抗cd20嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗CD20嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該抗CD20嵌合抗原受體包括依次串聯(lián)的CD8 leader嵌合受體信號(hào)肽、CD20 VL、Optimal Linker C、CD20單鏈抗體重鏈VH、CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子，以及TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。此外，還公開了該抗CD20嵌合抗原受體的編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明能顯著提高細(xì)胞因子的分泌、CAR?T細(xì)胞的體外殺傷作用，且臨床治療效果突出。
【專利說(shuō)明】
抗CD20嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法 和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗CD20嵌合抗原受體、編碼基 因、重組表達(dá)載體(尤其是一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉(zhuǎn)基因載體)及其構(gòu)建 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤 細(xì)胞(高度特異性的細(xì)胞溶解)的能力。這個(gè)生物過程十分復(fù)雜，目前仍處于研究之中。上世 紀(jì)90年代，多個(gè)科研小組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腫瘤抗原(tymor antigens)，T淋巴細(xì)胞可以通過主要 組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)依賴性方式識(shí)別這些腫瘤 抗原。
[0003] 腫瘤免疫治療通常分為兩類，非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫治療主 要包括白細(xì)胞介素 -2( interleykin_2，IL-2)，干擾素 a( interf erona，IFN-α)，腫瘤壞死因 子(tymor necrosis factor，TNF-a)，卡介苗等細(xì)胞因子和毒素，過繼性細(xì)胞免疫治療等。 特異性免疫治療主要是腫瘤疫苗。
[0004] 1.1腫瘤非特異性免疫治療
[0005] 非特異性免疫應(yīng)答是與生倶來(lái)的，它的形成并不需要抗原刺激，能廣泛地針對(duì)多 種抗原，是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，但特異性不強(qiáng)，對(duì)某種特定抗原物質(zhì)往往不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的 反應(yīng)非特異性的免疫治療。在進(jìn)入臨床試驗(yàn)的多種細(xì)胞因子中，白細(xì)胞介素-2和干擾素應(yīng) 用最為廣泛[Rosenberg S A,Lotze Μ Τ,ΜμμΙ L M,et al. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone[J].N Engl J Med，1987,316(15):889-897.]。
[0006] 1.2腫瘤單克隆抗體的免疫治療
[0007] 近20多年來(lái)單克隆抗體已在腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用?？鼓[瘤單抗藥物一般包 括兩類:一是抗腫瘤單抗，二是抗腫瘤單抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物。免疫偶聯(lián)物分子由單 抗與"彈頭"藥物兩部分組成，"彈頭"主要包括放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接后分別 構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美國(guó)FDA分 別通過了用于臨床腫瘤治療的兩個(gè)單抗一 Rityximab(rityxan)和Trastyzymab (herceptin)[Di1lman R 0.Magic bullets at lastIFinally-approval of a monoclonal antibody for the treatment of cancer[J].Cancer Biother Radiopharm, 1997，12:223 - 225.]。目前認(rèn)為單抗的作用機(jī)制有阻斷作用、信號(hào)傳導(dǎo)作用以及靶向作用 等三種作用機(jī)制，沒有直接的殺傷作用。另外還存在藥理學(xué)方面的問題，主要是到達(dá)腫瘤的 藥量不足。由于偶聯(lián)物是異體蛋白，會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，有相當(dāng)數(shù)量將積聚于肝、脾和 骨髓。偶聯(lián)物是大分子物質(zhì)，通過毛細(xì)血管內(nèi)皮層及穿透腫瘤細(xì)胞外間隙均受到限制。
[0008] 1.3腫瘤的過繼免疫治療
[0009] 腫瘤的過繼免疫治療是指將體外激活的自體或異體免疫效應(yīng)細(xì)胞輸注給患者，以 殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。腫瘤過繼性免疫治療中的一個(gè)關(guān)鍵問題是尋找合適的腫瘤殺傷 細(xì)胞。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，包括LAK、細(xì)胞因誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-indyced killers，CIK)、TIL等細(xì)胞已先后應(yīng)用于臨床，但由于存在著擴(kuò)增倍速較低、細(xì)胞來(lái)源困難、 細(xì)胞毒力不高等諸多問題，在臨床應(yīng)用上受到限制。如何提高T細(xì)胞的腫瘤抗原特異性具有 重要的臨床意義。T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別主要是通過T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR) 識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的人類白細(xì)胞抗原(hyman leykocyte antigen，HLA)_肽復(fù)合物，因此，T 細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原識(shí)別的特異性取決于Τ細(xì)胞表面的TCR。利用分子生物學(xué)的手段克隆腫瘤特 異性T細(xì)胞的TCR，并通過構(gòu)建含TCR的病毒載體，把TCR轉(zhuǎn)入正常的T細(xì)胞中，使這些T細(xì)胞因 攜帶腫瘤特異性而成為特異性腫瘤殺傷細(xì)胞[Johnson L A，Morgan R A，Dydley M E，et al. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen[J]·Blood， 2009,114(3):535-546·]。
[0010] 1.4腫瘤疫苗治療
[0011] 腫瘤疫苗治療是通過給患者體內(nèi)導(dǎo)入腫瘤抗原來(lái)激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫 反應(yīng)。由于疫苗治療具有特異性、在體內(nèi)免疫效應(yīng)維持時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為研究熱 點(diǎn)。近年來(lái)多肽疫苗、核酸疫苗、全蛋白疫苗、抗獨(dú)特性抗體疫苗、重組病毒疫苗、細(xì)菌疫苗、 基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)疫苗等得到廣泛研究和應(yīng)用 [Robbins P F,Morgan R A,Feldman S A，et al·Tymor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ES0_1[J].J Clin 0ncol，2011，29(7):917 -924·]。腫瘤 疫苗治療的大規(guī)模應(yīng)用還有三個(gè)方面的問題亟待解決。首先，腫瘤相關(guān)抗原，每個(gè)腫瘤、每 個(gè)亞型、每個(gè)腫瘤分期，這些相對(duì)抗原表達(dá)是不一樣的，所以選準(zhǔn)抗原，選準(zhǔn)病人人群是致 關(guān)重要的。第二，如何達(dá)到腫瘤抗原在樹突狀細(xì)胞中髙效吸收與表達(dá)?抗原被樹突狀細(xì)胞吸 收是以表面受體為介導(dǎo)的。樹突狀細(xì)胞有十幾個(gè)受體，如何根據(jù)特定的抗原選擇相應(yīng)的受 體?第三，針對(duì)樹突狀細(xì)胞分化成熟的調(diào)控。樹突狀細(xì)胞的分化成熟是一個(gè)非常復(fù)雜的過 程，它既可走向激活T細(xì)胞也可以走向抑制T細(xì)胞。[靶向DC細(xì)胞的治療型腫瘤疫苗：亮點(diǎn)與 挑戰(zhàn)并存。
[0012] http://www.biodiscover.com/news/research/115794.html]
[0013] 1.5腫瘤 CAR-Τ 治療
[0014] CAR-T，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immynotherapy，嵌合抗原受 體T細(xì)胞免疫療法，結(jié)構(gòu)如圖 1 所不[Eleanor J.Cheadle，et al.CAR T cells:driving the road from the laboratory to the clinic.Immynological Reviews 2014.Vol.257:91-106]〇
[0015] 第一代CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活是通過⑶3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。 CD3z鏈能夠提供T細(xì)胞激活、裂解靶細(xì)胞、調(diào)節(jié)IL-2分泌以及體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性所需的信 號(hào)。但第一代CAR改造 T細(xì)胞的抗腫瘤活性在體內(nèi)受到了限制，T細(xì)胞增殖減少最終導(dǎo)致T細(xì) 胞的凋亡。
[0016] 第二代CAR在胞內(nèi)增加了一個(gè)新的共刺激信號(hào)，實(shí)驗(yàn)證明，這使得原有的使源自 TCR/CD3復(fù)合體的"信號(hào)Γ擴(kuò)大，許多研究都表明，搭載了 "信號(hào)2"的第二代CAR與第一代CAR 相比，抗原特異性不變，T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加，抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加，細(xì)胞死 亡延遲。常用的共刺激分子為⑶28,但之后有研究將⑶28用⑶137(4-1BB)進(jìn)行替換，除此之 外，一種使用NK細(xì)胞受體CD244的思路也被提出來(lái)。雖然不同的第二代CAR究竟孰優(yōu)孰劣，不 同的研究者用不同的腫瘤在體內(nèi)和體外的研究中得到的結(jié)果不盡相同。[深度完整版:CAR-Τ'的現(xiàn)狀和未來(lái) ·生物谷 · 2015-051-15]
[0017] 為了進(jìn)一步改良CAR的設(shè)計(jì)，許多研究組開始著眼于發(fā)展第三代CAR，不僅包括"信 號(hào)1"、"信號(hào)2"，還包括了額外的共刺激信號(hào)。不同研究者們用不同的靶點(diǎn)和共刺激信號(hào)開 展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結(jié)果存在一定的差異性。一些研究報(bào)道表 達(dá)第三代CAR的重組T細(xì)胞在抗腫瘤活性、存活周期及細(xì)胞因子釋放方面均顯著提高； Wilkie等的研究結(jié)果顯示靶向MMC1的第二代CAR與第三代CAR重組T細(xì)胞在抗腫瘤細(xì)胞毒 性方面并無(wú)明顯差異，雖然表達(dá)第三代CAR的T細(xì)胞能夠分泌更大量的IFN-γ (Wilkie S， Picco G,Foster J,et al.Retargeting of hyman T cells to tymorassociated MMC1: the evolution of a chimeric antigen receptor.J Tmmunol 2008;180:4901-4909·)。 值得注意的是，上述區(qū)別僅僅是體外實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)論，目前尚未在體內(nèi)比較第二代和第 三代CAR的報(bào)道。
[0018]這幾代CAR之間的差異可能不止來(lái)自于信號(hào)傳導(dǎo)域，胞外的抗原結(jié)合域(scFv)、重 組T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法(慢病毒VS逆轉(zhuǎn)錄病毒）、重組T細(xì)胞的回輸方式(靜脈回輸VS腹膜VS瘤 體)等均可能影響CAR-T細(xì)胞的最終抗腫瘤效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抗CD20嵌合抗原受體、編碼 基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0021] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種抗CD20嵌合抗原受體(二代CAR)，包括依次串聯(lián) 的如SEQIDN0.15所示的CD8 1eader嵌合受體信號(hào)肽、如SEQIDN0.16所示的CD20單鏈抗 體輕鏈VL、如SEQ ID N0.19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID N0.20所示的CD20單鏈抗 體重鏈VH、如SEQ ID NO.21所示的⑶8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.22所示的⑶8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQ ID NO. 23所示的⑶137嵌合受體共刺激因子，以及 如SEQ ID奶^彳所示的^^嵌合受體了細(xì)胞激活域。
