一種鰻鱺致病菌單鏈抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鰻鱺致病菌單鏈抗體及其應(yīng)用，其括如SEQ ID NO 01所示的氨基酸序列。本發(fā)明的鰻鱺致病菌單鏈抗體的抑制率高，能提高鰻鱺機體體液和細胞免疫水平，免疫保護作用明顯，大大降低了鰻鱺的死亡率，并能夠通過人工被動免疫用于治療魚類疾病或應(yīng)急預(yù)防。
【專利說明】
一種鰻鱺致病菌單鏈抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鰻麵致病菌單鏈抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)品年總量約占世界總量的70%。由于環(huán)境的污染及水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)本身的高密度、集約化生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害時有發(fā)生，每年造成近百億元的經(jīng)濟損 失，其中細菌性疾病造成的危害和損失尤為嚴重。福建省是漁業(yè)大省，近年來全省漁業(yè)經(jīng)濟 年總產(chǎn)值約1500億元，在全國占有重要地位，主要的養(yǎng)殖魚類大黃魚、鰻魚、鲆魚等名貴經(jīng) 濟魚類，但由細菌性疾病造成的損失也尤為嚴重。目前，化學(xué)藥物和抗生素是治療魚類細菌 性疾病常用且較為有效的方法，但具有很多弊端，如導(dǎo)致藥物和抗生素在水產(chǎn)品中的殘留， 病原生物耐藥性增強劑水域生態(tài)污染等。因此在尋求病害防治的其它途徑時，免疫防病技 術(shù)已引起了人們的高度重視，也是世界各國公認的優(yōu)先發(fā)展方向之一。
[0003] 目前，免疫防治方法主要使用免疫增強劑以及接種疫苗的方法來提高水產(chǎn)動物的 免疫力。其中魚類免疫增強劑主要通過增強非特異免疫應(yīng)答而發(fā)揮作用，如促進補體、溶菌 酶、凝集素、α-巨球蛋白、巨噬細胞活化因子和干擾素的合成，活化巨噬細胞、嗜中性粒細 胞、非特異性細胞毒性細胞的吞噬殺菌能力。接種疫苗能夠有效激發(fā)魚體特異性免疫應(yīng)答， 具有較好的免疫保護作用，是防治魚類傳染性疾病的有效措施，也是從根本上解決水產(chǎn)品 化學(xué)藥物殘留以及病原耐藥性的有效途徑之一。近年來，國內(nèi)外對魚類疫苗的究取得了較 大的進展。至2011年，針對二十多種不同的水產(chǎn)病原，一些國家和地區(qū)準發(fā)許可證的疫苗已 超過100種，在魚類病害的防治中發(fā)揮了極其重要的作用，大大減少了抗菌素等化學(xué)藥物在 養(yǎng)殖魚類方面的使用量。根據(jù)現(xiàn)有疫苗的獲得方法，用于免疫防治的魚類疫苗可大致分為 滅活疫苗、活疫苗和基因工程疫苗等。然而無論是免疫增強劑還是接種疫苗，均屬于人工主 動免疫，然而其過程時間較長，一般只適用于預(yù)防。而對于在養(yǎng)殖中爆發(fā)性的病害，以及對 那些免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的幼苗，人工主動免疫適應(yīng)性受到限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種鰻麵致病菌單鏈抗體。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述鰻麵致病菌單鏈抗體的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的原理如下：
[0007] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0008] 一種鰻麵致病菌單鏈抗體，包括如SEQ ID Ν0 01所示的氨基酸序列。
[0009] 一種編碼上述鰻麵致病菌單鏈抗體的基因序列，包括如SEQ ID N0 02所示的核苷 酸序列。
[0010] 一種表達上述鰻麵致病菌單鏈抗體的質(zhì)粒，為一負載包括SEQ ID N0 02所示的核 苷酸序列的原核表達載體。
[0011]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述原核表達載體為PGEX-4T-2。
[0012] -種表達上述暢麵致病菌單鏈抗體的大腸桿菌，該大腸桿菌轉(zhuǎn)化有上述原核表達 載體。
[0013] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該大腸桿菌為JM109。
[0014]進一步優(yōu)選的，所述原核表達載體為PGEX-4T-2。
[0015] 一種表達上述鰻麵致病菌單鏈抗體的質(zhì)粒，其特征在于:為一負載包括SEQ ID N0 02所示的核苷酸序列的真核表達載體。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述真核表達載體為PPIC9K。
[0017] -種表達上述暢麵致病菌單鏈抗體的畢赤酵母，該畢赤酵母轉(zhuǎn)化有上述真核表達 載體。
[0018] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該畢赤酵母為GS115。
[0019]進一步優(yōu)選的，所述真核表達載體為pPIC9K。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的鰻麵致病菌單鏈抗體的抑制率高，能提高鰻麵機 體體液和細胞免疫水平，免疫保護作用明顯，大大降低了鰻麵的死亡率，并能夠通過人工被 動免疫用于治療魚類疾病或應(yīng)急預(yù)防。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例1中IgH抗體基因、IgL抗體基因和scFv基因 PCR擴增產(chǎn)物的鑒 定結(jié)果圖。1-3: IgH基因 PCR擴增產(chǎn)物;4-6: IgL基因 PCR擴增產(chǎn)物;7-9: scFv基因 PCR擴增產(chǎn) 物。
[0022] 圖2為本發(fā)明實施例1中生物淘洗中噬菌體擴增圖。
[0023]圖3為本發(fā)明實施例1中特異性噬菌體抗體基因組電泳圖。Μ為Marker，1-10號為篩 選得到的抗體基因約750bp。
[0024]圖4為本發(fā)明實施例1中5號噬菌斑重鏈與輕鏈氨基酸序列比對圖。
[0025]圖5為本發(fā)明實施例2中單鏈抗體OMP-Scfv擴增結(jié)果圖。M:Marker;l:原核引物擴 增產(chǎn)物約750bp; 2:真核引物擴增產(chǎn)物約750bp。
[0026]圖6為本發(fā)明實施例2中目的基因的雙酶切結(jié)果圖。M:Marker;l:雙酶切原核表達 目的基因 〇MP-Scfv產(chǎn)物約750bp: 2:雙酶切原核表達載體pGEX-4T-2產(chǎn)物約4900bp: 3:雙酶 切真核表達目的基因 OMP-Scfv產(chǎn)物約750bp:4:雙酶切真核表達載體pPIC9K產(chǎn)物約為 9300bp〇
