?？刹《?型vp1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明是通過計算機(jī)分析?？刹《?型表面蛋白VP1氨基酸序列，篩選出含強(qiáng)特異性抗原表位的蛋白片段，即第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，這兩個蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，形成一個抗原表位融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成該抗原表位融合蛋白的全新基因序列，利用基因工程技術(shù)，表達(dá)制備?？刹《?型VP1蛋白抗原表位融合蛋白，用于?？刹《究贵w檢測試劑的研制，及用于?？刹《締慰购投嗫怪苽?。
【專利說明】
?？刹《?型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明?？刹《?型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用涉及的是 篩選出含強(qiáng)抗原表位的?？刹《?型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技術(shù)，制備埃可病 毒1型的VP1蛋白抗原表位的融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全 新的VP1蛋白抗原表位融合蛋白的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)融合蛋白，表達(dá)的融合 蛋白可用于?？刹《疽呙缂翱贵w檢測試劑的研制等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診 斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒（Enteric Cytopathogenichuman Orphan Virus， ECHO)，簡稱埃可病毒，是一類單股正鏈RNA的腸道病毒，有34個血清型。最初對其致病性并 不清楚，后來證明?？刹《九c無菌腦膜炎、嬰兒腹瀉、手足口病等多種疾病有關(guān)。大量研究 和數(shù)據(jù)分析最終顯示，本病遍布世界各地，在人群中引起廣泛傳播或流行，其感染可引起無 菌性腦膜炎、發(fā)疹、胃腸道疾病、肝炎和肺炎等多種人類疾病，其中無菌性腦膜炎最為常見， 可通過呼吸道和消化道傳播。孕婦感染后可通過胎盤傳播給胎兒，可引起胎兒畸形甚至死 胎。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，埃可病毒1型可導(dǎo)致無菌性腦膜炎、麻痹、腦炎、心包炎、心肌炎、皮疹和 輕度呼吸道和腸道疾病，也曾在河南病患兒童中引起手足口病，應(yīng)該受到廣泛的關(guān)注。
[0003] ?？刹《綱P1與決定血清型的抗原決定因子密切相關(guān)，由于VP1區(qū)序列分型結(jié)果與 中和試驗鑒定結(jié)果具有一致性，而VP1蛋白是病毒中和的主要決定因子，其保守性有利于疫 苗開發(fā)，也使其作為檢測試劑提供可行性和可能性。目前對其全基因序列已經(jīng)測定，為利用 基因工程技術(shù)研究診斷試劑、疫苗及篩選抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。
[0004] 目前，對?？刹《镜臋z測方法主要包括平板分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、分子 生物學(xué)方法。但是，這些方法所需成本較高、需要特定設(shè)備、耗時且需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的 處理，限制其在生活中的廣泛應(yīng)用。建立一種簡單、快速、適合現(xiàn)場應(yīng)用的?？刹《镜臋z測 方法有重要意義。而研制特異的基因重組抗原是建立?？刹《咎禺惪贵w檢測試劑的發(fā)展方 向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是針對上述不足之處提供一種?？刹《?型VP1蛋白特異性抗原表位 及其融合蛋白的制備、應(yīng)用，本發(fā)明是篩選出含強(qiáng)抗原表位的?？刹《?型的表面VP1蛋白 片段，利用基因工程技術(shù)，制備?？刹《?型的表面VP1蛋白片段的融合蛋白。通過計算機(jī)分 析，從?？刹《?型表面蛋白VP1中篩選出2個含強(qiáng)抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基 酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼 子，兩段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，構(gòu)成總長度為103個氨基酸的序 列，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌BL2UDE3)中表達(dá)該基因。表 達(dá)的蛋白可用于疫苗研制，亦可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為?？刹《緳z測方 法的建立奠定了基礎(chǔ)。
[0006] ?？刹《就鈱拥腣P1蛋白，是介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞結(jié)合的主要蛋白，同時其又具有 較高的保守性，在各型的埃可病毒中變異很小，所以是用作抗原研制?？刹《究贵w檢測試 劑的理想蛋白。通過計算機(jī)分析?？刹《?型VP1蛋白的氨基酸序列，我們篩選出抗原表位 的富集區(qū)，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子優(yōu)化基因序列，化學(xué)合成全新的基因序列， 利用基因工程技術(shù)表達(dá)融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白具有較好的抗原性和特異性，可用于單 克隆抗體和多克隆抗體的制備，組裝膠體金試劑條，為埃可病毒快速檢測方法的建立奠定 基礎(chǔ)。