[0022]進(jìn)一步的，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID N0.50所示。
[0023] 一種抗⑶20嵌合抗原受體(三代CAR)，包括依次串聯(lián)的如SEQ ID NO. 15所示的⑶8 leader嵌合受體信號(hào)肽、如SEQ ID Ν0· 16所示的CD20VL、如SEQ ID Ν0· 19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.20所示的CD20單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO.21所示的CD8 Hinge 嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO. 22所示的CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQ ID NO.25所示的⑶28嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO.23所示的⑶137嵌合受體共刺激因子 以及如SEQ ID N0.24所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。
[0024]進(jìn)一步的，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID N0.51所示。
[0025]本發(fā)明的第二目的在于提供一種編碼上述抗CD20嵌合抗原受體的基因。
[0026] 進(jìn)一步的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.52(二代CAR)或SEQ ID N0.53(三 代CAR)所示。
[0027] 本發(fā)明的第三目的在于提供含有上述基因的重組表達(dá)載體。
[0028] 進(jìn)一步的，所述重組表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒表 達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒。
[0029]進(jìn)一步的，所述的慢病毒表達(dá)載體包含上述抗⑶20嵌合抗原受體的基因。
[0030]進(jìn)一步的，所述的慢病毒表達(dá)載體包括：用于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子pUC Ori序 列，如SEQ ID NO. 2所示；用于目的菌株大量擴(kuò)增的含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子SV40 Ori序列，如SEQ ID NO.3所 示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的ZsGreenl綠色 熒光蛋白，如SEQ ID N0.11所示；用于共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)蛋白質(zhì)的IRES核糖體結(jié)合序列，如SEQ ID N0.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄的人EFla啟動(dòng)子，如SEQ ID N0.14所示； 用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體的編碼基因，如 SEQ ID N0.52或SEQ ID N0.53所示；用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率的eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙 肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，如SEQ ID N0.13所示。
[0031] 進(jìn)一步的，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括:如SEQ ID NO.5 所不的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID Ν0·7所示的Gag順式元件、如SEQ ID Ν0·8所示的RRE順式元 件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件。
[0032] 進(jìn)一步的，所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括:如SEQ ID NO. 5 所不的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID Ν0·7所示的Gag順式元件、如SEQ ID Ν0·8所示的RRE順式元 件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件所述慢病毒 包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV啟動(dòng)子。
[0033] 進(jìn)一步的，所述eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng) 突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
[0034] 本發(fā)明的第四目的在于提供一種上述慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步 驟：
[0035] (1)將含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列（如SEQ ID N0.1所示）、原核復(fù)制子pUC 〇ri序列（如SEQ ID NO. 2所示）、病毒復(fù)制子SV40 Ori序列（如SEQ ID NO. 3所示）、用于慢病 毒包裝的慢病毒包裝順式元件、ZsGreenl綠色熒光蛋白（如SEQ ID勵(lì).11所示）、11^3核糖 體結(jié)合序列（如SEQ ID N0.12所示）、eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（如SEQ ID NO. 13所示)存儲(chǔ)于慢病毒骨架質(zhì)粒上；
[0036] (2)將人EFla啟動(dòng)子（如SEQ ID N0.14所示）、用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體 的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設(shè)計(jì)方案，經(jīng)過酶切、連接、 重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒中，得到二代CAR或三代CAR設(shè)計(jì)的重組慢病毒質(zhì)粒；
[0037] (3)將得到的重組慢病毒質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋白質(zhì)粒 pEnv-G共同轉(zhuǎn)染HEK293T/17細(xì)胞，在HEK293T/17細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，包裝成功重 組慢病毒載體會(huì)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；
[0038] (4)將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的離子交換方式進(jìn)行純化，分 別得到重組慢病毒載體。
[0039] 進(jìn)一步的，步驟（1)中，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括:如 SEQ ID N0.5所不的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順 式元件、如SEQIDN0.9所示的env順式元件、如SEQIDN0.10所示的cPPT順式元件 ;所述 慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如SEQ ID N0.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的 env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV啟動(dòng)子。
[0040] 進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR的嵌合 抗原受體包括：如SEQ ID N0.15所示的CD8 leader嵌合受體信號(hào)肽、如SEQ ID N0.16所示 的CD20 VL、如SEQ ID Ν0· 19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID Ν0·20所示的CD20單鏈抗 體重鏈VH、如SEQ ID NO.21所示的⑶8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.22所示的⑶8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQ ID NO.23所示的⑶137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO. 24所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域;所述用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的三代 CAR的嵌合抗原受體包括:如SEQ ID N0.15所示的CD8 leader嵌合受體信號(hào)肽、如SEQ ID Ν0· 16所示的CD20 VL、如SEQ ID Ν0· 19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID Ν0· 20所示的 CD20單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO. 21所示的CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO. 22所 示的⑶8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQ ID NO. 25所示的⑶28嵌合受體共刺激因 子、如SEQ ID N0.23所示的⑶137嵌合受體共刺激因子、以及如SEQ ID N0.24所示的TCR嵌 合受體T細(xì)胞激活域。
[0041] 進(jìn)一步的，步驟（1)中，所述eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個(gè)核 苷酸的增強(qiáng)突變，具體為:g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
[0042] 進(jìn)一步的，步驟(2)中，由人EFla啟動(dòng)子啟動(dòng)整個(gè)CAR基因表達(dá);⑶8 leader嵌合受 體信號(hào)肽位于CAR編碼序列的N端，用于引導(dǎo)CAR蛋白定位于細(xì)胞膜;CD20單鏈抗體輕鏈VL、 Optimal Linker C、Q)20單鏈抗體重鏈VH組合成scfv區(qū)域，用于識(shí)別⑶20抗原；0)8 Hinge 嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細(xì)胞膜外側(cè);CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)用于將 整個(gè)嵌合受體固定于細(xì)胞膜上;CD137嵌合受體共刺激因子用于刺激T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子 分泌;TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域用于激活下游信號(hào)通路的表達(dá)；當(dāng)scfv區(qū)域與CD20抗原結(jié) 合時(shí)，信號(hào)通過嵌合受體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生包括T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì) 胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲、裂解靶細(xì)胞的一系列生物學(xué)效應(yīng)。
[0043]進(jìn)一步的，步驟(4)中，所述慢病毒載體有帶焚光標(biāo)簽zsGreenl的版本和不帶焚光 標(biāo)簽zsGreenl版本，帶熒光標(biāo)簽的版本用于體外實(shí)驗(yàn)，不帶熒光標(biāo)簽的版本用于臨床實(shí)驗(yàn)。 [0044] 進(jìn)一步的，步驟(4)中，所述抽濾步驟控制上清體積在200ml~2000ml，真空度控制 在-0.5MPA~-0.9MPA，防止由于堵孔帶來(lái)的載體損失;所述吸附步驟控制溶液的PH值在6~ 8，防止PH的變化導(dǎo)致載體失活;所述洗脫步驟控制洗脫液的離子強(qiáng)度在0.5M~1.0M，防止 離子強(qiáng)度的變化導(dǎo)致洗脫不完全或者載體失活。