[0027]圖7為本發(fā)明實施例2中重組質(zhì)粒電泳檢測結(jié)果圖。M:Marker; 1-1~9:重組質(zhì)粒 pGEX-4T-2-0MP-Scf v 克隆子約 750bp: 2-1 ~9:重組質(zhì)粒 pPIC9K-0MP-Scf v 克隆子約 750bp。 [0028] 圖8為本發(fā)明實施例2中重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-0MP-Scf v蛋白表達檢測圖。Μ:蛋白 Marker; 1: pGEX-4T-2空載體誘導(dǎo)表達;2:重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-0MP-Scf ν誘導(dǎo)表達。
[0029]圖9為本發(fā)明實施例2中真核誘導(dǎo)表達第三天產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果圖。M:Marker; 1:空白對照，3-2~12為不同酵母陽性克隆子誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，其中目的蛋白約27KD。
[0030] 圖10為本發(fā)明實施例2中酵母誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的Western Blot檢測分析M:Marker; 1:空白對照;3-2~9為第三天時2至9號酵母陽性克隆子誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，目的蛋白約27KD。 [0031]圖11為本發(fā)明實施例3中淋巴細胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)檢測結(jié)果圖。*表示與對照組相比 有顯著性差異，**表示極顯著差異;#表示與0ΜΡ組之間有顯著性差異，邱表示極顯著差異。
[0032]圖12為本發(fā)明實施例3中血清溶菌酶水平檢測結(jié)果圖。*表示與對照組相比有顯著 性差異，**表示極顯著差異;#表示與0ΜΡ組之間有顯著性差異，邱表示極顯著差異。
[0033]圖13為本發(fā)明實施例3中血清抗體水平檢測結(jié)果圖。*表示與對照組相比有顯著性 差異，**表示極顯著差異;#表示與0ΜΡ組之間有顯著性差異，邱表示極顯著差異。
[0034]圖14為本發(fā)明實施例3中鰻麵免疫保護率的測定結(jié)果圖。
[0035]圖15為本發(fā)明實施例3中淋巴細胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)檢測結(jié)果圖。*表示與對照組相比 有顯著性差異，**表示極顯著差異。
[0036]圖16為本發(fā)明實施例3中血清溶菌酶水平檢測結(jié)果圖。*表示與對照組相比有顯著 性差異，**表示極顯著差異。
[0037]圖17為本發(fā)明實施例3中血清抗體水平檢測結(jié)果圖。*表示與對照組相比有顯著性 差異，**表示極顯著差異
[0038]圖18本發(fā)明實施例3中鰻麵免疫保護率的測定結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0039]以下通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明和描述。
[0040]實施例1鰻麵免疫球蛋白單鏈T7噬菌體抗體庫的構(gòu)建及抗重組外膜蛋白特性抗體 的篩選及檢測
[0041 ] 利用RT-PCR和RACE等分子克隆方法對編碼鰻麵IgH和IgL的CDNA分別進行克隆與 分析，并根據(jù)其重鏈、輕鏈可變區(qū)基因序列，擴增VH和VL抗體基因庫，利用SOE PCR方法經(jīng)重 疊延伸反應(yīng)將重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因拼接成單鏈抗體(ScFv)基因庫，進而與T7 噬菌體載體連接，構(gòu)建鰻麵T7噬菌體抗體庫。利用已經(jīng)構(gòu)建的T7-Scfv噬菌體抗體庫對具有 免疫交叉保護的嗜水氣單胞菌重組外膜蛋白單鏈抗體進行篩選?？贵w庫經(jīng)4輪淘洗后，得到 的10株抗體噬菌斑，對噬菌斑進行ELISA阻斷實驗，從而得知抗體活性分別為68.2 %、 71·7%、77·7%、77·5%、81·7%、78·4%、77·7%、72·6%、72·8%、68·4%。對獲取的10 株有 活性的抗體噬菌斑提取基因組后進行PCR和測序分析，最終選取抗體活性較高、同源性較好 的特異性抗體基因命名為OMP-Scfv。
[0042] 1.噬菌體抗體庫的構(gòu)建
[0043] 1.1歐洲鰻麵脾臟總RNA的提取及cDNA的合成
[0044] 提取歐洲鰻麵脾臟總RNA:
[0045] 稱取100mg歐洲鰻麵脾臟組織，用液氮研磨成粉末狀，加到含有l(wèi)mL Trizol的無核 酸酶離心管中；充分混勻后，于室溫靜置5min;4°C，12000g離心10min;吸出粉紅色上清液于 另一離心管中，然后加200yL氯仿，振蕩混勻后，室溫靜置2-311^11;4°(：，1200(^離心151^11;取 上清（無色水相層）于一新的離心管中，加500yL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，4°C， 12000g離心10min;棄上清，離心管底部及管壁上成凝膠狀的沉淀用lmL 75%乙醇洗滌，4 °C，7，500g離心5min;棄上清，沉淀于室溫下晾干，加入75yL DEPC處理水溶解沉淀；用1 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用紫外分光光度計檢測RNA溶液的濃度和純度。
[0046] cDNA模板制備：
[0047] 在0 · 5mL的PCR管中，加入3yg總RNA，lyL oligo(dT)，加無 RNase水至5yL，混合均 勻。70°C下，2min。冰上放置2min。往管中加入如下反應(yīng)體系：2yL 5XRT buffer，lyL dNTP mix(lOmM)，lyL DTT(20mM)，lyL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/yL)。混合均勻。42°C，90min。將cDNA 第一條鏈溶解于無菌雙蒸水中，72°C，7min，然后-20°C保存。
[0048] 1.2歐洲鰻麵重鏈輕鏈可變區(qū)的PCR擴增：
[0049] 設(shè)計并合成鰻麵重鏈可變區(qū)基因的簡并引物(5 '端引物:5 ' CCGGAATTCTGTTGAACTC ACACAGCCAGGCTCTAT 3'（SEQ ID N0 08);3'端引物：51〇01^60^0^01^01^60^01；0^ CCWGWRGWNACNGTGACTTTGGTCCCCT 3'（SEQ ID NO 09))和輕鏈可變區(qū)簡并引物（5'端引物： 5'TCGGGCGGTGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCAGATGTAGTTTTGACCCAGTCTCCGT 3'（SEQ ID N0 1〇);3'端引物：5'CCCAAGCTTTCCAACTGACAGTTTTGTGCCG 3'（SEQ ID NO 11))。以cDNA為模 板，分別擴增IgH抗體基因和IgL抗體基因。在25yL反應(yīng)體系中，加入以下PCR反應(yīng)組分(表 1) 〇