[0007] 埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用是采取以下步驟 實施的： 一種?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含強(qiáng)特異性抗原表位的VP1蛋白 片段組成，2段蛋白片段之間由甘氨酸和絲氨酸連接，整合為全長103個氨基酸的融合蛋白， 氨基酸序列如下：
[0008] 所述的?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中2段含強(qiáng)特異性抗原表位 的VP1蛋白片段具體為第75位氨基酸至第140位氨基酸、第203位氨基酸至第236位氨基酸， 各段氨基酸序列如下： Seqencel:第75位aa -第 140位aa:
[0009] 所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白中，2段含強(qiáng)特異性抗原表位的表面VP1蛋白 片段，這2段VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白。
[0010]所述的?？刹《?型表面蛋白vpi的融合蛋白，通過基因重組技術(shù)，利用細(xì)菌、酵母 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。
[0011] 所述的?？刹《?型2個VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白用于?？刹《?抗體檢測試劑的制備及用于免疫制備抗埃可病毒單抗和多抗制備。
[0012] ?？刹《?型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備方法如下： 1.?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機(jī)分析?？刹《?型VP1蛋白的全氨基酸序 列，篩選出2個含強(qiáng)抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位 氨基酸至第236位氨基酸含有較強(qiáng)的抗原表位。2段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲 氨酸連接，構(gòu)成總長度為103個氨基酸的融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子， 化學(xué)合成該融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加的酶切位點(diǎn) (下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子TAA和處 〇 I酶切位點(diǎn)（下畫線部分），使合成的基 因片段易于克隆至質(zhì)粒PGEX-4T-2內(nèi)的你通1和處〇頂每切位點(diǎn)內(nèi)。
[0013] 篩選的?？刹《?型VP1蛋白內(nèi)2個含強(qiáng)抗原表位的蛋白片段： Seqencel:第75位aa -第 140位aa:
2個含強(qiáng)抗原表位蛋白片段連接在一起形成融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列：
化學(xué)合成的?？刹《?型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列(324bp) 2.表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建：
提取質(zhì)粒PGEX-4T-2,用I雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于 去離子水內(nèi)；同時用你通1和處〇 I雙酶切化學(xué)合成?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白的基 因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
[0014]取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使 化學(xué)合成?？刹《?型VP1蛋白基因片段插入到載體PGEX-4T-2內(nèi)的I位點(diǎn)之 間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白。
[0015] 3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含100μg/ml氨芐霉素的LB平板，置37°C過 夜，次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和含PGEX-4T-2質(zhì)粒的對照菌，接種至含4mlLB培養(yǎng)基(含氨芐霉 素 100μg/ml)的試管內(nèi)振搖，分別提取質(zhì)粒，用feMn肩7處〇 I雙酶切驗證，1.0%的瓊脂糖凝 膠電泳結(jié)果表明，切下324bp的目的基因片段。同時，將含有外源基因的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序分 析，測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒含有埃可病毒1型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正確：
構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（103個氨基酸），在 其N端融合了載體上的226個氨基酸，全長329個氨基酸，其氨基酸序列如下：

4. 表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，接種至含4ml LB培養(yǎng)基(含氨芐毒素 lOOμg/ml)的試管 內(nèi)，37°C振蕩培養(yǎng)4h，加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4h，離心收集菌體進(jìn) 行SDS-PAGE檢測，重組子表達(dá)相對分子量為35 kD的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白，而 對照菌PGEX-4T-2無此蛋白條帶。