[0045]本發(fā)明所采用的表達(dá)載體包括原核復(fù)制子(pUC ori)用于質(zhì)粒復(fù)制；原核篩選標(biāo) 記(AmpR)用于目的菌株大量擴(kuò)增;病毒復(fù)制子(SV40 Ori)用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制；慢 病毒包裝順式元件（RSV、5 terminal LTR、3 terminal Self-Inactivating LTR、Gag、RRE、 env、cPPT)用于慢病毒包裝;真核焚光標(biāo)簽蛋白（ZsGreenl)用于真核細(xì)胞表達(dá)綠色焚光;共 表達(dá)元件（IRES)用于共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)蛋白質(zhì);真核啟動(dòng)子(EFla)用于嵌合抗原受體基因的真 核轉(zhuǎn)錄；嵌合抗原受體（CD8 leader、CD20 VL、Common Linker A(SEQ ID NO. 17)/Common Linker B(SEQ ID NO.18)/0ptimal Linker C(SEQ ID NO.19)、CD20 VH、CD8 Hinge、CD8 Transmembrane、CD137、TCR)用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代和三代CAR;轉(zhuǎn)錄后 調(diào)控元件(eWPRE)用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。
[0046]本發(fā)明的第五目的在于提供一種CART細(xì)胞，所述的CAR-T細(xì)胞是由上述抗⑶20嵌 合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞。
[0047]本發(fā)明的再一目的在于提供上述CAR-T細(xì)胞在制備淋巴瘤治療藥物中的應(yīng)用。 [0048]進(jìn)一步的，所述淋巴瘤治療藥物為套細(xì)胞淋巴瘤治療藥物或?yàn)V泡型淋巴瘤治療藥 物。
[0049] 本發(fā)明涉及含肽的醫(yī)藥配置品，具體涉及：
[0050] 一、含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列、原核復(fù)制子pMC Ori序列，、病毒復(fù)制子 SV40 Ori序列、RSV啟動(dòng)子、人EFla啟動(dòng)子、慢病毒5 terminal LTR、慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、IRES核 糖體結(jié)合序列、ZsGreenl綠色熒光蛋白、WPRE 土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的重組慢病 毒載體骨架，這種重組慢病毒載體骨架可以搭載不同的治療性基因并廣泛的用于過繼性細(xì) 胞治療領(lǐng)域。
[0051 ]二、重組慢病毒載體骨架、CD8 leader嵌合受體信號(hào)肽、CD20單鏈抗體輕鏈VL、單 鏈抗體鉸鏈LinkerA、單鏈抗體鉸鏈Linker B、單鏈抗體鉸鏈Linker C、0)20單鏈抗體重鏈 VH、CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD28嵌合受體共刺激因 子、CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域構(gòu)建形成重組慢病毒載體，該方 法得到的重組慢病毒載體可以實(shí)現(xiàn)在人T淋巴細(xì)胞上表達(dá)CD20嵌合抗原受體，引導(dǎo)并激活T 淋巴細(xì)胞對(duì)CD20陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷作用，在臨床上用于治療B淋巴瘤。
[0052]本發(fā)明所采用的針對(duì)CD20的CAR-T技術(shù)，是一種綜合了腫瘤單克隆抗體的免疫治 療和腫瘤的過繼免疫治療優(yōu)點(diǎn)的靶向治療新技術(shù)。CD20作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的成分對(duì) B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)有調(diào)節(jié)作用，并且⑶20特異性表達(dá)在pre B cell到mature B cell的分化 階段，尤其是大多數(shù)淋巴瘤細(xì)胞表面（Mohamed-Rachid Boulassel and Ahmed Galal. Immunotherapy for B-Cell Neoplasms using T Cells expressing Chimeric Antigen Receptors. Sultan Qaboos University Med J,August 2012，Vol·12，Iss·3， pp. 273-285.)，因此，最近幾年在套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)和濾泡型淋巴瘤(FL)的治療上有著顯 著的療效，被認(rèn)為是最有前景的B細(xì)胞淋巴瘤治療方式之一。
[0053]嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件（圖1所示），賦予T淋巴細(xì)胞HLA非依賴的 方式識(shí)別腫瘤抗原的能力，這使得經(jīng)過CAR改造的T細(xì)胞相較于天然T細(xì)胞表面受體TCR能夠 識(shí)別更廣泛的目標(biāo)。CAR的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)中包括一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA)結(jié)合區(qū)（通常來(lái)源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFV段），一個(gè)胞外鉸鏈區(qū)， 一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。scFV段的設(shè)計(jì)對(duì)于CAR的特異性、有效性以及基因改造 T細(xì)胞自身的安全性來(lái)是關(guān)鍵的決定因素。
[0054]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0055] 本發(fā)明采用的scFV段的linker設(shè)計(jì)，是使用世翱公司的Linkers pool，經(jīng)過蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(https :// www.predictprotein.org/)的分析，通過對(duì)蛋白質(zhì)二 級(jí)結(jié)構(gòu)、溶劑可接觸性、蛋白質(zhì)柔韌性、二硫鍵橋、結(jié)合位點(diǎn)等蛋白質(zhì)特性的比較，優(yōu)選得 出。通過體外細(xì)胞因子分泌檢測(cè)試驗(yàn)以及殺傷效率試驗(yàn)證明，與國(guó)外的設(shè)計(jì)相比，能夠顯著 提高CAR-T細(xì)胞的體外殺傷作用。并且，在臨床治療的效果上也比國(guó)外臨床實(shí)驗(yàn)的效果好。 該scFV段的linker設(shè)計(jì)，同樣可以應(yīng)用于第三代CAR設(shè)計(jì)方案。第三代CAR設(shè)計(jì)與第二代設(shè) 計(jì)相比，增加了CD28嵌合受體共刺激因子(SEQ ID NO. 25)，會(huì)有更強(qiáng)的信號(hào)放大作用。
[0056] 本發(fā)明所采用的慢病毒載體柱純化方式不同于通常采用的超速離心或者高速離 心的方式，半自動(dòng)化操作，避免人工操作的繁瑣和失誤，所回收的慢病毒載體在內(nèi)毒素、支 原體、宿主DNA殘留等指標(biāo)上完全達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)。
[0057] 本發(fā)明所采用CAR設(shè)計(jì)方案也可以應(yīng)用于第二代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上。第二代和第 三代慢病毒載體在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別（如圖2B所示），主要是第三代慢病毒載體把第二代載體5 ' LTR的U3區(qū)域替換為RSV啟動(dòng)子，這樣就消除了U3轉(zhuǎn)錄時(shí)對(duì)Tat蛋白的依賴，既可以在慢病毒 的結(jié)構(gòu)基因里去除Tat序列，也提高了慢病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄持續(xù)性。第二代和第三 代慢病毒載體主要是基因組轉(zhuǎn)錄方式的區(qū)別，因此本發(fā)明所采用CAR設(shè)計(jì)方案可以應(yīng)用于 這兩代慢病毒載體。
[0058]本發(fā)明采用的第三代慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti_3G basic，與賓州大學(xué)Carl H.June 等人（P 〇 r t e r D L，L e v ine BL, Kalos M，Bagg A, June CH.Chimeric antigen receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011；365: 725-33.)所采用的第三代慢病毒載體相比，去除了噬菌體fl復(fù)制起點(diǎn)，采用真核病毒SV40 復(fù)制子，增加了目的基因在真核細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，增強(qiáng)了真核表達(dá)效果。
[0059] 本發(fā)明采用的第三代慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3G basic，采用enhancedWPRE元件， 與賓州大學(xué)Carl H.June等人（Porter DL,Levine BL,Kalos Μ,Bagg A,June CH.Chimeric antigen receptormodif ied T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011; 365:725-33.)所采用的WPRE元件相比，，有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng)突變(g. 396G>A、g. 3970 T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T)，能夠增強(qiáng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多聚腺苷化，增加 細(xì)胞內(nèi)mRNA的含量，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。
[0060] 本發(fā)明采用的Lentival包裝系統(tǒng)是無(wú)輔助病毒的四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，通過四種質(zhì)粒 共同轉(zhuǎn)染至HEK293T/17細(xì)胞中，產(chǎn)生重組慢病毒載體。重組后的慢病毒載體是復(fù)制缺陷型 載體，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無(wú)法復(fù)制和增殖，安全性有很大提高。
[0061] 本發(fā)明采用的慢病毒載體有帶熒光標(biāo)簽zsGreenl的版本和不帶熒光標(biāo)簽 zsGreenl版本，帶焚光標(biāo)簽的版本用于體外實(shí)驗(yàn)，不帶焚光標(biāo)簽的版本用于臨床實(shí)驗(yàn)。 [0062]本發(fā)明優(yōu)選采用第三代慢病毒載體（圖2A所示），3'SIN LTR去除了U3區(qū)域，消除了 慢病毒載體自我復(fù)制的可能性，大大提高了安全性;增加了 CPPT和WPRE元件，提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效 率和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率;采用RSV啟動(dòng)子保證了慢病毒載體包裝時(shí)核心RNA的持續(xù)高效轉(zhuǎn) 錄;采用人自身的EFla啟動(dòng)子，使CAR基因能夠在人體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)。
[0063]可見，本發(fā)明所述的重組慢病毒載體將給B細(xì)胞淋巴腫瘤的CAR-T治療提供可靠的 轉(zhuǎn)基因保障。
【附圖說(shuō)明】
[0064] 圖1是本發(fā)明所述的CAR的示意圖，其中，圖1 (A)是CAR的基本結(jié)構(gòu)圖，，圖1 (B)是 CAR的代次改進(jìn)不意圖；
[0065] 圖2是本發(fā)明所述的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖2(A)是本發(fā)明采用的第三代 慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖2(B)是第二代和第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)比較；
