人宮頸癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，以改良的肽庫(kù)消減篩選法篩選對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(SiHa 細(xì)胞)特異性結(jié)合的多肽(序列），對(duì)人宮頸癌細(xì)胞具有良好的結(jié)合特異性和敏感性。 技術(shù)背景
[0002] 宮頸癌(Cervical cancer)是常見的婦科腫瘤之一，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家僅次于 乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌，在發(fā)展中國(guó)家則居首位。目前，宮頸癌的治療主要以手術(shù)切除為主，但 因早期宮頸癌無明顯癥狀和體征，易造成漏診或誤診，待發(fā)現(xiàn)時(shí)已到中晚期，喪失最佳手術(shù) 時(shí)機(jī)。放療、化療毒性極大，易產(chǎn)生劑量依賴性和藥物抗藥性等，效果不理想，病人的五年生 存率仍然很低。因此，尋找一種敏感性高且特異性強(qiáng)的早期篩查診斷方法，從而降低宮頸癌 的死亡率也是目前面臨的關(guān)鍵問題之一。
[0003] 近年來，迅速發(fā)展的分子影像學(xué)與靶向治療為宮頸癌的治療帶來了新的希望，其 中，篩選出宮頸癌細(xì)胞表面特異性強(qiáng)、敏感度高的靶向分子成為當(dāng)務(wù)之急。
[0004] 噬菌體肽庫(kù)技術(shù)為宮頸癌細(xì)胞靶向分子篩選、宮頸癌的早期診斷和靶向治療提供 了新的途徑，其中的關(guān)鍵元件是對(duì)癌細(xì)胞、癌組織具有特異靶向結(jié)合活性的多肽片段的獲 得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供以改良的肽庫(kù)消減篩選由噬菌體12肽庫(kù)篩選得到對(duì)宮頸 癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽序列，并提供鑒定該多肽與宮頸癌細(xì)胞特異性親和力的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，證明該多肽在宮頸癌的早期分子影像學(xué)診斷、靶向化療、與其它材料偶聯(lián)而進(jìn)行的宮頸 癌靶向治療等方面具有巨大應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：
[0007] 宮頸癌SiHa細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列為:QQLKDPWHSTPY。該多肽能夠 特異性結(jié)合SiHa細(xì)胞，而不識(shí)別人胚腎HEK293細(xì)胞（即正常細(xì)胞），并對(duì)其他腫瘤細(xì)胞表現(xiàn) 出極低的親和力或者無親和力。
[0008] 上述宮頸癌SiHa細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的篩選方法為以體外培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞系 為靶細(xì)胞，以人胚腎J1EK293細(xì)胞系為非特異性吸附細(xì)胞，對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行4輪消減 篩選，隨機(jī)挑取60個(gè)噬菌體克隆，利用ELI SA鑒定出陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，分 析其多肽的氨基酸序列組成及基本特征，最后獲得擁有共有序列(Consensus sequence)的 陽性克隆組6個(gè)，對(duì)它們以細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)一步鑒定其特異性和敏感性，確定最佳序列。
[0009] 各種噬菌體克隆水平、最佳序列合成肽探針?biāo)降膶?shí)驗(yàn)結(jié)果均提示序列 QQLKDPWHSTPY特異性、敏感性最佳，這為該多肽未來用于宮頸癌的早期分子影像學(xué)診斷、靶 向化療等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于多肽分子量小、免疫原性低、親和力高、組織穿透性強(qiáng)、易合 成等特點(diǎn)也有望使其與適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記物、納米顆粒、脂質(zhì)體或抗腫瘤藥物等偶聯(lián)，從而應(yīng) 用于腫瘤的早期影像診斷、靶向治療、病程監(jiān)測(cè)及腫瘤治療療效評(píng)價(jià)等，對(duì)于解決目前癌癥 防治所面臨問題具有重要的意義。
