO.1的5’端標(biāo)記熒光素（如FITC、TAMRA等）或酶類(lèi)物質(zhì)(生物素和地高辛)等，并通過(guò)熒光檢測(cè)設(shè)備、鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)和抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行示蹤、定位和檢測(cè)。上述核苷酸在制備靶向定位胃癌細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。上述核苷酸在制備靶向殺滅胃癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。上述核苷酸在制備胃癌細(xì)胞體外識(shí)別、分離和鑒定的試劑盒中的應(yīng)用。上述核苷酸在制備分離或鑒定胃癌生物標(biāo)記物的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明能夠獲得的有益技術(shù)效果包括：1）與功能類(lèi)似的蛋白類(lèi)抗體相比，單鏈DNA理化性質(zhì)更加穩(wěn)點(diǎn)；適配子體外合成的成本比抗體制備的成本低、周期短；適配子可直接在體外合成、修飾標(biāo)記、批量生產(chǎn)，操作更簡(jiǎn)便、迅速。2）GCA-5能特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞株和胃癌手術(shù)標(biāo)本的細(xì)胞，因此在胃癌的臨床輔助診斷、分子靶向診斷和生物導(dǎo)向治療藥物的制備方面具有重要價(jià)值。3）本發(fā)明證實(shí)GCA-5能特異性識(shí)別并結(jié)合胃癌細(xì)胞株和胃癌手術(shù)標(biāo)本，從而在胃癌細(xì)胞的分離、純化和鑒定，以及胃癌腫瘤標(biāo)志物的鑒定方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。附圖說(shuō)明圖1為適配子GCA-5高親和力結(jié)合胃癌細(xì)胞株和手術(shù)標(biāo)本結(jié)果圖；圖2為激光共聚焦分析FITC-GCA-5特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞結(jié)果圖，圖中A表示正常人胃粘膜GES-1株，B表示人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo，C表示人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，D臨床胃癌標(biāo)本細(xì)胞懸液。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實(shí)施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。1.以胃癌細(xì)胞株為靶標(biāo)、以正常胃粘膜為消減靶標(biāo)，通過(guò)細(xì)胞-SELEX技術(shù)篩選到一個(gè)適配子GCA-5。采用精確比對(duì)法，在NCBI網(wǎng)站提供的Blastn程序比對(duì)人、小鼠的編碼核酸數(shù)據(jù)庫(kù)和其他非編碼數(shù)據(jù)庫(kù)，均未發(fā)現(xiàn)與GCA-5相似的核酸序列。2.人工合成GCA-5及其對(duì)照序列RCA，均在5'端標(biāo)記FITC（用于流式細(xì)胞檢測(cè)）或TAMRA（用于激光共聚焦），由上海生功公司完成：FITC-GCA-5或TAMRA-GCA-5：SEQIDNO.1：5'-ataccagcttattcaattgcacccataacaaggcacacgtggaaggtcttttgtacttcttttcaaatggagatagtaagtgcaatct-3'3.胃癌標(biāo)本單細(xì)胞懸液的制作：1)取胃癌新鮮手術(shù)標(biāo)本，用無(wú)菌PBS沖洗；2)用無(wú)菌剪刀剪成糊狀；3)200目銅網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min離心5min以沉淀細(xì)胞，棄上清后用Hanks液漂洗；4)用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞比例大于90%；5)用含10%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；6)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。4.細(xì)胞樣品制備、FCM檢測(cè)：1)FITC標(biāo)記的GCA-5或RCA與2×105的正常胃粘膜細(xì)胞GES-1、結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo、胃癌細(xì)胞SGC-7901、臨床胃癌標(biāo)本細(xì)胞懸液共孵育于200ul含20%FBS的結(jié)合液；2)冰上放置50min令其結(jié)合；3)以0.7ml結(jié)合液(含0.1%的NaN3)洗滌兩次；4)以0.4ml結(jié)合液(含0.1%的NaN3)重懸；5)上FCM計(jì)數(shù)30000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；6)以FITC標(biāo)記的RCA作為背景熒光，計(jì)算相對(duì)親和力。5.細(xì)胞爬片，孵育、結(jié)合、共聚焦流圖：1)分別培養(yǎng)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1、結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo、胃癌細(xì)胞SGC-7901、臨床胃癌標(biāo)本細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2×105/ml，接種于預(yù)先放置了蓋玻片的6孔板，爬片過(guò)夜；甲醛-20℃固定2小時(shí)，PBS沖洗。2)取50pmol的TAMRA標(biāo)記的GCA-5，與靶細(xì)胞結(jié)合于100ul含20%FBS的結(jié)合液；3)冰上放置50min令其結(jié)合；4)以0.7ml結(jié)合液(含0.1%的NaN3)洗滌兩次；5)以0.4ml結(jié)合液(含0.1%的NaN3)重懸；6)激光共聚焦顯微觀(guān)察與靶細(xì)胞結(jié)合的情況（在細(xì)胞的定位、數(shù)量）、留圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：GCA-5特異性結(jié)合于胃癌細(xì)胞株SGC-7901和臨床胃癌細(xì)胞的表面，但不與正常胃粘膜細(xì)胞GES-1或結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo結(jié)合，從而對(duì)胃癌細(xì)胞具有選擇性識(shí)別作用。由表1和圖1可以得到結(jié)論：GCA-5與胃癌細(xì)胞株SGC-7901或臨床胃癌標(biāo)本的細(xì)胞高親和力結(jié)合，但與正常胃粘膜細(xì)胞GES-1或結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo的親和力較低。對(duì)照序列RCA和四種細(xì)胞結(jié)合的親和力均較低。由圖2可以得到結(jié)論：GCA-5特異性結(jié)合于胃癌細(xì)胞株SGC-7901或臨床胃癌標(biāo)本的細(xì)胞表面；但與正常胃粘膜細(xì)胞GES-1或結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo幾乎無(wú)結(jié)合，由圖中A、B、C和D所示。序列的功能和應(yīng)用：該序列的基本功能：能高親和力、特異性結(jié)合于胃癌細(xì)胞的表面。推定的應(yīng)用領(lǐng)域主要包括：示蹤、研究、靶向診斷；靶向治療；其他識(shí)別和靶向應(yīng)用領(lǐng)域。在示蹤技術(shù)方面，用放射性物質(zhì)、熒光素或酶類(lèi)等示蹤劑標(biāo)記該DNA核苷酸，利用其特異性識(shí)別功能，通過(guò)相應(yīng)的檢測(cè)手段即可進(jìn)行定位甚至定性顯示胃癌細(xì)胞的存在，從而應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究、腫瘤靶向診斷、定位診斷或大量篩查。在制備靶向治療藥物方面，將放射性治療藥物、細(xì)胞毒性藥物等殺腫瘤的藥物與該DNA核苷酸偶聯(lián)，利用其特異性識(shí)別功能，就可以達(dá)到靶向殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。在其他涉及到腫瘤特異性識(shí)別和靶向作用的應(yīng)用領(lǐng)域，也可采用該DNA寡核苷酸代替相應(yīng)的抗體，達(dá)到更好的特異性識(shí)別和靶向作用的效果。表1平均熒光強(qiáng)度（FITC-GCA-5高親和力結(jié)合胃癌細(xì)胞）；*P<0.05SEQUENCELISTING<110>重慶市腫瘤研究所<120>特異性識(shí)別胃癌細(xì)胞的DNA適配子GCA-5及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>88<212>DNA<213>人工序列<400>SEQIDNO.1ataccagcttattcaattgcacccataacaaggcacacgtggaaggtcttttgtacttct60tttcaaatggagatagtaagtgcaatct88