[0066] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建本發(fā)明所述的重組慢病毒載體的構(gòu)建流程圖，其中， 圖3(A)是慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3G basic的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(B)是pCAR20-CLA質(zhì)粒的結(jié) 構(gòu)示意圖；圖3(C)圖是pCAR20-CLB質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(D)圖是pCAR20-0LC質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 示意圖；圖3(E)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(F)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒 pPac-R的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3(G)圖是膜蛋白pEnv-G的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0067] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLA的酶切預(yù)測(cè)及酶切瓊脂糖凝 膠電泳圖；其中，圖4A是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLA的酶切預(yù)測(cè)示意圖，其中l(wèi)anel是lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3 · 5Kb、3Kb、2 · 5kb、 2Kb、1 · 5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp; lane2是pCAR20-CLA的Kpn 頂每切預(yù)測(cè)：條帶從上到下 依次為:658%?、174%?、1426&?;圖48是重組慢病毒質(zhì)粒?041?20-〇^的酶切瓊脂糖凝膠電 泳圖，其中 lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結(jié)果；lane2是pCAR20_CLA的Κρη I酶切 電泳結(jié)果；
[0068] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLB的酶切預(yù)測(cè)及酶切瓊脂糖凝 膠電泳圖；其中，圖5Α是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLB的酶切預(yù)測(cè)示意圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3 · 5Kb、3Kb、2 · 5kb、 2Kb、1 · 5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp; lane2是pCAR20-CLB的Nco 頂每切預(yù)測(cè)：條帶從上到下 依次為：5867bp、3897bp;圖5B是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLB的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其 中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結(jié)果；lane2是pCAR20_CLB的Nco I酶切電泳結(jié) 果；
[0069]圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-0LC的酶切預(yù)測(cè)及酶切瓊脂糖凝 膠電泳圖；其中，圖6A是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-0LC的酶切預(yù)測(cè)示意圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3 · 5Kb、3Kb、2 · 5kb、 2Kb、1 · 5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp; lane2是pCAR20-0LC的Sac II酶切預(yù)測(cè)：條帶從上到 下依次為:5577bp、3840bp、377bp;圖6B是重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-0LC的酶切瓊脂糖凝膠電 泳圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結(jié)果；lane2是pCAR2〇-〇LC的Sac II酶 切電泳結(jié)果；
[0070] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例2中離子交換色譜法純化重組慢病毒載體的流程圖；
[0071] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例2中重組慢病毒載體的不同純化方式的滴度檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0072] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例2中重組慢病毒載體的不同純化方式的支原體檢測(cè)結(jié)果示意 圖；其中，lanel為DL2000 marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、lkb、750bp、 500bp、250bp、lOObp; lane2為陽(yáng)性對(duì)照；lane3為陰性對(duì)照；lane4為PBS; lane5為水；lane6 為裂解液；lane7為超速離心純化的慢病毒；laneS為高速離心純化的慢病毒；lane9為離子 交換色譜純化的慢病毒;lanelO為空細(xì)胞；
[0073] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例3中mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，RT-QPCR結(jié)果表明CAR在TOMC 細(xì)胞內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄；
[0074]圖11是本發(fā)明實(shí)施例3中CAR蛋白表達(dá)量的WB檢測(cè)圖，結(jié)果表明CAR蛋白在TOMC細(xì) 胞內(nèi)高效表達(dá)；其中，圖11A中，lanel為PBMC空細(xì)胞，lane2為對(duì)照病毒M0CK，lane3為 lvCAR20-CLA，lane4為lvCAR20-CLB，lane5為lvCAR20-0LC;圖 11B是beta-actin 內(nèi)參條帶； [0075]圖12是本發(fā)明實(shí)施例3中LDH檢測(cè)不同效靶比條件下的殺傷效率，E為效應(yīng)細(xì)胞，T 為靶細(xì)胞；
[0076]圖13是本發(fā)明實(shí)施例3中qPCR檢測(cè)不同效靶比條件下細(xì)胞因子表達(dá)水平示意圖，E 為效應(yīng)細(xì)胞，T為靶細(xì)胞;其中，圖13A表示a-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；圖13B表示IFN- γ的mRNA轉(zhuǎn) 錄水平；
[0077]圖14是本發(fā)明實(shí)施例3中CAR20-T細(xì)胞在體外和體內(nèi)的變化情況對(duì)比圖；其中，圖 14A表示不同病人的CAR20-T細(xì)胞在體外對(duì)CD20+細(xì)胞的殺傷作用曲線；圖14B表示回輸后頸 部淋巴結(jié)體積的隨時(shí)間的變化曲線；圖14C表示回輸后腫瘤體積隨時(shí)間的變化情況；
[0078]圖15是本發(fā)明實(shí)施例4中連續(xù)3個(gè)批次的第二代和第三代重組慢病毒載體的滴度 結(jié)果比較；
[0079] 圖16是本發(fā)明實(shí)施例5中LDH檢測(cè)不同效靶比條件下的殺傷效率，E為效應(yīng)細(xì)胞，T 為靶細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0080] 以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0081] 實(shí)施例1構(gòu)建重組慢病毒載體
[0082] 一、材料
[0083] 1、慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti_3G basic，慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋 白質(zhì)粒pEnv-G，HEK293T/17細(xì)胞、同源重組酶由世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司提供；
[0084] 2、引物:根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA片段和靶位點(diǎn)所需的引物，該引物由上海 生物公司合成，具體為：
[0085] EFla-F:5'-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3'（SEQ ID N0.26)
[0086] EFla-R:5'-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3'（SEQ ID N0.27)
[0087] CD8 leader-F:5'-ggtgtcgtgaggatccgccaccatggccttaccagtgaccgc-3'（SEQ ID NO.28)
[0088] CD8 leader-R:5，-GTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG-3，（SEQ ID N0.29)
[0089] VL-F:5'-cacgccgccaggccggacattgtgctgacccaatctcc-3'（SEQ ID NO.30)
[0090] VL-R:5'-ACCTTTTATTTCCAGCTTGGTCC-3'（SEQ ID N0.31)
[0091 ] CLA-VH-F:5，-caagctggaaataaaaggcggtggctcgggtggtgggtcgggcggcggatctggggg aggttctgaggtgcagctgcagcagtct-3'(SEQ ID NO.32)
[0110] 所示的DNA序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質(zhì)粒 形式保存;SEQ ID N0.52、SEQ ID N0.53由常州基宇生物科技有限公司合成。
[0111] 4、工具酶Kpn I、Nco I、Sac II、ApaL I、Sac I、Cla I、Sal I、T4DNA連接酶均購(gòu)自 NEB公司；
[0112] 5、高保真酶PrimeSTAR、RN貝勾自Takara公司；
[0113] 6、0·22ym-〇·8ym PES濾器購(gòu)自millipore公司；
[0114] 7、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自MN公司；
[0115] 8、感受態(tài)細(xì)胞T0P10購(gòu)自tiangen公司；
[0116] 9、NaCl、KCl、Na2HP04.12H20、KH2P04、Trypsin、EDTA、CaC12、Na0H、PEG6000 均購(gòu)自 上海生工；
[0117] 10、0pti_MEM、FBS、DMEM、、1640、Hepes、購(gòu)自 invitrogen公司；
[0118] 11'Biotinylated protein L購(gòu)自GeneScript公司；
[0119] 12、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、DAB工作液均購(gòu)自北京中杉金橋；
[0120] 13、ECL+plusTM Western blotting system購(gòu)自Amersham公司；
[0121 ] DNeasy試劑盒購(gòu)自上海捷瑞公司；
[0122] 15、淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自深圳達(dá)科為公司；
[0123] 16、phycoerythrin(PE)_conjugated streptavidin購(gòu)自BD Bioscience公司；
[0124] 17、SA_HRP購(gòu)自上海翊圣公司；
[0125] 18、支原體檢測(cè)試劑盒、內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒、⑶20+K562細(xì)胞購(gòu)自世翱(上海)公司；
[0126] 19、LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自promega公司；
[0127] 二、重組慢病毒載體 lvCAR20-CLA、lvCAR20-CLB、lvCAR20-0LC 的構(gòu)建方法。
[0128] 參見圖3,本發(fā)明所述重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：
[0129] 1、將人EFla啟動(dòng)子、CD8 leader嵌合受體信號(hào)肽、CD20單鏈抗體輕鏈VUCommon Linker A.Common Linker B、0ptimal Linker C、CD20單鏈抗體重鏈VH、CD8 Hinge嵌合受 體鉸鏈、⑶8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細(xì) 胞激活域片段克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti-3G basic，分別得到重組慢病毒質(zhì)粒?041?20-CLA，pCAR20-CLB，pCAR20-0LC。
[0130] (1)將慢病毒骨架質(zhì)粒pLenti_3G basic使用Cla I和Sal I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙 酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)8303bp的片段VI(圖4所示），并割膠回收置于 Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物 的純度和濃度；
[0132] 表1瓊脂糖凝膠回收步驟