[0050] 表1PCR分組反應(yīng)
[0052]混合均勻后，在熱循環(huán)儀上按照下列程序進行PCR反應(yīng)：
[0053] IgH反應(yīng)條件為:①94Γ變性4min;
[0054] ② 4 個循環(huán):94°C 變性 30s，70°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin;
[0055] ③ 4 個循環(huán)：94 °C 變性 30s，68 °C 退火 30s，72 °C 延伸 lmin;
[0056] ④ 30 個循環(huán) 94°C 變性 30s，65°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin;
[0057] ⑤ 72Γ 延伸 lOmin;
[0058] ⑥ 4°C10min 停止。
[0059] IgL反應(yīng)條件為:①94°C預(yù)變性2min;
[0060] ② 38 個循環(huán)：94 Γ 變性 30s，50 · 3 Γ 退火 30s，72 Γ 延伸 lmin;
[0061] ③ 72Γ 延伸 lOmin;
[0062] ④ 4°C10min 停止。
[0063] PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，使用膠回收試劑盒對特異擴增條 帶進行純化。
[0064] 1.3歐洲鰻麵重鏈輕鏈ScFv單鏈抗體基因庫的構(gòu)建
[0065]在25yL反應(yīng)體系中，取提純的IgH抗體基因 52ng IgL抗體基因 50ng作為模板（已知 IgH抗體基因片段長度406bp，IgL抗體基因片段長度390bp)，含H20，2yL dNTP，0.4yL Ps酶， 5yL 5 X Ps-Hs Buf f er，總體積為25yL，混勻后進入拼接循環(huán)。使IgH和IgL基因通過編碼連 接肽(Gly4 Se r)3連接。
[0066] 反應(yīng)條件為:①94°C預(yù)變性2min;
[0067] ② 7 個循環(huán):94°C 變性 30s，62°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin;
[0068] ③ 72Γ 延伸 lOmin;
[0069] ④ 4°C5min 停止
[0070]在上述反應(yīng)體系中，補加 IgH 5'端引物和Igl^端引物各lyL，再次PCR擴增。
[0071] 反應(yīng)條件為:①94°C預(yù)變性2min;
[0072]② 38 個循環(huán)：94 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 lmin;
[0073] ③ 72Γ 延伸 lOmin;
[0074] ④ 4°C10min 停止
[0075] 使用膠回收試劑盒，對SOE PCR擴增的scFv基因庫進行膠純化回收。
[0076] 1.4歐洲鰻麵T7噬菌體抗體庫的構(gòu)建
[0077] ScFv基因庫EcoRI和Hind III雙酶切
[0078] 在40μ1反應(yīng)體系中，用30units EcoRI和Hind III對ScFv基因進行雙酶切，使用膠 回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，重溶于?〇μ1水中。
[0079] 重組子 T7selectl〇-3b/ScFv 的連接
[0080] 將EcoRI和Hindm雙酶切的ScFv基因與EcoRI和Hindm雙酶切的T7Selectl〇-3噬 菌體載體的2個臂按1:4的摩爾數(shù)比混合，T4DNA連接酶16 °C連接4h。
[0081] T7噬菌體抗體庫的體外包裝
[0082] 連接反應(yīng)產(chǎn)物5yL與T7噬菌體包裝提取物25yL混合，室溫包裝2h，加入270yL LB液 體培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，建立T7噬菌體原始抗體庫，取少量噬菌體稀釋，鋪板測定包裝效率。隨 機選取10個噬斑，接種于宿主菌BLT5403，增殖后提取DNA，加 VH 5'端引物和VL 3'端引物， PCR擴增scFv基因，計算scFv基因插入率。將宿主菌BLT5403接種于3mL含Amp的M9TB液體培 養(yǎng)基中，37°C 180r/min搖床培養(yǎng)，至0D值約為0.8，接種包裝產(chǎn)物，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)生溶菌，加 入5mol/L NaCl并10000g離心10min去雜質(zhì)，加入50%PEG 8000并10000g離心10min沉淀噬 菌體，LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，取少量噬菌體稀釋，鋪板測定抗體庫的滴度。
[0083] 2.噬菌體抗體庫的篩選
[0084]將純化后的外膜蛋白0ΜΡ作為抗原，對其進行包被。對抗原0ΜΡ用碳酸鹽包被液稀 釋至50μg/ml，取100μ1加入酶標板空，37°C孵育lh后4°C包被18-24h，即對抗原包被完成。第 二天對包被產(chǎn)物進行生物淘洗，步驟如下：
[0085] 1)棄孔中溶液，每孔加入250μ1 PBS-T洗板3次，2min/次，將酶標板倒扣于干凈吸 水紙以吸干液體；
[0086] 2)每孔加入200μ1封閉液（1 %BSA，PBS配制），37°C靜置lh，棄孔中溶液后重復(fù)步驟 1；
[0087] 3)加入10μ1鰻麵T7-Scfv文庫噬菌體液和90μ1 TBS-T，混勻后室溫靜置50min;
[0088] 4)棄孔中溶液后，用PBS-T洗板5次，2min/次；
[0089] 5)將T7 Elution Buffer每孔200μ1 加入孔中，常溫反應(yīng)20min;
[0090] 6)將孔中溶液取出移入1.5ml離心管，向管中加入15μ1 Kc 1飽和溶液，混勻平衡 8000rpm離心3min，取上清(T7_Scfv·菌體液）；
[0091 ] 7)取30μ1上清液和剩余上清分別進行噬菌體擴增(方法參加 3.1.2.1);
[0092] 8)培養(yǎng)結(jié)束后向培養(yǎng)皿中加入Τ7 Extraction Buffer，使其剛剛覆蓋噬菌體表 層，約3ml/皿，4°C浸提過夜；
[0093] 9)回收浸提液，每管加入1/5體積的氯仿，混勻平衡后，離心，上清液即為淘洗陽性 克隆種子，加入甘油(使其終濃度為8 %的），-80 °C保存。
[0094] 10)重復(fù)上述淘洗過程3-5次，直至步驟7中的噬菌斑個數(shù)為個位數(shù)。此時將噬菌斑 單個分離在離心管中。將篩選得到的特異性噬菌體抗體命名為T7-0MP。