[0016] 5. 表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白的純化： 1)表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白工程菌的超聲裂解 將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的工程菌離心(8000 rpm、20 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養(yǎng) 液 1/10體積的細(xì)菌裂解液（20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內(nèi)，冰浴超聲破菌75次，8000rpm，4°C，離心20min收集上清。收集的上清用于下一步的親 和層析純化。
[0017] 2)表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白的純化 上清溶液加已經(jīng)平衡的High-Affinity GST Resin 10ml，4°C結(jié)合過夜，上樣，收集穿 透液。用十倍柱床體積的1 X (含ImM PMSF)洗滌柱子，接著用50ml高濃度的GSH洗脫液， 洗脫液為50 mmol/L Tris-HCl pH8.5 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脫目的蛋白，即為純化 的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白。
[0018] 6. 純化的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白用于埃可病毒疫苗研制； 7.將表達(dá)的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白，用于免疫新西蘭大白兔，制備多克隆 抗體。
[0019] 8. 將制備的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白和多克隆抗體組裝膠體金試劑條，把埃 可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白作為抗原，研制抗體檢測試劑。
[0020] 9. 將?？刹《?型表面蛋白VP1篩選優(yōu)化的抗原表位連接，以融合蛋白的形式進(jìn)行表 達(dá)、制備。
[0021] 10. 通過基因重組技術(shù)，利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動植物 進(jìn)行重組表達(dá)、制備?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白。
[0022] 上述所述的方法制備的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，用于?？刹《?抗體的檢測及單抗和多抗的制備，并用于膠體金試劑條的組裝。
[0023] 英文縮寫說明:EDTA:四甲基乙二胺；IPTG:異丙基硫代半乳糖苷；DTT:二硫蘇糖醇； SDS:十二烷基磺酸納;PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳；PB:磷酸鹽緩沖液；DNA:脫氧核糖核 酸；RNA:核糖核酸；kD:千道爾頓;PMSF:苯甲基磺酰氟;GSH:谷胱甘肽。
[0024] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn) 我們表達(dá)的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白，有較多優(yōu)點(diǎn)： 1.現(xiàn)在應(yīng)用的?？刹《究贵w檢測試劑，多采用進(jìn)口抗原或病毒培養(yǎng)抗原，生產(chǎn)不便、且 成本高。表達(dá)的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白用作抗原可克服上述缺點(diǎn)。
[0025] 2.根據(jù)篩選出的?？刹《?型VP1抗原表位氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏 愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，該基因適宜在真核及原核細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。
[0026] 3.構(gòu)建表達(dá)?？刹《?型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的工程菌，表達(dá)量高，且 表達(dá)的蛋白以可溶性形式存在，易于純化，且不需要復(fù)性處理。
[0027] 4.傳統(tǒng)的滅活疫苗的研究取得了一定進(jìn)展，但是生產(chǎn)成本高、危險大，使臨床應(yīng)用 受限。?？刹《?型表面蛋白VP1是病毒中和的主要決定因子，是病毒與宿主結(jié)合的主要蛋 白，并且具有良好的保守性，所以VP1蛋白是研制疫苗的首選蛋白。本發(fā)明就篩選出的VP1蛋 白中抗原表位富集區(qū)進(jìn)行重組，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)制備，得到的全新融合蛋白為 研制基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)?；蚬こ桃呙缇哂邪踩⒊杀镜偷膬?yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0028] 以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明： 圖1是分子生物學(xué)軟件對?？刹《?型表面蛋白VP1的抗原表位進(jìn)行分析結(jié)果。結(jié)果顯 示，在埃可病毒1型VP1蛋白N端從第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236 位氨基酸，含有強(qiáng)的親水性抗原表位，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置。