[0133] (2)用引物EFla-F和EFla-R以合成的SEQ ID勵(lì).14為模板，使用表2中的體系，卩0? 循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 2π?η)*35εγ(：1θ，72Γ 10min。產(chǎn) 物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)1208bp的片段a，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用 MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；

[0135] 表2 50μ1 PCR反應(yīng)體系
[0136] (3)用引物CD8 1eader-F和CD8 1eader-R以合成的SEQIDN0·15為模板，使用表2 中的體系，PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 30sec)*35cycle， 72°C 5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)lOlbp的片段b，并割膠回收置于 Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物 的純度和濃度；
[0137] (4)用引物VL-F和VL-R以合成的SEQ ID勵(lì).16為模板，使用表2中的體系，？0?循環(huán) 條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇8θ(3)*35ε7(：1θ，72Γ 5min。產(chǎn)物經(jīng) 過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)336bp的片段c，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0138] (5)用引物CLA-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵(lì).20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇8θ(3)*35ε7(：1θ，72Γ 5min。產(chǎn) 物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)424bp的片段d，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN 公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0139] (6)用引物CLB-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵(lì).20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇8θ(3)*35ε7(：1θ，72Γ 5min。產(chǎn) 物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)430bp的片段e，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN 公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0140] (7)用引物0LC-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵(lì).20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇8θ(3)*35ε7(：1θ，72Γ 5min。產(chǎn) 物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)421bp的片段f，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用 MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0141] (8)用引物CD8Hinge-F和CD8Hinge-R以合成的SEQIDN0·21為模板，使用表2中 的體系，PCR循環(huán)條件為 ：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 30sec)*35cycle，72 °C 5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)147bp的片段g，并割膠回收置于 Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物 的純度和濃度；
[0142] (9)用引物CD8 Transmembrane-F和CD8 Transmembrane-R以合成的SEQ ID N0.22 為模板，使用表2中的體系，PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇sec)*35Cycle，72°C 5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)lOObp的片段h，并割 膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)， 并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0143] (10)用引物CD137-F和CD137-R以合成的SEQIDN0.23為模板，使用表2中的體系， PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇8θε)*35ε7(：1θ，72Γ 5min〇 產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)142bp的片段i，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用 MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0144] (11)用引物TCR-F和TCR-R以合成的SEQ ID ^).24為模板，使用表2中的體系，卩0? 循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 3〇8θ(3)*35ε7(：1θ，72Γ 5min。產(chǎn) 物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)355bp的片段j，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN 公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0145] (12)將DNA片段b、c、d各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，60°C 10sec，72°C 30sec)*6cycle，加入引 物CD8 leader-F/VL-Rjgsr 10sec，6(TC 10sec，72°C 4〇8θ(3)*2^γ(3?θ，72Γ 5min。產(chǎn)物 經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)814bp的片段k，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公 司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0148] 表3 50μ1重疊PCR反應(yīng)體系
[0149] (13)將DNA片段b、c、e各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，60°C 10sec，72°C 30sec)*6cycle，加入引 物CD8 leader-F/VL-Rjgsr 10sec，6(TC 10sec，72°C 4〇8θ(3)*2^γ(3?θ，72Γ 5min。產(chǎn)物 經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)820bp的片段1，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公 司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0150] (14)將DNA片段b、c、f各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，60°C 10sec，72°C 30sec)*6cycle，加入引 物CD8 leader-F/VL-Rjgsr 10sec，6(TC 10sec，72°C 4〇8θ(3)*2^γ(3?θ，72Γ 5min。產(chǎn)物 經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)81 lbp的片段m，并割膠回收置于Eppendorf管內(nèi)，用MN公 司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物的純度和濃度；
[0151] (15 )將D N A片段g、h、i、j各1 μ 1作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入 Eppendorf管內(nèi)，PCR循環(huán)條件為：98°C 3min，（98°C 10sec，6(TC 10sec，72°C 30sec)* 6cycle，加入引物CD8 Hinge-F/TCR-R，（98°C 10sec，6(TC 10sec，72°C 30sec)*24cycle， 72°C 5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)704bp的片段n，并割膠回收置于 Eppendorf管內(nèi)，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測(cè)定產(chǎn)物 的純度和濃度；
[0152] (16)將DNA片段Vl、a、k、n以5μ1總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管 內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反 應(yīng)液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μΙ的轉(zhuǎn)化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，16小時(shí)。
[0153] 挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLA，對(duì) 正確的克隆進(jìn)行酶切鑒定(見圖4);
[0154] (17)將 DNA 片段 Vl、a、l、n以 5μ1 總體積且摩爾比l:l:l:U^I^WPAEppendorf^ 內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反 應(yīng)液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μΙ的轉(zhuǎn)化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，16小時(shí)。
[0155] 挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pCAR20-CLB，對(duì) 正確的克隆進(jìn)行酶切鑒定(見圖5);
[0156] (18)將DNA片段Vl、a、m、n以5μ1總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管 內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反 應(yīng)液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37 °C搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μ1的轉(zhuǎn)化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，16小時(shí)。挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒 定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒PCAR20-0LC，對(duì)正確的克隆進(jìn)行酶切鑒定（見圖 6)〇
[0157] 2、重組慢病毒載體 1 vCAR20-CLA、1 vCAR20-CLB、1VCAR20-0LC 的包裝。
[0158] (1)完全培養(yǎng)基:取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10%FBS+5ml Pen-Srep，上下顛 倒混勻即可；
[0159] (2)1XPBS溶液：稱量NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HP04.12H20 3.58g，KH2P04 0.24g
[0160] 置于1000ml燒杯中，加入900ml Milli-Q grade超純水溶解，溶解完成后，使用 1000ml量筒定容至1000ml，121°C高溫濕熱滅菌20min;
[0161] (3)0.25%Trypsin溶液：稱量Trypsin 2.5g，EDTA 0.19729g置于 1000ml燒杯中， 加入900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μΜ過濾除菌，長(zhǎng)期 使用可保存至_20°C冰箱；
[0162] (4)0.5M CaC12溶液：稱量36.75g CaC12用400ml Milli-Q grade超純水溶解；用 Mi 11 i-Q grade超純水將總體積定容至500ml，混勻;0.22μπι過濾除菌，分裝保存到50ml離心 管中，每管45ml左右，4°C保存。