[0095] 3.特異性噬菌體抗體活性檢測
[0096] 通過ELISA阻斷實驗檢測免疫球蛋白單鏈抗體噬菌體庫T7-0MP的抗體活性。具體 操作步驟如下：
[0097] 1)將0ΜΡ作為抗原進行包被，封閉及洗滌步驟同上；
[0098] 2)實驗孔中加入T7-0MP噬菌體(阻斷)稀釋液，陰性對照孔和空白對照孔中加入等 量培養(yǎng)基，37°C作用lh;
[0099] 3)棄孔中溶液，每孔加入250μ1 PBS-T洗板3次，2min/次，將酶標板倒扣于干凈吸 水紙以吸干液體；
[0100] 4)向試驗孔和空白對照孔中加入100μΙ 1:1000稀釋的兔抗IgM血清，陰性對照孔 中加入未經(jīng)免疫的兔血清，37°C作用lh。重復(fù)(3);
[0101] 5)每孔加入山羊抗免（l:6000)IgG 100μ1，37Γ作用lh。重復(fù)(3);
[0102] 6)將oro底物溶液每孔100μΙ加入其中，顯色8min;
[0103] 7)將50μ1終止液加入孔中，混勻。立即用酶標儀測定A45Q值。
[0104] 8)抑制率按下列公式計算出：抑制率（％ ) = [ 1_(試驗孔A45Q-陰性對照A45Q)/(對照 孔A·-陰性對照Α·) ]χ100%。
[0105] 4.特異性噬菌體抗體編碼基因序列克隆與分析
[0106] 將淘洗得到的具有抗體活性的噬菌斑進行分離后，取10μ1噬菌體轉(zhuǎn)移至含100μΙ 10mM EDTA(pH8.0)的1.5ml離心管中，用槍頭上下吹打使其散開，置于漩渦震蕩儀上混勻， 65°C水浴裂解10min，將離心管平衡后，室溫14000rpm高速離心3min，用移液槍吸取上清，即 為噬菌體DNA，命名為OMP-Scfv。
[0107]參照PGEX-4T-2作為表達型載體多酶切位點序列，設(shè)計帶有酶切位點的單鏈抗體 Scfv的PCR擴增上下游引物如下：
[0108] F1(SEQ ID NO 03:5'GGAATTCCCGTTGAACTCACACAGCCAGGCTCTAT3'），
[0109] R1(SEQ ID NO 04：
[0110] 5，CGATGCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCCAACTGACAGTTTTGTGCCG3，）以O(shè)MP-Scfv基 因片段為擴增模板，以FI、R1為擴增引物，進行PCR，PCR反應(yīng)程序如下：94°C 4min; (94°C 30s，58°C 30s，72°C lmin)30個循環(huán)；72°C 10min，4°C 5min。通過 1%瓊脂糖凝膠電泳對 PCR產(chǎn)物進行檢測，拍照后用Promega膠回收試劑盒對目的條帶進行回收。將電泳檢測符合 目的條帶大小的PCR產(chǎn)物送到上海生工進行測序，將返回的序列進行序列分析。
[0111] 5.結(jié)果與討論
[0112] 5.1 IgH抗體基因、IgL抗體基因及scFv基因 PCR擴增產(chǎn)物的鑒定
[0113]以cDNA第一鏈為模板，擴增IgH抗體基因和IgL抗體基因，兩者分子大小約為400 bp，與理論估計值大小一致。scFv基因，分子大小約為700 bp，與理論估計值大小一致(如圖 1所示）。
[0114] 5.2鰻麵噬菌體抗體庫生物淘洗結(jié)果
[0115] 以嗜水氣單胞菌外膜蛋白0ΜΡ(氨基酸序列如SEQ ID N0 05所示)作為抗原，對T7-Scfv噬菌體抗體庫進行篩選，圖2為淘洗中噬菌體擴增圖，通過淘洗，篩選的特異性T7-Scfv 抗體噬菌斑不斷減少，最后挑取10株噬菌斑進行免疫活性分析。
[0116] 5.3鰻麵特異性噬菌體抗體活性檢測
[0117] 對10株篩選的特異性噬菌體抗體T7-Scfv通過ELISA阻斷實驗進行抗體活性檢測， 用酶標儀測A450值，陽性對照孔A450為0.544，陰性對照孔吸光值A(chǔ)450為0.095，1-10號十株 特異性噬菌體抗體 A450 值分別為 0·238、0·222、0·195、0·196、0·177、0·192、0·195、0·218、 0.217、0.237。通過公式:抑制率（％ ) = [ 1-(試驗孔Α450-陰性對照Α450)/(對照孔Α450-陰 性對照Α450) ]xlOO%，分別計算10株特異性噬菌體抗體的抑制率，分別為:68.2%、71.7%、 77·7%、77·5%、81·7%、78·4%、77·7%、72·6%、72·8%、68·4%。
[0118] 5.4特異性噬菌體抗體基因克隆及其序列分析
[0119] 使用噬菌體基因組提取試劑盒將淘洗得到的10株特異性噬菌體抗體的基因組進 行提取，通過PCR檢測與1%凝膠電泳得到如圖3的結(jié)果，目的條帶T7-Scfv的大小約約 750bp，圖中目的條帶大小盡管出現(xiàn)差異，但條帶都在750bp上下，將圖中750bp上下的目的 條帶進行回收后，與T載體連接，送上海生工生物有限公司進行測序。將10株篩選得到的抗 體基因進行測序，其中1號、3號、5號、6號和9號抗體能夠測出序列并能正確翻譯成氨基酸， 其他5株不能正常翻譯，其中5號與重鏈和輕鏈的同源性分別為76%和85% (圖4)命名為 OMP-Scfv〇
[0120] 實施例2特異性抗外膜蛋白單鏈抗體的原核表達及真核表達
[0121] 將篩選得到的特異性抗體基因 OMP-Scfv作為克隆模板，對其進行原核表達和真核 表達。選取PGEX-4T-2作為原核表達載體，根據(jù)目的基因和表達載體質(zhì)粒圖譜選取EC0RI與 Ν0ΤΙ為酶切位點，引物設(shè)計時在3'端目的基因與酶切位點之間加入HIS標簽，以備后續(xù)的純 化實驗，組建重組載體PGEX-4T-2-0MP后將測序爭取的菌體使用IPTG作為誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo) 表達，將以包涵體存在的表達蛋白使用離心型Ni親和層析柱進行純化，使用梯度濃度的尿 素-PBS溶液進行復(fù)性后凍干備用。構(gòu)建單鏈抗體pPIC9K酵母表達質(zhì)粒，通過線性化后電擊 轉(zhuǎn)入酵母細胞，使用終濃度為0.5 %的甲醇進行誘導(dǎo)表達。
[0122] 1 .OMP-Scfv單鏈抗體基因的原核表達
[0123] 根據(jù)實施例1篩選獲得的特異性抗體OMP-Scfv基因序列，以pGEX-4T-2為表達載 體，構(gòu)建pGEX-4T-2-Scf v表達載體，在大腸桿菌進行原核表達與及純化，獲得的重組蛋白-20 °C冰箱保存。
[0124] 2.單鏈抗體基因真核表達載體的構(gòu)建
[0125] 實驗選取穿梭質(zhì)粒pPIC9K作為真核表達載體，根據(jù)實施例1獲得的OMP-Scfv序列 及PPIC9K質(zhì)粒圖譜，選取EC0R I與NOT I作為酶切位點，設(shè)計上、下游引物為F2(SEQ ID N0 06)與R2(SEQ ID NO 07)。
[0126] F2(5 ' GTAGAATTCAAAAGAGTTGAACTCACACAGCCAGGCTCTAT3 '）
[0127] R2(5 ' ATTCGCGGCCGCATGGTGATGGTGATGATGTCCAACTGACAGTTTTGTGCCG3 '）