[0029]圖2是表達(dá)?？刹《?型VP1蛋白2個片段的融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。 [0030] 圖3是用1.0%的Agarose凝膠檢測重組質(zhì)粒的雙酶切圖。M: DNA marker DL10000 (TaKaRa) ; 1:重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-VPl經(jīng)I雙酶切下324bp的目的基因片段，即 圖中箭頭標(biāo)示的位置;2:質(zhì)粒pGEX-4T-2經(jīng)及拙瓜1?酶切沒有目的條帶出現(xiàn)。
[0031]圖4是表達(dá)?？刹《?型表面蛋白VP 1重組菌的SDS-PAGE分析結(jié)果。將構(gòu)建的重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑單菌落后篩選高產(chǎn)菌株的SDS-PAGE電泳圖。Μ:蛋白marker (賽默 飛）;E1①-⑥:?？刹《?型表面蛋白VP1重組菌，六個重組子均表達(dá)相對分子量35kDa的融 合蛋白，即圖中箭頭標(biāo)示的位置;陰參:對照菌含PGEX-4T-2質(zhì)粒。
[0032]圖5是表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白純化后的SDS-PAGE分析結(jié)果。M:蛋 白marker; 1:BSA，濃度為lmg/ml ;2:High-Affinity GST Resin親和層析柱純化后的?？?病毒1型表面蛋白VP1，0D28Q=0.3，濃度為0.4mg/ml，相對分子量35kDa處的蛋白條帶。
[0033]圖6是ELISA檢測兔抗血清結(jié)果。表達(dá)的埃可病毒1型表面蛋白VP1免疫的新西蘭大 白兔 制備抗血清，血清效價達(dá)1:10240000。
【具體實施方式】
[0034]本發(fā)明實施方式的詳細(xì)說明： ?？刹《?型表面蛋白VP1抗原表位的分析、基因合成及表達(dá) 通過計算機(jī)分析?？刹《?型的表面蛋白VP1的氨基酸序列，篩選出含強(qiáng)抗原表位的埃 可病毒1型的VP1蛋白片段，發(fā)現(xiàn)2個含有較強(qiáng)抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基酸至 第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，2個蛋白片段之間通過2個甘氨酸和1個 絲氨酸連接，構(gòu)成總長度為103個氨基酸的抗原表位融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛 的密碼子，化學(xué)合成上述表位融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了 的酶切位點(diǎn)，在3 '端增加了終止密碼子I酶切位點(diǎn)，使合成的基因片段易于 克隆至質(zhì)粒PGEX-4T-2內(nèi)的和處〇頂每切位點(diǎn)內(nèi)，與載體上的起始密碼子的翻譯框架 一致，表達(dá)埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩 選獲得了高效表達(dá)?？刹《?型的VP1抗原表位融合蛋白的工程菌，表達(dá)的?？刹《?型的 VP1抗原表位融合蛋白占菌體蛋白總量的20%，并且為可溶性蛋白。
[0035]材料與方法 1.菌種與質(zhì)粒：宿主菌BL21(DE3)及表達(dá)載體PGEX-4T-2為南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)藥生物所保存。
[0036] 2.分子生物學(xué)試劑：限制性內(nèi)切酶I、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司 產(chǎn)品。質(zhì)粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內(nèi)回收DNA片段的試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。DTT及 IPTG為BI0SHARP公司產(chǎn)品。其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。
[0037] 3.基因片段的合成：由南京金斯瑞生物科技有限公司幫助合成。
[0038] 4.基因克隆方法：DNA的酶切、連接、電泳；質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)化；蛋白的SDS-PAGE 分析等一般分子克隆方法按常規(guī)方法進(jìn)行。其它試劑盒按說明書進(jìn)行操作。
[0039] 5. DNA序列分析:用TaKaRa公司質(zhì)粒純化試劑盒純化質(zhì)粒，用DNA全自動測序儀測 序。
[0040] 結(jié)果 1.埃可病毒1型的表面蛋白VP1抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機(jī)分析?？刹《?型VP1蛋白的全氨基酸序列 (GeneBank，接通號:AFV34557.1)，發(fā)現(xiàn)VP1蛋白的第75位氨基酸至第140位氨基酸和第203 位氨基酸至第236位氨基酸含有較強(qiáng)的抗原表位（如圖1)。
[0041] 篩選出的氨基酸序列如下： Seqencel:第75位aa -第 140位aa:
根據(jù)篩選出的?？刹《?型的表面蛋白VP1內(nèi)的抗原表位氨基酸序列，2個蛋白片段之 間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，整合為一個全長為103個氨基酸的表位融合蛋白，氨 基酸序列如下：
根據(jù)篩選和設(shè)計連接的氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成 上述表位融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了I的酶切位點(diǎn) (下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子TAA和處 〇 I酶切位點(diǎn)（下畫線部分），使合成的基 因片段易于克隆至質(zhì)粒PGEX-4T-2內(nèi)的你通1和處〇頂每切位點(diǎn)內(nèi)。