[0010] 本發(fā)明以宮頸癌SiHa細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體12肽庫(kù)以我們改良的消減篩選法進(jìn) 行了4輪消減篩選，最后獲得6條共同多肽序列，分別為KNLTNEPQVPLV、ETLPQNESKIPW、 QQLKDPWHSTPY、VTALRKVDHTPL、SLSEWQDVRTTS、TITSKLVKWSRK。通過一系列鑒定分析實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)其中的QQLKDPWHSTPY對(duì)于宮頸癌的靶向性最強(qiáng)，提示了其用于宮頸癌診斷、靶向治療方 面的價(jià)值。
[0011] 在宮頸癌檢測(cè)方面，利用同位素或者熒光標(biāo)記的多肽可以特異性結(jié)合宮頸癌細(xì) 胞/組織，適用于腫瘤成像和分子影像診斷，對(duì)于宮頸癌早期檢測(cè)、癌病灶定位和療效評(píng)價(jià) 都具有重要意義;在宮頸癌靶向治療方面，有望利用其特異性高、分子量小、穿透力強(qiáng)、親和 力高的特性來與化療藥物偶聯(lián)，達(dá)到靶向遞送給藥的目的，可大大減小化療藥物的非特異 性和毒副作用。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明多肽的制備路線圖；
[0013] 圖2為隨機(jī)十二肽pill融合蛋白的N末端序列；
[0014] 圖3為專用密碼子表；
[0015]圖4為首次ELISA所選36個(gè)陽性噬菌體克隆與SiHa細(xì)胞親和力的再鑒定結(jié)果；
[0016]圖5為6條共有序列的代表性陽性噬菌體克隆與細(xì)胞親和力的免疫熒光鑒定，其中 A:S6+SiHa；B:S6+Hek293；C：S7+SiHa；D：S7+Hek293；E：S21+SiHa；F：S21+Hek293；G：S22+ SiHa；H：S22+Hek293；I：S31+SiHa；J：S31+Hek293；K：S46+SiHa；L：S46+Hek293；M：URPs+ SiHa; N: PBS+SiHa; DAPI 染細(xì)胞核；
[0017] 圖6為克隆S7(QQLKDPWHSTPY)與靶細(xì)胞親和力鑒定，其中A:SiHa+S7;B:Hek293+ S7; C: SiHa+URP; D: Hek293+URP; E: SiHa+PBS; F: Hek293+PBS; DAPI 染細(xì)胞核；
[0018]圖7為細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定陽性噬菌體克隆S7與靶細(xì)胞的結(jié)合特異性，其中A:SiHa+ S7；B：SiHa+URP；C：SiHa+PBS；D：Hek293+S7；E：Hek293+URP；F：Hek293+PBS；
[0019]圖8為陽性噬菌體克隆S7與多種腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特異性，其中A:S7+SiHa;B:S7+ SMMC-7721(肝癌細(xì)胞）；C:S7+MCF-7(乳腺癌細(xì)胞）；D:S7+Cac〇-2(結(jié)直腸癌細(xì)胞）；E:S7+ Hek293; F: PBS+SiHa; G: URPs+SiHa; DAPI染細(xì)胞核；
[0020] 圖9為合成多肽(QQLKDPWHSTPY)與靶細(xì)胞特異性結(jié)合劑量、時(shí)間效應(yīng)，其中左側(cè)為 劑量效應(yīng)檢測(cè)，右側(cè)為時(shí)間效應(yīng)檢測(cè)；
[0021] 圖10為合成多肽(QQLKDPWHSTPY)與靶細(xì)胞的結(jié)合特異性鑒定，其中A:SiHa+陽性 多肽;B:SiHa+陰性多肽;C:Hek293+陽性多肽;D:Hek293+陰性多肽;DAPI染細(xì)胞核；
[0022]圖11為合成多肽(QQLKDPWHSTPY)在靶細(xì)胞定位分析，其中A:SiHa+陽性多肽;B: S iHa+陰性多肽;C: Hek293+陽性多肽;D: Hek293+陰性多肽;DAP I染細(xì)胞核；
[0023]圖12為細(xì)胞免疫熒光鑒定合成多肽(QQLKDPWHSTPY)與多種腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特異 性，其中A:SiHa;B:SMMC-7721(肝癌細(xì)胞）；C:MCF-7(乳腺癌細(xì)胞）；D:Eca-109(食道癌細(xì) 胞）；E:Cac 〇2(結(jié)直腸癌細(xì)胞）；F:SGC-7901(胃癌細(xì)胞）；DAPI染細(xì)胞核。
[0024]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 菌體展示技術(shù)是1985年由美國(guó)Missouri大學(xué)的G.P. Smith等創(chuàng)立的一項(xiàng)能夠特 異性篩選多肽或蛋白的技術(shù)。該技術(shù)將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌 體表面，與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，被展示的多肽或蛋白能夠保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié) 構(gòu)和生物活性。目前，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、腫瘤藥物的靶 向運(yùn)輸和多肽藥物開發(fā)等方面的研究。