[0128] 對單鏈抗體OMP-Scfv進行PCR擴增，與T載體的鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，與真核 表達載體PPIC9K進行鏈接，再將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109進行菌落PCR和測序，將測序正確的 菌株擴大培養(yǎng)后使用試劑盒提取重組載體pPIC9K-0MP-Scfv的質(zhì)粒備用。
[0129] 3.重組質(zhì)粒pPIC9K-0MP_Scfv的電轉(zhuǎn)化及檢測
[0130]使用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取pPIC9K空載體質(zhì)粒及重組載體
[0131] pPIC9K-0MP-Scfv的質(zhì)粒，測濃度后，采用SacI快切酶分別對pPIC9K質(zhì)粒和 pPIC9K-0MP-Scfv質(zhì)粒進行線性化單酶切。pPIC9K質(zhì)粒反應(yīng)體系(40μ1)如下:4μ1 lOXFast Buffer;2yl Sac Ι;24μ1 DNA(樣品含量為10yg);10yl無菌水。混勻后于PCR儀中進行擴增， 擴增條件為:37°C 40min;80°C 20min;20°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后進行1%瓊脂糖電泳檢測，將 線性化了的條帶進行膠回收，測濃度后_20°C保存。
[0132] 制備畢赤酵母GS115的感受態(tài)細胞，具體步驟如下：
[0133] 1)取出實驗室保重的畢赤酵母GS115冰上溶解，使用滅菌接種環(huán)將融化的GS115劃 線于YH)固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)箱中29 °C過夜培養(yǎng)；
[0134] 2)將準備好的裝Yro液體培養(yǎng)基的管中加入單菌落，29 °C 230rpm搖床過夜培養(yǎng)；
[0135] 3)次日，按1:100比例對GS115菌液繼續(xù)培養(yǎng)，直至0D_達到1.0-1.3;
[0136] 4)將培養(yǎng)液平衡后，4°C 5000rpm高速離心5min，倒掉上清液；
[0137] 5)適量無菌水重懸細胞后，重復(fù)步驟4兩次；
[0138] 6)將1M山梨醇從向沉淀中加入20ml預(yù)冷的，重懸細胞后相同條件離心，棄上清；
[0139] 7)加入200μ1預(yù)冷的1M山梨醇重懸細胞，冰上備用。
[0140] 取20ul線性化的pPIC9K質(zhì)粒和pPIC9K-0MP-Scfv質(zhì)粒分別加入80ul GS115感受態(tài) 細胞中，輕輕混勻，移入〇 . 2ml 4°C的預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，冰上靜置5min，擦干表邊水后，放入ΒΙ0-RAD電轉(zhuǎn)儀，選取畢赤酵母轉(zhuǎn)化(參數(shù)為：1.5kV，5.8ms)，電擊結(jié)束立即加入從4°C冰箱取出 的1M的山梨醇0.5ml，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，30°C靜置lh，將溶液分200μ1和400μ 1全部涂布于MD平板。30°C，培養(yǎng)2-3d，直至菌體長出。
[0141] 酵母基因組提取試劑盒購自捷瑞，提取重組質(zhì)粒pPIC9K-0MP-Scfv基因組，操作步 驟如下：
[0142] 1)取酵母菌液3ml于離心機上室溫8000rpm高速離心lmin，倒掉上清；
[0143] 2)每管加0.2ml Lysis Y bufTer，5yl Lyticase，混勾后30°C靜置30min，8000rpm 離心5min，棄上清；
[0144] 3)每管加200μ1 TE溶液將沉淀混勾，依次加入Digestion Solution 300μ1混勾， RNase Α 4μ1 吹打混勾，55°C靜置lOmin后加入4μ1 Proteinase K，55°C靜置 15min;
[0145] 4)每管依次加入0.3ml Ext和0.3ml PB,充分混勾后12000rpm離心5min，此時溶液 分層，DNA存在于底層溶液，用藍槍頭將底層溶液轉(zhuǎn)移至安放好的GenClean中；
[0146] 5)平衡后，8000rpm離心lmin，棄廢液；
[0147] 6)每管加入Wash Solution 0.5ml，室溫8000rpm高速離心lmin，棄溶液；
[0148] 7)重復(fù)步驟6-次；
[0149] 8)將其置于離心機中室溫12000rpm高速離心lmin，將Wash Solution徹底除去；
[0150] 9)將GenClean安置于無菌1 ·5ml離心管中，加入Elution Buffer(60°C水浴預(yù)熱） 5(^1，37°(：放置211^11;
[0151] 10)12000rpm離心lmin，此時重組質(zhì)粒pPIC9K-0MP-Scfv的基因組DNA已在離心管 中，測濃度后標記保存于-20 °C冰箱。
[0152] 以F1、R1為引物，以提取的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為模板，通過PCR反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)化效果。PCR產(chǎn)物 通過1%瓊脂糖電泳進行檢測。
[0153] 4.畢赤酵母的表達及檢測
[0154] 挑取pPIC9K單菌落和重組質(zhì)粒pPIC9K-0MP-Scfv單菌落分別接種于BMGY培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)箱中28°C 230rpm擴大培養(yǎng)，直至0D6Q()為2.0-6.0;菌液平衡后，2000g離心5min，棄 上清;將等量BMMY溶液重懸菌體，28°C 230rpm誘導(dǎo)表達96h;每24h取去2ml菌液，同時補加 終濃度為1 %的甲醇。
[0155] 使用上海生工的TCA沉淀試劑盒對蛋白樣品進行濃縮，操作步驟如下：
[0156] 1)將菌液2000g離心5min，取上清，即為蛋白質(zhì)溶液；
[0157] 2)取100μ 1蛋白質(zhì)溶液，加入試劑一300μ 1，震蕩混勻，4 °C冰箱靜置15min;
[0158] 3)加入沉淀試劑二300μ 1，充分混勻后，4 °C冰箱靜置15min;
[0159] 4)平衡后4°C15000rpm高速離心5min，此時底部形成蛋白質(zhì)沉淀塊；
[0160] 5)離心結(jié)束后立即用槍頭去除上清，并將離心管倒扣于濾紙上去除上清；
[0161] 6)加入200μ1 PBS溶液溶解沉淀，標記保存。
[0162] 首先將待測樣品按照2.1.2.10中SDS-PAGE的方法進行檢測，使用銀染的方法對蛋 白膠進行染色，銀染操作步驟如下：
[0163] 1)將蛋白膠出去后置于50ml固定液中，置于振蕩器上2h;