[0042]化學(xué)合成的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位融合蛋白的DNA序列(324 bp):
2. 表達(dá)?？刹《?型VP1表位融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 提取質(zhì)粒PGEX-4T-2，用I雙酶切，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切的 質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)；同時用你虛1和處〇 I雙酶切化學(xué)合成?？刹《?型VP1表位 融合蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
[0043]取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶16°C，過 夜連接，使化學(xué)合成?？刹《?型VP1表位融合蛋白基因片段插入到載體PGEX-4T-2內(nèi)的 Banill 和 處〇 I位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個?？刹《?型VP1抗原 表位融合蛋白。構(gòu)建流程見圖2。
[0044] 3. 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將上步連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐霉素（100μ g/ml)的固體LB培養(yǎng)基上，置37 °C培養(yǎng)過夜。次日隨機(jī)挑選6個轉(zhuǎn)化子菌落(分別標(biāo)記為1 一 6 號），同時，挑一個空質(zhì)粒PGEX-4T-2轉(zhuǎn)化的對照菌，標(biāo)記為陰參，分別接種到含4 ml液體LB 培養(yǎng)基(含氨芐霉素 lOOwg/ml)的試管內(nèi)，置37°C振蕩培養(yǎng)5h，提取重組質(zhì)粒。用你通1和處〇 I雙酶切，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。重組質(zhì)粒切出324bp的目的基因片段，見圖3， 而含質(zhì)粒PGEX-4T-2的對照菌沒有切出該基因片段。初步證實，轉(zhuǎn)化子含有?？刹《?型VP1 表位融合蛋白的基因片段。
[0045]提取重組子的質(zhì)粒，DNA序列分析證實，重組質(zhì)粒含有?？刹《?型VP1表位融合蛋 白的基因片段，序列完全正確：
構(gòu)建的重組質(zhì)粒可表達(dá)病毒1型VP1表位融合蛋白，長103個氨基酸，在其N端融合了載 體上的226個氨基酸，全長329個氨基酸，其氨基酸序列如下：
4.表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定：
將含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子和一個空質(zhì)粒PGEX-4T-2轉(zhuǎn)化的對照菌，接種至含4ml LB培養(yǎng)基的試管中，試管內(nèi)培養(yǎng)基含氨節(jié)霉素100μg/ml，37°C振蕩培養(yǎng)4h，保存菌種并對于 編號后，加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續(xù)在25°C下振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4h，離心收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE檢測，第1-6號6個轉(zhuǎn)化子均表達(dá)了相對分子量為35kDa的?？刹《?型的VP1抗原 表位融合蛋白，表達(dá)量為20%，并選取3號菌種為高表達(dá)菌株，用于后面的蛋白純化，而對照 菌無此蛋白條帶，見圖4。
[0046] 表達(dá)埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白的純化 根據(jù)表達(dá)?？刹《?型的VP1抗原表位融合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定 適當(dāng)?shù)募兓椒?。我們所表達(dá)的埃可病毒1型的VP1表位融合蛋白融合有載體上的GST蛋白， 表達(dá)的GST融合蛋白可很方便的用GSH瓊脂糖凝膠FF分離，因此我們決定采用親和層析法， 用High-Affinity GST Resin進(jìn)行純化。具體步驟如下： 材料和方法 1. 主要試劑： High-Affinity GST Resin為南京金斯瑞生物科技有限公司產(chǎn)品，IPTG、DTT為 BI0SHARP公司產(chǎn)品。其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。
[0047] 2. 表達(dá)?？刹《?型的VP1抗原表位融合蛋白工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及超聲裂解： 把保存的3號菌株接種到含200ml LB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，加氨芐霉素至終濃度 lOOpg/ml，置37°C搖床內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日，將菌液接種到4個分別含200 ml LB液體培養(yǎng)基的 三角燒瓶，每瓶接種菌液50 ml，置37°C搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)1小時，然后加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)4小時。