[0026] 本發(fā)明就是利用上述肽庫(kù)以改良的肽庫(kù)消減篩選法篩選可以特異敏感的結(jié)合于 人宮頸癌細(xì)胞的一條多肽序列，并以相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了該序列對(duì)人宮頸癌細(xì)胞結(jié)合的高度特 異性和敏感性。該多肽具有親和力高、分子量小、組織穿透性強(qiáng)、免疫原性低、易合成等特 點(diǎn)，將其連接其它效應(yīng)分子，可以用于宮頸癌的早期分子影像學(xué)診斷，形成腫瘤三維成像， 大大提高宮頸癌的早期診斷率，并可對(duì)治療療效評(píng)價(jià);作為宮頸癌化療藥物的導(dǎo)向元件而 用于宮頸癌的靶向化療，可大大降低藥物毒性而提高療效，使化療成為對(duì)病人確實(shí)有益的 治療方法之一;將多肽與納米脂質(zhì)體或納米藥物偶聯(lián)，可達(dá)到更好的靶向治療效果；用于尋 找腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)配體的研究，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)。
[0027] 本發(fā)明以人宮頸癌SiHa細(xì)胞為靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體肽庫(kù)以改良的肽庫(kù)消減篩選法進(jìn) 行4輪消減篩選，尋找與宮頸癌細(xì)胞SiHa具有特異性結(jié)合力的噬菌體肽序，為進(jìn)一步研發(fā)宮 頸癌早期靶向診斷試劑和高效低毒靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)，具體技術(shù)路線如圖1所示。 [0028] 一、材料與方法
[0029] 1.1主要實(shí)驗(yàn)材料
[0030] 1.1.1細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞株SiHa，購(gòu)于美國(guó)ATCC(Rockville，USA)，人胚腎細(xì)胞 株HEK293，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0031] 1.1.2噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)貯存:與甘油1:1保存在TBS溶液中，1.5 X 1013pfu/ml。 復(fù)雜度:~2.7X109個(gè)轉(zhuǎn)化子。載體M13KE的外殼基因-96gIII測(cè)序引物:5'-HQCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,。
[0032] 1.1.3宿主菌￡.(：〇11￡1?2738，與甘油1:1保存在-80°(：超低溫冰箱中。
[0033] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0034] 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0035] 用DMEM完全培養(yǎng)基、37 °C、飽和濕度、5 % C02孵箱。
[0036] 1.2.2宿主菌￡.(：〇11￡1?2738的準(zhǔn)備
[0037] E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌體肽庫(kù)的專用菌株。用LB-Tet培養(yǎng)基、 37 °C恒溫?fù)u床、300rpm振蕩過夜。
[0038] 1.2.3噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)體外快速消減篩選
[0039]以人胚腎細(xì)胞HEK293作為陰性吸附細(xì)胞預(yù)吸附以排除非正常細(xì)胞靶向克隆，再以 人宮頸癌細(xì)胞SiHa和作為祀細(xì)胞，對(duì)革E1向?qū)m頸癌克隆以改良的消減篩選法（Subtraction Biopanning)進(jìn)行淘篩，重復(fù)4輪。相對(duì)于噬菌體肽庫(kù)試劑盒生產(chǎn)商一一美國(guó)新英格蘭生物 實(shí)驗(yàn)室公司（New England BioLabs Inc.，NEB)提供的傳統(tǒng)經(jīng)典Biopanning方法(見試劑盒 說明書），在此基礎(chǔ)上，改良的消減篩選法每一輪Biopanning的特色如下：（1)每輪第一步增 加了以正常細(xì)胞對(duì)投入噬菌體肽庫(kù)的預(yù)吸附，以盡可能除去非癌細(xì)胞靶向的噬菌體克?。?(2)將傳統(tǒng)步驟要求的"擴(kuò)增"步驟的25ml菌液體積改為3ml。這一改變大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)難度 和提高了篩選效率；（3)由于第(2)項(xiàng)改變，最后一輪(一般做4輪Biopanning)可以隨機(jī)挑選 至少60個(gè)或更多的噬菌體克隆。