[0164] 2)棄固定液后加入50ml 35%的乙醇，振蕩器上漂洗3次，每次20min，棄溶液；
[0165] 3)將蛋白膠置于50ml敏化液中2.5min進行敏華，棄溶液；
[0166] 4)加入50ml雙蒸水進行漂洗，每次5min，振蕩器上進行；
[0167] 5)加入50ml銀染色，振蕩器上銀染20min;
[0168] 6)銀染結(jié)束后用雙蒸水漂洗兩次，每次10s;
[0169] 7)將蛋白膠置于50ml顯色液中，約3min后顯色清楚；
[0170] 8)棄顯色液后加入50ml終止液，振蕩器上終止15min;
[0171] 9)終止結(jié)束后將蛋白膠置于50ml雙蒸水中漂洗，每次5分鐘，振蕩器上進行；
[0172] 10)拍照保存。
[0173] 將表達產(chǎn)物進行Western Blot檢測，具體步驟如下：
[0174] 1)使用欲染Marker進行SDS-PAGE蛋白電泳；
[0175] 2)將濾紙折疊后，剪取與蛋白膠相同大小的干凈濾紙8張，剪取同樣大小的PVDF膜 一張（PVDF膜用鑷子夾，不能與手接觸），將PVDF膜于甲醇中2min，電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡 5min；
[0176] 3)將濾紙、PVDF膜與蛋白膠以"三明治"結(jié)構(gòu)進行排列，置于BIO-RAD電轉(zhuǎn)印儀中， 從下至上依次為:4層濾紙、PVDF膜、蛋白膠、4層濾紙，將濾紙用電轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，且中間 不能有氣泡產(chǎn)生；
[0177] 4)設(shè)置參數(shù)(2.5厶，25￥，1〇11^11)，進行轉(zhuǎn)染；
[0178] 5)取出PVDF膜，此時膜上清晰出現(xiàn)Marker條帶，將PVDF膜置于BSA封閉液中，37 °C 震蕩lh;
[0179] 6)加入PBST洗滌3次，每次5分鐘，振蕩器上進行；
[0180] 7)加入一抗稀釋液，37 °C震蕩lh，重復(fù)步驟6;
[0181] 8)加入羊抗兔稀釋液，37 °C震蕩lh，PBST振蕩洗滌5次，每次5分鐘；
[0182] 9)每10ml DAB溶液中加入10μ1 30%的H2〇2,混勻后加入PVDF膜中，當抗原區(qū)呈現(xiàn) 明顯的褐色時終止反應(yīng)，加入雙蒸水進行洗滌，拍照。
[0183] 5.結(jié)果與討論
[0184] 5.1單鏈抗體基因 OMP-Scfv的擴增
[0185]將分析得出的特異性抗體OMP-Scfv分別使用以pGEX-4T-2為表達載體的原核擴增 引物F1、R1與以pPIC9K為表達載體的真核擴增引物F2、R2對其進行擴增，擴增產(chǎn)物的條帶如 圖5所示。
[0186] 5.2重組載體的構(gòu)建
[0187] 將目的基因 OMP-Scfv與原核表達載體pGEX-4T-2通過EC0RI與Ν0ΤΙ快切酶同時進 行雙酶切，將目的基因 OMP-Scfv與真核表達載體pPIC9K通過EC0RI與Ν0ΤΙ快切酶同時進行 雙酶切，酶切電泳結(jié)果如圖6所示：目的基因 OMP-Scfv的條帶大小約為750bp，原核表達載體 PGEX-4T-2的條帶大小約為4900bp，真核表達載體pPIC9K的條帶大小約為9300bp。將相應(yīng)的 目的條帶割膠回收后進行連接。
[0188] 將重組質(zhì)粒樣品進行測序，由測序結(jié)果可知重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-0MP_Scfv與重組 質(zhì)粒pPIC9K-0MP-Scfv的序列重合，目的片段長均為735bp(如SEQ ID N0 02所示），編碼245 個氨基酸（如SEQ ID N0 01所示），預(yù)測目的蛋白分子量為25KD，等電點為8.57。由于載體 PGEX-4T-2中包含GST標簽，其分子量為26KD，設(shè)計引物時為便于純化在下游引物處加入六 個hi s，計算得出重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-0MP-Scf v的蛋白分子量約為53KD。
[0189] 將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-0MP-Scfv與pPIC9K-0MP-Scfv轉(zhuǎn)化進入表達菌 株E. col i BL21，通過1 %凝膠電泳檢測得到如圖7。目的條帶都在750bp附近，與理論值相 符。
[0190] 5.3單鏈抗體基因 OMP-Scfv的原核表達
[0191] 將重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-0MP-Scfv轉(zhuǎn)化進入表達菌株BL21后，將電泳檢測條帶大小 正確的菌株進行誘導(dǎo)表達，使用終濃度為ImM的IPTG對重組質(zhì)粒誘導(dǎo)5小時后，進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果分析表明在53KD左右有明顯的蛋白條帶，與預(yù)測蛋白分子量大小一致， 即蛋白成功表達(圖8)。
[0192] 5 · 4單鏈抗體基因 OMP-Scfv的真核表達
[0193] 將重組質(zhì)粒點擊轉(zhuǎn)化進入畢赤酵母后，用終濃度為0.5%的甲醇進行誘導(dǎo)表達，分 別對第三天的誘導(dǎo)產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在27KD處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期 分子量相符(如圖9所示）。經(jīng)Western Blot檢測表明27KD的蛋白條帶為新增誘導(dǎo)表達的單 鏈抗體基因 OMP-Scfv表達產(chǎn)物(如圖10所示）。
[0194] 實施例3注射單鏈抗體和重組外膜蛋白對鰻麵免疫保護作用
[0195] 1.材料與方法
[0196] 1.1實驗動物
[0197] 將購買的1000尾歐洲暢麵(Angui 1 la angui 1 la)，體重50g左右，分為6組，每組150 尾并養(yǎng)殖于水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖試驗場，其中100尾用于檢測攻毒后免疫保護效果，其余用于各項 免疫指標水平測定，水溫23-28°C，保持氧氣充足，每天按時喂養(yǎng)和清除排泄物，暫養(yǎng)1周。
[0198] 1.2菌株培養(yǎng)