[0163] (5)2XHBS溶液：稱量4.09g NaCl，0.269g Na2HP04,5.96g Hepes，用400ml Milli-Q grade超純水溶解;校準(zhǔn)pH儀后，用2M NaOH溶液將HBS溶液的pH調(diào)到7 · 05。調(diào)整每瓶HBS的 PH消耗2M NaOH為3ml左右；
[0164] (6)從液氮罐中取出凍存的HEK293T/17細(xì)胞，迅速轉(zhuǎn)移到37°C水浴中，1~2min后 轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中，無(wú)菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至10cm2培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足含10%FBS 的01^11至81111710〇112(^此，2411后顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合的程度大于80%進(jìn)行傳代；
[0165] (7)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、無(wú)污染的HEK293T/17細(xì)胞，每2-6個(gè)培養(yǎng)皿為一組，將細(xì)胞 胰酶消化后，用電動(dòng)移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個(gè)消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免 培養(yǎng)皿變干；使用lml移液器將所有細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；
[0166] (8)將上述2-6個(gè)培養(yǎng)皿中的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再?zèng)_洗一便 培養(yǎng)皿；
[0167] (9)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細(xì)胞懸液，將細(xì)胞傳到8-24個(gè) 10cm2培養(yǎng)皿中，每皿的細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)約4X106個(gè)/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細(xì)胞密度和 預(yù)期的相差較大，則需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照4 X 106個(gè)/皿的量接種；
[0168] (10)每6個(gè)培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后 晃動(dòng)數(shù)次，使細(xì)胞充分鋪開，然后放入5 % C02培養(yǎng)箱。剩余細(xì)胞做同樣處理；
[0169] (11)檢查所傳代細(xì)胞，細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80%，輪廓飽滿，貼壁良好，在細(xì)胞培 養(yǎng)皿中均勾分布；
[0170] (12)為細(xì)胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基，每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的C02濃 度設(shè)定值提高到8% ;
[0171] (13)按照N+0.5配DNA/CaC12溶液。每皿HEK293T/17細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例 使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20yg)，pPac-GP(15yg)，pPac-R(1 Oyg)，pEnv-G(7 · 5yg)。取一個(gè)新的 5ml離心管，加入0.5M CaC12:0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20yg:pPac_GP 15yg:pPac_R 10yg: pEnv-G 7.5yg，補(bǔ)充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；
[0172] (14)另取一支5ml離心管，加入0.5ml DNA/CaC12溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿 住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動(dòng)，另一只手拿一把lmL移 液槍，吸取0.5mL 2 X HBS溶液，緩慢滴加進(jìn)入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2 X HBS 加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；
[0173] (15)取一皿細(xì)胞，將離心管中的lmL鈣轉(zhuǎn)液滴加進(jìn)去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整 個(gè)培養(yǎng)皿中；
[0174] (16)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放還到另一個(gè)5 % C02培養(yǎng)箱中。 確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個(gè)。在5%C02培養(yǎng)箱中放置(6-8h);
[0175] (17)將第一個(gè)培養(yǎng)箱的C02濃度設(shè)定值調(diào)回到5% ;
[0176] (18)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80-85%左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng) 基吸走，更換l〇ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基；
[0177] (19)48小時(shí)后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細(xì)胞仍然是貼壁的。可以看到超過95%細(xì) 胞都會(huì)帶有綠色熒光。將同一個(gè)病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10mL 新鮮培養(yǎng)基；
[0178] (20)72小時(shí)后，再次將同一個(gè)病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在 一起，丟棄培養(yǎng)皿;此時(shí)收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvCAR20-CLA、lvCAR20-CLB、 lvCAR20-0LC〇
[0179] 實(shí)施例2重組慢病毒載體的濃縮及檢測(cè)
[0180] 超速離心法純化重組慢病毒載體；
[0181] (1)將收集的上清液分裝到50ml離心管中，500g室溫離心10min，除去細(xì)胞和大的 碎片；
[0182] (2)用0 · 22μπι-0 · 8μπι濾器過濾上清液；
[0183] (3)取6個(gè)Hitachi 40PA超速離心管，表面噴灑70%乙醇消毒，放在超凈臺(tái)用紫外 燈照射殺菌30分鐘。也可以通過高溫濕熱滅菌；
[0184] (4)將第2步處理好的細(xì)胞上清樣品分裝32ml到離心管中；
[0185] (5)蓋上金屬蓋，將離心管連同金屬蓋一起配平，用1XPBS調(diào)整使重量偏差在0.02g 范圍內(nèi)；
[0186] (6)將配平的離心管對(duì)稱放置于超速離心轉(zhuǎn)子P50AT2中。設(shè)置離心轉(zhuǎn)速100,000g， 4°C離心2小時(shí)；
[0187] (7)離心結(jié)束后，小心將離心管從轉(zhuǎn)子中拿出，可以看到在離心管底有一小團(tuán)沉 淀，用Marker筆在外管壁上做標(biāo)記，倒掉上清。將離心管倒扣在預(yù)先鋪好的紙巾上，使殘余 液體流掉。可以用移液槍將掛在壁上的液滴吸走；
[0188] (8)向每個(gè)離心管中加入200μ1的Opti-MEM，用200μ1移液器吹打使沉淀溶解，盡量 減少泡沫的產(chǎn)生；
[0189] (9)將超速離心管插入50ml離心管中，蓋上蓋子，放入4°C冰箱過夜；
[0190] (10)500g，室溫離心lmin，使病毒液集中到管底；
[0191] (11)將所有相同的病毒濃縮液集中到一起，用0.22μπι-0.8μπι的PES濾器過濾;將病 毒分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進(jìn)行長(zhǎng)期保存；
[0192] 二、高速離心法純化重組慢病毒載體；
[0193] (1)將收集的上清液204ml使用0.22μπι-0.8μπι的PES濾器過濾；
[0194] (2)加入51ml 50%的PEG 6000溶液；
[0195] (3)加入21.711114]\1恥(：1溶液；
[0196] (4)加入23.3ml的PBS溶液，這時(shí)溶液總體積為300ml.PEG 6000的終濃度8.5%、 NaCl終濃度0.3M;
[0197] (5)將溶液分裝進(jìn)250ml廣口瓶中，每份150ml;
[0198] (6) 4°C放置1.5小時(shí)，每20-30分鐘混勻一次；
[0199] (7)4°C、7000g 離心 lOmin;
[0200] (8)離心后能看見管底有白色沉淀；
[0201] (9)小心棄去上清液，每瓶加入1.211115〇11^1^8-!1(：1(?!17.4)，劇烈搖晃重懸沉 淀；
[0202] (10)渦旋震蕩20-30秒進(jìn)一步重懸沉淀；
[0203] (11)將病毒分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進(jìn)行長(zhǎng)期保存；
[0204]三、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體(如圖7所示）；
[0205] (1)將收集的上清液使用Thermo真空栗，經(jīng)0 · 22μπι-0 · 8μπι的PES濾器抽濾，除去雜 質(zhì)；
[0206] (2)按1:1-1:10的比例往上清中加入1.51恥(：125〇11111^8-!1(：1化!16-8) ;
[0207] (3)將2個(gè)離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml 1Μ NaOH、4ml 1Μ NaCl、5ml 0.15Μ NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次過柱；
[0208] (4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動(dòng)栗以l-10ml/min的速度給離子交換柱上樣； [0209] (5)全部上清液過柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗 一遍；
[0210] (6)根據(jù)上樣量使用l-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)進(jìn)行洗脫，收集洗 脫液；
[0211] (7)將洗脫液分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進(jìn)行長(zhǎng)期保存；
[0212]四、滴度測(cè)定及比較；
[0213] (1)取24孔板接種293T細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5X104個(gè)，所加培養(yǎng)基體積為500ul，不同 種類的細(xì)胞生長(zhǎng)速度有所差異，進(jìn)行病毒感染時(shí)的細(xì)胞融合率為40 % -60 % ;
[0214] (2)準(zhǔn)備3個(gè)無(wú)菌EP管，在每個(gè)管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS)接種細(xì)胞24小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目， 記為N;
[0215] (3)取待測(cè)定的病毒原液10ul加入到第一個(gè)管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二 個(gè)管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS)，終體積為500ul;
[0216] ⑷感染開始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，更換為500μ1完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS)，5%C02繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；
[0217] (5)72小時(shí)后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相 應(yīng)減少，并拍照；
[0218] (6)用0.2ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在37°C放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整 個(gè)細(xì)胞面，離心收集細(xì)胞。按照DNeasy試劑盒的說(shuō)明抽提基因組DNA。每個(gè)樣品管中加入200 μL洗脫液洗下DNA并定量；
[0219] (7)準(zhǔn)備目的DNA檢測(cè)qPCRmix總管I(QPCR引物序列為SEQ ID Ν0.44-SEQ ID NO.45)：