[0048] 將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的1000 ml工程菌離心(8000 rpm、20 min、4°C)收菌，菌體重 懸于300 ml的細(xì)菌裂解液（20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內(nèi)，冰浴超聲破菌10 min，離心(8000rpm、20 min、4°C )收集上清。收集的上清用于親和 層析純化。
[0049] 3.表達(dá)?？刹《?型的VP 1抗原表位融合蛋白的純化： 上清溶液加已經(jīng)平衡的High-Affinity GST Resin 10 ml，4°C結(jié)合過夜，上樣，收集穿 透液。用十倍柱床體積的1 XTOS(含ImM PMSH洗滌柱子，接著用50 ml高濃度的GSH洗脫液， 洗脫液為50 mmol/L Tris-HCl pH8.5 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脫目的蛋白，即為純化 的?？刹《?型VP1蛋白片段。
[0050] 結(jié)果 將Hi gh-Af f ini ty GST Res in凝膠柱上洗脫的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，經(jīng)誘 導(dǎo)明顯表達(dá)出VP1-GST融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于上清液中，分子量35kDa，見圖5。洗脫 測得的0D28Q=0.3，通過計算得濃度為0.4mg/ml，SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物純度在90%以上。
[0051] 純化的?？刹《?型VP1表位融合蛋白的應(yīng)用 將純化的重組埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白用作抗原，免疫新西蘭大白兔，制備 多克隆抗體血清。采用間接ELISA法檢測抗血清效價，結(jié)果證實，?？刹《?型VP1表位融合 蛋白具有較好的免疫原性和抗原性。
[0052]材料和方法 1. 主要材料： 新西蘭大白兔購自南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場，96孔酶標(biāo)板為美國Costar公司產(chǎn)品，完 全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為sigma公司產(chǎn)品，Goat Anti-rabbit IgG HRP為北京博奧 森公司產(chǎn)品，TMB顯色液為Beyot ime公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。
[0053] 2. 動物免疫及抗血清制備： 挑取兩只2kg左右的健康雌性新西蘭大白兔，耳緣靜脈取血約lml，制備免疫前正常血 清，作為陰性對照。首次免疫將純化獲得的?？刹《?型VP1表位融合蛋白與弗氏完全佐劑 按體積比1:1在注射器內(nèi)推成乳劑，進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。在初次免疫后第2W、第4W將純 化獲得的VP1表位融合蛋白與弗氏不完全佐劑按體積比1:1在注射器內(nèi)推成乳劑，進(jìn)行背部 皮下多點(diǎn)注射。在第6W注射VP1表位融合蛋白，1W后取血檢測血清效價。勁動脈取血，室溫放 置lh，4°C靜置過夜，以3000rpm離心15 min，取上清，重復(fù)離心一次，取上清，即為得到的多 克隆抗體，-20°C保存。
[0054] 3. 免疫動物血清的ELISA檢測： 將純化獲得的?？刹《?型VP1表位融合蛋白稀釋至lμg/ml，每孔100μ1包被96孔酶聯(lián) 板，4 °C過夜。用TBST洗滌3次，每孔加20%的小牛血清封閉液150μ1，37 °C封閉2h。兔抗血清從 1:1000開始稀釋，陰性對照按相同比例稀釋，37°C反應(yīng)lhJBST洗滌3次后，加入有HRP標(biāo)記 的山羊抗兔的I gG( 1:5000)，37°C反應(yīng)30 miruPBST洗滌5次后，加入TMB顯色液，37°C避光顯 色20 min，以lmol/L HC1終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測A45Q值。以P/N彡2.1的抗體最大稀釋度作 為效價終值。
[0055] 結(jié)果 采用ELISA法檢測抗血清的效價，兔抗血清從1:1000開始稀釋，同時取免疫前的血清作 為陰性對照，ELISA結(jié)果顯示，VP1表位融合蛋白加強(qiáng)免疫后血清效價大于1:10240000,陰性 對照不顯色，見圖6。說明制備的?？刹《?型VP1表位融合蛋白具有良好的免疫原性和抗原 性。
[0056] 化學(xué)合成的VP1表位融合蛋白的基因片段序列表見附件文檔:核苷酸或氨基酸序列表 計算機(jī)可讀載體。
【主權(quán)項】
1. 一種?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含強(qiáng)特異性抗原表位的VP1蛋 白片段組成，2段蛋白片段之間由甘氨酸和絲氨酸連接，整合為全長103個氨基酸的融合蛋 白，氨基酸序列如下：2. 權(quán)利要求1所述的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述的?？刹《?1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中2段含強(qiáng)特異性抗原表位的VP1蛋白片段具體為第75 位氨基酸至第140位氨基酸和第203位氨基酸至第236位氨基酸，各段氨基酸序列如下：3.權(quán)利要求1所述的?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白的制備方法，其特征在 于:采用基因工程技術(shù)表達(dá)、純化制備該蛋白，具體方法如下， 埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機(jī)分析?？刹《?