[0199] 將實驗室保種的嗜水氣單胞菌（B11，表達重組外模蛋白0ΜΡ，其氨基酸序列如 SEQID N0 05所示)接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA)胰蛋白胨大豆肉湯（TSB)，28°C過夜培 養(yǎng);次日，挑取單菌落加入到TSB胰蛋白胨大豆肉湯中，28°C230rpm繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)結(jié)束后將 培養(yǎng)液4°C 5000rpm高速離心5min，倒掉上清；用0.01M的roS(pH = 7.4)以同樣條件洗滌2 次，菌體溶解于PBS中；調(diào)節(jié)溶液使其0D595nm=0.5，此時菌落數(shù)為5.0 X 108cfu/ml;將菌液 中加入終濃度為0.4 %的甲醛溶液(滅火菌體），混勻，4 °C靜置24h;將滅火菌體取少量涂布 于TSA平板，28 °C培養(yǎng)24h-48h，無菌落生長時即為滅活菌液;將滅火菌液同樣條件用PBS洗3 次，重新調(diào)節(jié)0D，使菌落數(shù)為5.0 X 108cfu/ml，，此時為Bl 1滅活菌液，4°C保存?zhèn)溆茫ú豢砷L 時間放置）。
[0200] 1.3鰻麵免疫注射
[0201]將已凍干的大腸桿菌表達純化的單鏈抗體Scfv蛋白樣品粉末溶解于0.01M的roS (pH= 7.4)溶液中，使蛋白終濃度為2mg/ml;將酵母菌表達的Scfv蛋白樣品經(jīng)50%的飽和硫 酸銨沉淀后，0.01M的PBS(pH=7.4)透析后使蛋白終濃度為2mg/ml;將已凍干的純化蛋白樣 品0ΜΡ粉末溶解于0.01M的roS(pH = 7.4)溶液中，使蛋白終濃度為2mg/ml;另取0.01M的PBS (pH = 7.4)和B11滅活菌液分別作為陰性對照和陽性對照。鰻麵免疫注射前24h停止投喂食 物，注射前加入適量丁香酚麻醉魚體，注射時使用lml注射器，每尾鰻麵注射樣品0.2ml，注 射結(jié)束后立即將鰻麵放入養(yǎng)殖池。
[0202] 1.4免疫指標測定
[0203] 1.4.1血細胞和血清的采集
[0204] 鰻麵免疫注射后，外膜蛋白注射組和B11滅活組分別在免疫后的14d、21d、28d、42d 時丁香酚麻醉后采樣，而酵母菌重組表達的單鏈抗體和大腸桿菌表達的單鏈抗體分別在免 疫后的第7d采樣，每組分別采集8尾鰻麵樣品，采集的樣品包血細胞和血清。采用斷尾取血， 滴一滴鰻麵血入裝有〇.5ml RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、5μ1肝素鈉和1滴鰻麵血的1.5ml離心管 消毒后帶入細胞培養(yǎng)房進行處理。離心管平衡后4°C 3000rpm高速離心10min，倒掉上清;加 入0.5ml細胞培養(yǎng)液RPMI 1640相同條件潤洗2遍后棄上清，從底部血細胞中吸取7μ1入裝有 250μ1 RPMI 1640細胞培養(yǎng)液的1.5ml離心管中，標記保存于4°C冰箱備用。剩余的鰻麵血液 滴入1.5ml無菌離心管中，室溫傾斜放置3h后，4°C過夜靜置。將4°C靜置過夜的血液輕輕取 出后，4°C lOOOOrpm高速離心5min，用移液槍吸取綠色上清入新的1.5ml無菌離心管中，標 記保存于_80°C冰箱。
[0205] 1.4.1血清溶菌酶活性測定
[0206]使用南京建成公司的溶菌酶檢測試劑盒檢測血清、粘液、肝臟和腎臟中溶菌酶含 量，檢測方法按照本課題組郭松林老師改良后的方法進行，改良后的檢測方法適用于大批 量檢測。具體操作方法如下：首先，將應(yīng)用菌液、標準品應(yīng)用液和待測樣品32°C水浴10min; 之后，將標準品應(yīng)用液和待測樣品（各兩個平行)加入酶標板中，每孔加入?〇μ1;最后，設(shè)置 酶標儀程序，準備測量30s和4m30s時530nm處的吸光值，用排槍加入100μΙ應(yīng)用菌液后立即 測量30s和4m30s時0D530nm值。根據(jù)公式計算溶菌酶濃度，計算公式為:樣品溶菌酶濃度(U/ m 1)=(樣品孔0D4m30 s -樣品孔0D30 s)八標準品應(yīng)用液孔0D4m30 s -標準品應(yīng)用液孔 0D30s) X標準品應(yīng)用液濃度(200U/ml)。
[0207] 1.4.1血清抗體水平測定
[0208]使用間接ELISA法對血清的抗體效價進行測定，步驟如下：
[0209]測定roS對照組和B11滅活免疫組中血清效價時，將嗜水氣單胞菌B11用包被稀釋 液稀釋為1. 〇 X l〇8cfu/ml，100μΙ/孔加入酶標板，45°C過夜包被，直至菌液干燥;測定外膜 蛋白0ΜΡ組血清效價時，將0ΜΡ蛋白粉末用包被稀釋液稀釋為100μg/ml，100μΙ/孔加入酶標 板，30°Clh后，4°C過夜包被；
[0210]空白對照孔加入100μΙ包被稀釋液進行包被；
[0211] 加入PBST洗板3次，每次洗板5min，每孔加入200μ1;
[0212] 將封閉液（1 % BSA/PBST)每孔200μ1加入板中，37 °C培養(yǎng)箱靜置2h，將溶液倒掉后， 重復(fù)步驟②；
[0213] 一抗:使用PBS將待測鰻麵血清2-5-2-11倍比稀釋，每個樣品兩個平行，100μΙ/孔， 空白對照和陰性對照均加入包被液，30°C孵育lh后，重復(fù)步驟②；
[0214] 二抗:將實驗室保存的兔抗鰻麵IgM(l:2000)取出后，用roS進行稀釋，每孔100μΙ 加入到空白對照和陰性對照和待測樣品中，30°C孵育lh后，重復(fù)步驟②；
[0215] 三抗:將購買的羊抗兔酶標抗體（1:8000)取出后，用PBS進行稀釋，每孔加入100μ 1，PBST洗板4次，5min/次；
[0216] 顯色：每孔加入50μ1 0PD底物溶液（臨用前加入30%的H202)，顯色7-10min(陰性 對照孔變?yōu)榈S色時終止顯色）；
[0217] 終止:每孔加入2M的濃H2S04 50μ1終止顯色；
[0218] 終止后立即在酶標儀上檢測0D49 2nm值，通過公示（樣品0D49 2nm-空白對照 0D492nm) / (陰性對照0D492nm-空白對照0D492nm)得出的最大比值（比值彡2時有效)所對應(yīng) 的稀釋倍數(shù)即為抗體效價。酵母表達抗體以及大腸桿菌表達抗體水平測定是以50倍鰻麵免 疫血清進行包被，其他方法同上。
[0219] 1.4.1血細胞淋巴轉(zhuǎn)化水平測定
[0220] 取2.58ml RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，加入0.3ml含滅活補體的鰻麵血清，使其含量為 10 %，加入終濃度為20μg/ml的ConA，每孔50μ1加到細胞培養(yǎng)板中。同時，取2.7ml RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，加入0.3ml含滅活補體的鰻麵血清，使其含量為10 %。細胞培養(yǎng)板每孔加 入50μ1。之后，在加入兩種培養(yǎng)基的空中分別加入50μ1血細胞，每個樣品兩個重復(fù)，合計每 孔100μΙ。將細胞培養(yǎng)板封閉后置于25°C培養(yǎng)48h，之后，每孔加入5mg/ml的ΜΤΤ 15μ1，將細 胞培養(yǎng)板封閉后置于25°C生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后將細胞培養(yǎng)板平衡后 lOOOrpm離心10min，超凈工作臺上用滅菌紙巾吸干上清后(不要吸出沉淀），每孔加入200μ1 DMS0，用槍頭充分混勻后(顆粒完全溶解且無氣泡產(chǎn)生），酶標儀上測定0D570nm值。據(jù)公式 計SI值=(某一樣品加 ConA后0D570nm平均值/同一樣品不加 ConA 0D570nm平均值)-1技算 樣品全血細胞刺激指數(shù)(SI)值。
