單鏈抗體及其相關(guān)成套抗腫瘤試劑與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中單鏈抗體及其相關(guān)成套抗腫瘤試劑與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤的細胞免疫治療傾向于使自體效應(yīng)細胞能夠重新祀向腫瘤細胞，由于T 淋己細胞在抗原特異性細胞免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用及它們具有記憶能力，從而使其成為研 究的熱點。人一旦患上惡性疾病，就說明其自身免疫系統(tǒng)已經(jīng)不能夠針對腫瘤細胞進行及 時而有效的殺滅，但是研究表明，機體的免疫系統(tǒng)也不是毫無作為，例如T淋己細胞在許多 腫瘤組織中有浸潤運種現(xiàn)象就是一個明證，但是遺憾的是它們常常不能對惡性瘤細胞發(fā)動 攻擊，雖然對惡性腫瘤缺乏免疫監(jiān)控的原因目前仍不甚清楚，但是一般認為是由于大多數(shù)T 淋己細胞識別的抗原是沒有變異的分化抗原，一般來講，腫瘤細胞本身為免疫反應(yīng)提供的 祀位很少。綜合目前的研究成果，腫瘤的出現(xiàn)可W從腫瘤與免疫系統(tǒng)之間相互作用的分析 中得出W下幾種原因，簡單地說，有瘤細胞積極的免疫逃逸機制，如腫瘤細胞的免疫原性弱 及抗原調(diào)變，腫瘤細胞表面缺乏MHCI類分子，使CTL不能識別腫瘤細胞表面的抗原，W致瘤 細胞得W逃脫宿主的免疫攻擊；持續(xù)的但是無效的免疫反應(yīng)，如腫瘤細胞表面的抗原被封 閉，特異性抗體被腫瘤的游離抗原中和，腫瘤抗原變異；惡性瘤細胞的免疫忽略，如腫瘤抗 原作用于處于不同階段的特異性淋己細胞，可W使幼稚的淋己細胞接觸腫瘤抗原后誘發(fā)免 疫耐受。由于W上運些復(fù)雜的原因?qū)е铝四[瘤的出現(xiàn)，所W-個有效的抗癌免疫治療必須 克服上述障礙W便有效地激活T淋己細胞去祀向攻擊瘤細胞。到目前為止，大部分免疫治 療方法都是設(shè)計將效應(yīng)細胞如CTLs直接祀向腫瘤細胞。然而誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)，抗體 和效應(yīng)細胞必須從循環(huán)中滲出浸潤到腫瘤部位才能殺傷腫瘤細胞，但因為腫瘤內(nèi)的高間質(zhì) 壓，使得浸潤到腫瘤部位的抗體分子和效應(yīng)細胞非常少。腫瘤血管是惡性腫瘤生長及轉(zhuǎn)移 的基礎(chǔ)，W腫瘤血管為治療祀點，抑制腫瘤血管的形成或破壞已經(jīng)形成的腫瘤血管，可W阻 斷腫瘤細胞的營養(yǎng)來源和遷移路徑，因此抗腫瘤血管治療成為腫瘤治療的重要策略之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何治療腫瘤。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了成套抗腫瘤試劑。 陽0化]本發(fā)明所提供的成套抗腫瘤試劑，為下述M或N:
[0006] M、包括單鏈抗體和效應(yīng)細胞的成套抗腫瘤試劑；
[0007] 所述單鏈抗體其名稱為SCAB,由下述甲、乙、丙和下的蛋白質(zhì)連接而成：
[0008] 甲、序列表中SEQIDNo. 1的第37-161位氨基酸所示的蛋白質(zhì)；
[0009] 乙、序列表中SEQIDNo. 1的第177-289位氨基酸所示的蛋白質(zhì)；
[0010] 丙、序列表中SEQIDNo. 1的第305-424位氨基酸所示的蛋白質(zhì)；
[0011] 下、序列表中SEQIDNo. 1的第440-546位氨基酸所示的蛋白質(zhì)；
[0012] 所述效應(yīng)細胞為T淋己細胞或PMBC;
[0013] N、包括與所述單鏈抗體相關(guān)的生物材料和所述效應(yīng)細胞的成套抗腫瘤試劑；
[0014] 與所述SCAB相關(guān)的生物材料，為B1)至B。）中的任一種：
[0015] B1)編碼所述SCAB的核酸分子；
[0016] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0017] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0018] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0019] B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；
[0020] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0021] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0022] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0023] B9)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0024] B10)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0025] B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細胞系；
[0026] B12)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動物細胞系。
[0027] 為了使所述SCAB便于純化，可在序列表中SEQIDNo. 1的第37-546位氨基酸所 示的蛋白質(zhì)的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標簽。
[00測表l、t不簽的序列
[0029]