型VP1蛋白的全氨基酸序 列，篩選出2個含強(qiáng)抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位 氨基酸至第236位氨基酸含有較強(qiáng)的抗原表位； 2段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，構(gòu)成總長度為103個氨基酸的融 合蛋白； 選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成該融合蛋白的全新基因序列； 在合成的基因片段的5'端增加了 feMlI的酶切位點(diǎn)（下畫線部分），在3'端增加了終止 密碼子TAA和處〇1酶切位點(diǎn)（下畫線部分），使合成的基因片段易于克隆至質(zhì)粒pGEX-4T-2內(nèi) 的你通1和處〇頂每切位點(diǎn)內(nèi)； 篩選的?？刹《?型VP1蛋白內(nèi)2個含強(qiáng)抗原表位的蛋白片段：2個含強(qiáng)抗原表位蛋白片段連接在一起形成融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列：化學(xué)合成的?？刹《?型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列(324bp)表達(dá)埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 提取質(zhì)粒PGEX-4T-2,用雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去 離子水內(nèi)；同時用你通1和處〇1雙酶切化學(xué)合成埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的基因 片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)； 取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使化學(xué) 合成?？刹《?型VP1蛋白基因片段插入到載體PGEX-4T-2內(nèi)的肩《7?〇 I位點(diǎn)之間，與 載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白； 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含100μg/ml氨芐霉素的LB平板，置37°C過 夜，次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和含PGEX-4T-2質(zhì)粒的對照菌，接種至含4mlLB培養(yǎng)基(含氨芐霉 素100μg/ml)的試管內(nèi)振搖，分別提取質(zhì)粒，用你通1和處〇 I雙酶切驗證，1.0%的瓊脂糖凝 膠電泳結(jié)果表明，切下324bp的目的基因片段； 同時，將含有外源基因的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序分析，測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒含有埃可病毒 1型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正確：構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（103個氨基酸），在 其N端融合了載體上的226個氨基酸，全長329個氨基酸，其氨基酸序列如下：表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，接種至含4ml LB培養(yǎng)基(含氨芐毒素 lOOμg/ml)的試管 內(nèi)，37°C振蕩培養(yǎng)4h，加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4h，離心收集菌體進(jìn) 行SDS-PAGE檢測，重組子表達(dá)相對分子量為35 kD的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白，而 對照菌PGEX-4T-2無此蛋白條帶； 表達(dá)?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白的純化： 將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的工程菌離心（8000 rpm、20 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養(yǎng) 液 1/10體積的細(xì)菌裂解液（20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內(nèi)，冰浴超聲破菌75次，8000rpm，4°C，離心20min收集上清，收集的上清用于下一步的親 和層析純化； 上清溶液加已經(jīng)平衡的High-Affinity GST Resin 10 ml，4°C結(jié)合過夜，上樣，收集穿 透液； 用十倍柱床體積的1 X PBS洗滌柱子，接著用50ml高濃度的GSH洗脫液，洗脫液為50 mmol/L Tris- HC1 pH8.5 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脫目的蛋白，即為純化的埃可病毒 1型VP1抗原表位融合蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，其特征在于:所述的?？?病毒1型VP1抗原表位融合蛋白中，2段含強(qiáng)特異性抗原表位的表面VP1蛋白片段，這2段VP1 蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白。5. 權(quán)利要求1所述的?？刹《?型表面蛋白VP1的融合蛋白，通過基因重組技術(shù)，也可利 用酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。6. 權(quán)利要求1或4所述的?？刹《?型2個VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白用 于埃可病毒抗體檢測試劑的制備，及用于免疫制備抗埃可病毒單抗和多抗制備。
【文檔編號】C07K19/00GK105949320SQ201610269754
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】李越希, 李素梅, 齊勇, 李佳萌, 潘英, 陳晨, 王新國, 李素芹, 陳紅霞, 徐亦非
【申請人】李越希