[0221] 1.4.1免疫保護率的測定
[0222] 從冰箱取出-80°C冰箱保存的嗜水氣單胞菌劃線后，挑取單菌落擴大培養(yǎng)后4°C 5000rpm離心5min，棄上清，用PBS以相同條件洗滌兩次后，將菌體溶解在PBS中，調(diào)節(jié)溶液濃 度使0D595nm=0.4即使菌落數(shù)為4X10 8cfu/ml。外膜蛋白注射組和B11滅活組在免疫28d后 進行嗜水氣單胞菌B11活菌攻毒，而酵母和大腸桿菌表達的單鏈抗體分別在免疫7d后進行 嗜水氣單胞菌B11活菌攻毒。攻毒后分缸飼養(yǎng)，每天正常投喂及洗污，記錄攻毒后14d內(nèi)的鰻 麵死亡情況，根據(jù)公式(相對免疫保護率=(1_免疫組死亡率/空白組死亡率）X 100%)得出 相應(yīng)的免疫保護率。
[0223] 2.結(jié)果與討論
[0224] 2.1原核表達重組蛋白0ΜΡ的免疫指標檢測
[0225] 2.1.1淋巴細胞轉(zhuǎn)化水平檢測
[0226] 0ΜΡ組細胞刺激指數(shù)在免疫后不斷上升，在21d時達到峰值。0ΜΡ組的刺激指數(shù)在 14d時顯著（P<0.05)高于B11組和PBS組，OMP組細胞刺激指數(shù)在14d、21d和42d顯著（P< 0.05)高于滅活組。除28d外，B11組與PBS組無顯著差異(P>0.05)(如圖11所示），表明0MP和 B11滅活菌體均能提升鰻麵細胞免疫應(yīng)答水平。
[0227] 2.1.2血清溶菌酶水平檢測
[0228] 0ΜΡ組和B11菌注射組血清溶菌酶活性均在21d時顯著升高并達到峰值，與對照組 有極顯著差異(Ρ<〇.〇1)。而且B11菌注射組在28d和42d的血清溶菌酶活性均高于對照組和 0ΜΡ組(P<0.01)(圖12)，表明0ΜΡ和Bl 1滅活菌體均能提升鰻麵非特異性免疫應(yīng)答水平。
[0229] 2.1.3血清抗體水平檢測
[0230] 0ΜΡ組在免疫注射后表達水平持續(xù)上升，于28d達到峰值，42d也有較高的表達水 平，與對照組相比均有顯著性差異。B11菌注射后在14d、21d、28d以及42d均與對照組有顯著 差異(圖13)，表明0ΜΡ和B11滅活菌體均能誘導(dǎo)鰻麵產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。
[0231 ] 2.2原核表達重組蛋白0ΜΡ的免疫保護率測定
[0232] 嗜水氣單胞菌B11攻毒后，PBS組、B11組和0ΜΡ組的存活率分別為11%、44%和 67 %，0ΜΡ組的免疫保護率為62.5 %，Bl 1的免疫保護率為37.5 %，表明重組蛋白具有較好的 免疫原性，具有較好的免疫保護作用（圖14)。
[0233] 2.3單鏈抗體基因原核表達和真核表達產(chǎn)物的免疫指標檢測
[0234] 2.3.1淋巴細胞轉(zhuǎn)化水平檢測
[0235] 鰻麵免疫后第7d后，與對照組相比原核單鏈抗體和酵母單鏈抗體的血細胞刺激指 數(shù)均高于對照組水平，并且酵母單鏈抗體組要極顯著高于對照組(Ρ<〇.〇1)(圖15)，表明單 鏈抗體均能誘導(dǎo)鰻麵血淋巴細胞的增殖與分化，提升細胞免疫水平。
[0236] 2.3.2血清溶菌酶水平檢測
[0237] 鰻麵免疫后第7d后，與對照組相比原核單鏈抗體和酵母單鏈抗體的溶菌酶活性均 高于對照組水平，并且酵母單鏈抗體組要極顯著高于對照組(P<〇.01)(圖16)，表明單鏈抗 體均能提升鰻麵非特異性免疫應(yīng)答水平。
[0238] 2.3.3血清抗體水平檢測
[0239] 鰻麵免疫后第7d后，與對照組相比原核單鏈抗體和酵母單鏈抗體的抗體水平有所 升高，但未到達顯著差異水平(P>〇. 05)(圖17)，表明單鏈抗體能提升鰻麵特異性免疫應(yīng)答 水平。
[0240] 2.4單鏈抗體基因原核表達和真核表達產(chǎn)物的免疫保護率測定
[0241] 嗜水氣單胞菌B11攻毒后，PBS組、原核單鏈抗體和酵母單鏈抗體的存活率分別為 21 %、32 %和57 %，原核單鏈抗體的免疫保護率為13.9 %，酵母單鏈抗體的免疫保護率為 45.5% (圖18)，結(jié)果表明酵母單鏈抗體具有一定的免疫保護作用，而原核單鏈抗體的免疫 保護作用不大。
[0242] 小結(jié)：
[0243] 酵母表達的單鏈抗體、原核表達的單鏈抗體以及重組表達的外膜蛋白均能提高鰻 麵機體體液和細胞免疫水平，其中酵母單鏈抗體和重組外膜蛋白注射后對鰻麵保護作用比 較明顯，免疫保護率為分別為45.5%和62.5%，而原核表達的單鏈抗體免疫保護作用較小。
[0244] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即 依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種鰻麵致病菌單鏈抗體，其特征在于:包括如SEQ ID NO Ol所示的氨基酸序列。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的鰻麵致病菌單鏈抗體的基因序列，其特征在于：包括如 SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列。3. -種表達權(quán)利要求1所述的鰻麵致病菌單鏈抗體的質(zhì)粒，其特征在于:為一負載包括 SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列的原核表達載體。4. 一種表達權(quán)利要求1所述的鰻麵致病菌單鏈抗體的大腸桿菌，其特征在于:該大腸桿 菌轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求3所述的原核表達載體。5. 如權(quán)利要求4所述的大腸桿菌，其特征在于:所述原核表達載體為pGEX-4T-2。6. -種表達權(quán)利要求1所述的暢麵致病菌單鏈抗體的質(zhì)粒，其特征在于:為一負載包括 SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列的真核表達載體。7. 如權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒，其特征在于:所述真核表達載體為pPIC9K。8. -種表達權(quán)利要求1所述的暢麵致病菌單鏈抗體的畢赤酵母，其特征在于:該畢赤酵 母轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求8所述的真核表達載體。9. 如權(quán)利要求8所述的畢赤酵母，其特征在于:該畢赤酵母為GSl 15。10. 如權(quán)利要求8或9所述的大腸桿菌，其特征在于:所述真核表達載體為pPIC9K。
【文檔編號】C12N1/19GK105949308SQ201610329793
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】馮建軍, 林鵬, 王藝磊, 郭松林, 賈圓圓
【申請人】集美大學(xué)