[0040]所選噬菌體克隆擴(kuò)增后以ELISA法鑒定與靶細(xì)胞SiHa的親和力。
[0041 ] 1.2.4陽性噬菌體克隆多肽序列的測(cè)定
[0042]對(duì)噬菌體陽性克隆、無關(guān)克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)遺傳密碼子表格(參見圖2、圖3)，將 多肽序列翻譯成氨基酸序列并獲得Consensus序列。
[0043] 1 ? 2 ? 5Consensus序列的結(jié)合特異性鑒定
[0044] 以Consensus序列的代表性克隆通過常規(guī)細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行結(jié)合特異性和敏感 性的鑒定。
[0045] 1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0046]利用SPSS 16.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用x土SD表示，P〈0.01表示 差異極顯著，P〈〇.05表示差異顯著，P>0.05說明差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間多重比較 采用Duncan檢驗(yàn)處理。
[0047] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0048] 2.1陽性克隆的ELISA鑒定和測(cè)序
[0049] 獲得陽性噬菌體克隆36個(gè)，其中克隆S7與SiHa細(xì)胞結(jié)合特異性最高，結(jié)果如圖4所 示。陽性噬菌體克隆有6個(gè)共有序列:KNLTNEPQVPLV(代表性克隆S22);ETLPQNESKIPW(代表 性克隆S6) ;QQLKDPWHSTPY(代表性克隆S7) ;VTALRKVDHTPL(代表性克隆S21) ;SLSEWQDVRTTS (代表性克隆S31) ;TITSKLVKWSRK(代表性克隆S46);無關(guān)克?。幮钥寺。┬蛄袨?SSLNHLTSLTNW。
[0050] 2.2陽性噬菌體克隆的結(jié)合特異性
[0051 ] 結(jié)果如圖5-圖8所示，陽性噬菌體克隆均結(jié)合SiHa細(xì)胞而不與HEK293細(xì)胞結(jié)合，以 克隆S7 (QQLKDPWHSTPY)最佳，說明該陽性多肽有很好的靶向性。
[0052] 2.3合成FITC標(biāo)記多肽QQLKDPWHSTPY的特異性和敏感性鑒定
[0053] 結(jié)果如圖9-圖12所示。多肽QQLKDPWHSTPY特異結(jié)合于SiHa細(xì)胞表面而不與HEK293 結(jié)合，或與其他種類癌細(xì)胞呈現(xiàn)極低結(jié)合力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人宮頸癌細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列為： QQLKDPWHSTPY。2. 權(quán)利要求1所述多肽特異結(jié)合人宮頸癌細(xì)胞的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述多肽用于制備治療人宮頸癌藥物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人宮頸癌細(xì)胞SiHa特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用，所涉及多肽的氨基酸序列為：QQLKDPWHSTPY。所涉及的應(yīng)用為本發(fā)明的人宮頸癌細(xì)胞SiHa特異性結(jié)合的多肽特異結(jié)合人宮頸癌的應(yīng)用。本發(fā)明篩選和初步鑒定獲得的宮頸癌靶向多肽具有明顯的宮頸癌細(xì)胞結(jié)合特異性，可用于研發(fā)宮頸癌早期靶向診斷試劑、高效低毒靶向治療藥物。
【IPC分類】A61K47/42, C07K7/08, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105713071
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610085382
【發(fā)明人】侯穎春, 何慧敏, 肖麗, 高曉杰, 薛琴琴, 達(dá)苗苗, 馬樂樂, 馬妮, 程思楠
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)