[0030] 所述SCAB可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。所述SCAB 的編碼基因可通過將SEQIDNo. 2或SEQIDNo. 2的第109-1641位核巧酸所示的DM序 列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/ 或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。 陽03U 上述成套抗腫瘤試劑中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DM或重組 DNA;所述核酸分子也可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0032] 上述成套抗腫瘤試劑中，B2)所述的含有編碼所述SCAB的核酸分子的表達盒 (SCAB基因表達盒），是指能夠在宿主細胞中表達SCAB的DNA，該DNA不但可包括啟動SCAB 基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止SCAB基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括 增強子序列。
[0033] 可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有所述SCAB基因表達盒的重組載體。
[0034] 上述成套抗腫瘤試劑中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。
[0035] 上述成套抗腫瘤試劑中，所述重組載體可為將B1)所述核酸分子導(dǎo)入到 pET28a(+)中得到的重組載體。在本發(fā)明的一個實施例中，B3)所述重組載體為將所述 SCAB的編碼基因（核巧酸序列為序列表中SEQIDNo. 2的第109-1641位核巧酸）導(dǎo)入 pET28a(+)中得到的重組載體祀T28a-SCAB，重組載體祀T28a-SCAB表達沈QIDNo. 1所示 的SCAB。
[0036] 上述成套抗腫瘤試劑中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如大腸桿菌。
[0037] 上述成套抗腫瘤試劑中，所述轉(zhuǎn)基因動物細胞系、所述轉(zhuǎn)基因動物組織和所述轉(zhuǎn) 基因動物器官均不包括繁殖材料；所述重組微生物可為將B1)所述核酸分子導(dǎo)入到大腸桿 菌化21 0E3)中得到的重組微生物。
[0038] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的B1)所述SCAB的核巧酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā) 明的B1)所述SCAB的核巧酸序列75%或75%W上同一性的核巧酸，只要編碼所述SCAB且 具有SCAB活性，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0039] 運里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的SEQIDNo. 2的第109-1638位核巧酸序列或SEQIDNo. 2的核巧酸序列具有75% 或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用 肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分 比（％ )表示，其可W用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0040] 上述75%或75%W上同一性，可為75%、80%、85%、90%或95%^上的同一性。
[0041] 上述成套抗腫瘤試劑中，所述SCAB為下述a)或b):
[0042] a)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo. 1的第37-546位氨基酸的抗體；
[0043] b)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo. 1的抗體。
[0044] 其中，SEQIDNo. 1的第5-10位氨基酸為His-tag的氨基酸序列；SEQIDNo. 1的 第37-161位氨基酸為所述甲的氨基酸序列，SEQIDNo. 1的第177-289位氨基酸為所述乙 的氨基酸序列，SEQIDNo. 1的第305-424位氨基酸為所述丙的氨基酸序列，SEQIDNo. 1 的第440-546位氨基酸為所述下的氨基酸序列，SEQIDNo. 1的第162-176位氨基酸、第 290-304位氨基酸和第425-439位氨基酸均為連接膚的氨基酸序列。
[0045] 上述成套抗腫瘤試劑中，編碼所述甲的核巧酸序列為序列表中SEQIDNo. 2的第 109-483位核巧酸；
[0046] 編碼所述乙的核巧酸序列為序列表中SEQIDNo. 2的第529-867位核巧酸；
[0047] 編碼所述丙的核巧酸序列為序列表中SEQIDNo. 2的第913-1272位氨基酸； W48] 編碼所述下的核巧酸序列為序列表中SEQIDNo. 2的第1318-1638位核巧酸。
[0049] 上述成套抗腫瘤試劑中，B1)所述核酸分子為下述1)或2)或3)或4):
[0050] 1)核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0051] 2)核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 2的第109-1638位核巧酸的cDNA分子或 DNA分子；
[0052] 3)與1)或2)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且編碼所述SCAB 的cDNA分子或基因組DM分子；
[0053] 4)在嚴格條件下與1)或2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼所述SCAB的cDNA分 子或基因組DNA分子。
[0054] 其中，SEQIDNo. 2由1647個核巧酸組成，SEQIDNo. 2的第1-1641位核巧酸編 碼沈QIDNo. 1所示的單鏈抗體SCAB。
[0055] 運里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的SEQIDNo. 2的第109-1638位核巧酸序列或SEQIDNo. 2的核巧酸序列具有75% 或更高，或85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用 肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分 比（％ )表示，其可W用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0056]