[0221 ] n = number of reactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將 lml 2 XTaqMan Universal PCR Master Mix，4μ1 forward primer，4μ1 reverse primer，4μ1 probe和788μ1 H20混 和。震蕩后放在冰上；
[0222] (8)準(zhǔn)備內(nèi)參DNA檢測(cè)qPCRmix管 Π (QPCR引物序列為SEQ ID Ν0.46SEQ ID NO.47)：
[0223] 2XTaqMan Master Mix 25μ1 Xn
[0224] lOXRNaseP primer/probe mix 2.5μ1 Xn
[0225] H20 17·5μLΧη
[0226] n = number of reactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將 lml 2 XTaqMan Universal PCR Master Mix，100μ1 10 XRNaseP primer/probe mix和700μ1 H20混和。震蕩后放在冰 上；
[0227] (9)在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管I中各取45μ1加入到A-D各行 的孔中，從總管Π 中各取45μ1加入到E-G各行的孔中。
[0228] (10)分別取5μ1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個(gè)樣品重復(fù)1 次。另留1個(gè)孔加入5μ1的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-template control)。
[0229] (11)分別取5μ1基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個(gè)樣品重 復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μ1的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-template control)。
[0230] (12)所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50°C 2分 鐘，95°C 10分鐘，然后是95°C 15秒，60°C 1分鐘的40個(gè)循環(huán)。
[0231] 數(shù)據(jù)分析:測(cè)得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到 每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。
[0232] 滴度（integration units per ml，IU ml-1)的計(jì)算公式如下：
[0233] IU ml-l = (CXNXDX1000)/V
[0234] 其中：C =平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)
[0235] N=感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目（約為IX 105)
[0236] D =病毒載體的稀釋倍數(shù)
[0237] V =加入的稀釋病毒的體積數(shù)
[0238] (13)重組慢病毒載體 1vCAR20-CLA、1vCAR20-CLB、1vCAR20-0LC 的滴度結(jié)果（如圖 8 所示），離子交換色譜法的結(jié)果明顯優(yōu)于超速離心法和高速離心法；
[0239]五、內(nèi)毒素測(cè)定及比較；
[0240] (1)、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為15EU/支；
[0241] (2)、鱟試劑靈敏度λ = 〇 · 25EU/ml，0 · 5ml/管
[0242] (3)、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋:取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一支，分別用BET水按比例稀釋成4λ和2λ 的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min;稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s;
[0243] (4)、加樣:取鱟試劑若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分裝至若干支無(wú)內(nèi)毒素試 管中，每管0. lml。其中2支為陰性對(duì)照管，加入BET水0. lml;
[0244] 2支為陽(yáng)性對(duì)照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液〇. lml;
[0245] 2支為樣品陽(yáng)性對(duì)照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液(稀釋20倍的待 測(cè)樣品1πι1+4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液lml = 2ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋40倍樣品）。
[0246] 樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表4,37±1 °C水?。ɑ蚺囵B(yǎng)箱）保溫60 土 lmin；
[0247] (5)、重組慢病毒載體1vCAR20-CLA、1vCAR20-CLB、1vCAR20-0LC的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果 (如表4所示），超速離心法的內(nèi)毒素含量在20~40EU/ml之間，高速離心法的內(nèi)毒素含量在 20~40EU/ml之間，離子交換色譜法的內(nèi)毒素含量在1.25~2.5EU/ml之間明顯優(yōu)于超速離 心法和高速離心法；
[0249]表4重組慢病毒載體的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果 [0250]六、支原體測(cè)定及比較；
[0251] (1)在實(shí)驗(yàn)前三日，細(xì)胞樣品用無(wú)抗生素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0252] (2)收集lml細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞數(shù)大于1*105)，置于1.5ml離心管中；
[0253] (3) 13000 X g離心lmin，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；
[0254] (4)加入500ul PBS用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000Xg離心5min;
[0255] (5)步驟4重復(fù)一次；
[0256] (6)加入50μ1 Cell Lysis Buffer，用槍頭吹吸，充分混勻后，在55°C水浴中孵育 20min；
[0257] (7)將樣品置于95°C中加熱5min;
[0258] (8) 13000 X g離心5min后，取5μ1上清作為模板，25ylPCR反應(yīng)體系為：ddH20 6 · 5μ l、Myco Mix 1μ1、2χ Taq Plus Mix Master(Dye ?1118)12.541、模板541;卩0?循環(huán)條件為： 95°C 30sec，（95°C 30sec，56°C 30sec，72°C 30sec)*30cycle，72°C 5min。
[0259] (9)支原體檢測(cè)結(jié)果顯示（如圖9所示和表5所示），超速離心法、高速離心法、離子 交換色譜法純化的重組慢病毒載體均不含支原體。
[0261 ] 表5支原體檢測(cè)
[0262] 實(shí)施例3重組慢病毒載體lvCAR20-CLA、lvCAR20-CLB、lvCAR20-0LC的功能檢測(cè)
[0263] 一、CAR基因的細(xì)胞水平表達(dá)檢測(cè)：
[0264] (1)重組慢病毒載體 lvCAR20-CLA、lvCAR20-CLB、lvCAR20-0LC 感染 PBMC 細(xì)胞后，收 集細(xì)胞采用RT-PCR進(jìn)行CAR mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，驗(yàn)證CAR基因的表達(dá)，如果CAR mRNA轉(zhuǎn)錄 水平增高，則說(shuō)明CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)成功；
[0265] (2)重組慢病毒載體1￥〇六1?2〇-〇^、1￥〇41?2〇-〇^、1￥〇41?2〇-〇1^(：感染?81(：細(xì)胞后，收 集細(xì)胞采用western blot進(jìn)行CAR蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，驗(yàn)證CAR基因的表達(dá)，如果CAR蛋白 表達(dá)水平增高，則說(shuō)明CAR基因的翻譯水平表達(dá)成功；
[0266] (3)分別將 M0I = 15 的 1vCAR20-CLA、1vCAR20-CLB、1vCAR20-0LC 和對(duì)照病毒 MOCK 感 染細(xì)胞，48h后提取6孔板中細(xì)胞的總RNA和總蛋白分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí) 驗(yàn)。具體步驟:包被6孔板的四個(gè)孔，每個(gè)孔加入相應(yīng)的PBS和RN，4 °C過夜。12小時(shí)后按Μ0Ι = 15包被病毒，37°C培養(yǎng)箱放置5h;取出的6孔板，棄掉病毒上清，用PBS洗兩遍，按1*106/孔， 包被PBMC(用淋巴細(xì)胞分離液從人血中分離），加入500ul培養(yǎng)基(含10%血清、201]/111111^- 2、Polybrene 8ug/ml)。靜置20min，1000g 2CTC離心30min，37°C培養(yǎng)48h〇
[0267] (4)Tr iζο 1法提取6孔板中PBMC細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA，用QPCR引物(序列 為SEQ ID N0.46SEQ ID NO.49)進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系見表6,以內(nèi)參Actin為 對(duì)照組，驗(yàn)證其mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。
[0269] 表6 20μ1 qPCR反應(yīng)體系
[0270] (5)蛋白免疫印跡(Western B1 〇t)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將從PBMC中提取的總 蛋白質(zhì)按相對(duì)分子質(zhì)量分離。采用濕轉(zhuǎn)(4°C，400mA，120min)，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封 閉液（含5 %脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜lh，封閉液1:1000稀釋Biotinylated protein L，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4°C過夜。TBST洗膜3次，每次10min。封閉液1: 500稀釋相應(yīng)的SA-HRP，室溫下孵育PVDF膜2h，TBST洗膜3次，每次10min。采用Amersham公司 ECL+plusTM Western blotting system試劑盒進(jìn)行顯色。X光顯影獲得顯示條帶的膠片。 [0271] (6)RT-QPCR檢測(cè)顯示，重組慢病毒載體感染PBMC后的CAR的表達(dá)水平比對(duì)照病毒 MOCK和空細(xì)胞有明顯升高(如圖10所示和表7所示），說(shuō)明CAR基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)成功。
[0273] 表7 RT-QPCR檢測(cè)結(jié)果
[0274] (7)蛋白免疫印跡(Western Blot)的結(jié)果表明，CAR蛋白在重組慢病毒系統(tǒng)中表達(dá) (如圖11所示），說(shuō)明CAR基因的翻譯水平表達(dá)成功。
[0275] 二、細(xì)胞因子分泌及殺傷效果評(píng)估。
[0276] (1)分別培養(yǎng) CD20+K562 細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞 lvCAR20-CLA-PBMC、lvCAR20-CLB-PBMC、 lvCAR20-0LC-PBMC；
[0277] (2)收集靶細(xì)胞（CD20+K562)4xl05cells 和效應(yīng)細(xì)胞（CART 細(xì)胞）2.8xl06cells， 800g，6min離心，棄上清；
[0278] (3)用1ml lxPBS溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，800g，6min離心，棄上清；
[0279] (4)重復(fù)步驟3-次；
[0280] (5)用700ul培養(yǎng)基（1640培養(yǎng)基+10%FBS)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基（1640培養(yǎng) 基+10%FBS)重懸靶細(xì)胞；
[0281] (6)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實(shí)驗(yàn)孔，并設(shè)置對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔；
[0282] (7)250xg，5min 平板離心；
[0283] (8)37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；
[0284] (9)250xg，5min 平板離心；
[0285] (10)取每個(gè)孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液（避光操 作)；
[0286] (11)避光孵育25分鐘；
[0287] (12)每孔加入50ul終止液；
[0288] (13)酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm吸光度；
[0289] (14)將3個(gè)復(fù)孔取平均值;將所有實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔的吸光值減去培 養(yǎng)基背景吸光值的均值;將靶細(xì)胞最大值的吸光值減去體積校正對(duì)照吸光值的均值。
[0290] (15)將步驟14中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計(jì)算每個(gè)效靶比所產(chǎn)生的細(xì) 胞毒性百分比。結(jié)果如圖12所示，重組慢病毒載體lvCAR20-0LC轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細(xì)胞在不同效靶 比條件下殺傷效率明顯高于lvCAR20-CLA和lvCAR20-CLB轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細(xì)胞；
[0291] 殺傷效率=(實(shí)驗(yàn)孔-效應(yīng)細(xì)胞孔-靶細(xì)胞孔)/(靶細(xì)胞最大孔-靶細(xì)胞孔)X100%
[0292] (16)重復(fù)準(zhǔn)備一份步驟6的樣品用于qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果如圖13所 示，重組慢病毒載體lvCAR20-0LC轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細(xì)胞在不同效靶比條件下IL-2和IFN-γ的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于lvCAR20-CLA和lvCAR20-CLB轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBMC細(xì)胞；
[0293] 三、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道（CD20_specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and 4-1BB domains: pi lot clinical trial results . Brian G.Till,et al. Blood.2012；119(17):3940-3950.), CAR20載體針對(duì)B淋巴瘤有著良好的效果。
[0294] 本研究在www. cl ini cal trials .gov的注冊(cè)號(hào)是#NCT00621452。本研究中使用表達(dá) CAR20基因的T淋巴細(xì)胞用于治療復(fù)發(fā)難治的CD20+套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)和惰性B細(xì)胞淋巴瘤 的病人。CAR20-T淋巴細(xì)胞在體外對(duì)CD20+的細(xì)胞系與對(duì)照相比有明顯的殺傷作用（如圖14A 所示）；回輸病人后，隨著時(shí)間的增加，病人頸部的淋巴結(jié)明顯縮小;CT掃描顯示，CAR20-T 淋巴細(xì)胞回輸1個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月以后與回輸前相比，淋巴瘤腫塊明顯消退（如圖14B所 示）；腫瘤的體積在CAR20-T淋巴細(xì)胞回輸后隨時(shí)間增加有明顯的縮?。ㄈ鐖D14C所示）。過繼 性CAR20-T細(xì)胞療法在針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤的治療方面擁有良好的前景。
[0295] 實(shí)施例4第三代慢病毒骨架載體3rdLV-CAR20與第二代慢病毒骨架載體2ndLV- CAR20滴度比較。
[0296] 分別構(gòu)建3rdLV-CAR20和2ndLV-CAR20;質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝、病毒超速離心濃縮、 滴度測(cè)定過程參考實(shí)施例1;連續(xù)3個(gè)批次的滴度結(jié)果如圖15所示，第三代慢病毒骨架載體 3rdLV-CAR20的滴度要優(yōu)于第二代慢病毒骨架載體2ndLV-CAR20;因此，本專利選擇使用第 三代慢病毒骨架載體作為CAR基因的搭載骨架。
[0297] 實(shí)施例5第二代CAR慢病毒載體3rdLV-2ndCAR20與第三代CAR慢病毒載體3rdLV-3rd CAR20殺傷效率比較。
[0298] 分別構(gòu)建3rdLV-2ndCAR20和3rdLV-3rdCAR20;質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝、病毒超速離心 濃縮、滴度測(cè)定過程參考實(shí)施例1;殺傷實(shí)驗(yàn)參考實(shí)施例3 ;第二代CAR慢病毒載體3rdLV-2ndCAR20與第三代CAR慢病毒載體3rdLV-3rd CAR20殺傷效率結(jié)果比較如圖16所示，3rdLV-3rd CAR20針對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效率在不同效靶比條件下并未表現(xiàn)的比3rdLV-2ndCAR20更高 效;因此，本專利選擇使用第二代CAR設(shè)計(jì)的慢病毒載體作為臨床實(shí)驗(yàn)載體。
[0299] 以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗⑶20嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的⑶8 leader嵌合受體信號(hào)肽、CD20單鏈 抗體輕鏈VUOptimal Linker C、CD20單鏈抗體重鏈VH、CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如SEQ ID NO. 23所示的⑶137嵌合受體共刺激因子，以及 如SEQ ID NO.24所示的TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20嵌合抗原受體，其特征在于:所述嵌合抗原受體的氨基 酸序列如SEQ ID NO.50所示。3. -種抗⑶20嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)的⑶8 leader嵌合受體信號(hào)肽、CD20單鏈 抗體輕鏈VUOptimal Linker C、CD20單鏈抗體重鏈VH、CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、⑶28嵌合受體共刺激因子、CD137嵌合受體共刺激因子、以 及TCR嵌合受體T細(xì)胞激活域。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗CD20嵌合抗原受體，其特征在于:所述嵌合抗原受體的氨基 酸序列如SEQ ID NO.51所示。5. 編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗CD20嵌合抗原受體的基因。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.52或 SEQ ID NO .53所示。7. 含有權(quán)利要求5或6所述的基因的重組表達(dá)載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載 體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述的慢病毒表達(dá)載體包含權(quán)利 要求5所述的基因。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述的慢病毒表達(dá)載體包括：用 于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子PUC Ori序列；用于目的菌株大量擴(kuò)增的含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列；用于增強(qiáng)真核細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子SV40 Ori序列；用于慢病毒包裝的慢 病毒包裝順式元件；用于真核細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的ZsGreenl綠色熒光蛋白；用于共同轉(zhuǎn)錄 表達(dá)蛋白質(zhì)的IRES核糖體結(jié)合序列；用于嵌合抗原受體基因的真核轉(zhuǎn)錄的人EFla啟動(dòng)子； 用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體的編碼基因；用于 增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率的eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用 第二代慢病毒載體包括:慢病毒5 terminal LTR、慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件。12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用 第三代慢病毒載體包括:慢病毒5 terminal LTR、慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以 及RSV啟動(dòng)子。13. 根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述eWPRE增強(qiáng)型土 撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個(gè)核苷酸的增強(qiáng)突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、 g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。14. 一種如權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1)將含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列、原核復(fù)制子pUC Ori序列、病毒復(fù)制子SV40 Ori序列、用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件、ZsGreenl綠色熒光蛋白、IRES核糖體結(jié) 合序列、eWPRE增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件存儲(chǔ)于慢病毒骨架質(zhì)粒上； (2) 將人EFla啟動(dòng)子、用于組成集識(shí)別、傳遞、啟動(dòng)于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合 抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設(shè)計(jì)方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架 質(zhì)粒中，得到二代CAR或三代CAR設(shè)計(jì)的重組慢病毒質(zhì)粒； (3) 將得到的重組慢病毒質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋白質(zhì)粒 pEnv-G共同轉(zhuǎn)染HEK293T/17細(xì)胞，在HEK293T/17細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，包裝成功重 組慢病毒載體會(huì)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液； (4) 將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的離子交換方式進(jìn)行純化，分別得 到重組慢病毒載體。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)中，所述抽濾步驟控制上清 體積在200ml~2000ml，真空度控制在-0.5MPA~-0.9MPA，；所述吸附步驟控制溶液的PH值 在6~8;所述洗脫步驟控制洗脫液的離子強(qiáng)度在0.5M~1.0M。16. -種CAR-T細(xì)胞，所述的CAR-T細(xì)胞是由權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗⑶20嵌合抗原 受體修飾的T淋巴細(xì)胞。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的CAR-T細(xì)胞在制備淋巴瘤治療藥物中的應(yīng)用。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于，所述淋巴瘤治療藥物為套細(xì)胞淋巴瘤治 療藥物或?yàn)V泡型淋巴瘤治療藥物。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK105949317SQ201610224832
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月12日
【發(fā)明人】祁偉, 俞磊
【申請(qǐng)人】上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司