一種抗英夫利西抗體elisa檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。包括英夫利西抗體包被的ELISA板、HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗F(ab’)2段的IgG抗體、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、H2SO4和輔助試劑組成；所述的英夫利西抗體包被的ELISA板是通過(guò)以下方法制備的：用TNF?α包被ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體，使英夫利西單克隆抗體與TNF?α結(jié)合固定于ELISA板上作為固定抗原，由此得到英夫利西抗體包被的ELISA板。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，普通實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展，測(cè)量結(jié)果靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠廣泛應(yīng)用臨床。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種抗英夫利西抗體EL ISA檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 英夫利西單克隆抗體（inf liximab，IFX)是由75%人源性]^611〇輕鏈的恒定區(qū)和 25%鼠源性的多變區(qū)組成的嵌合型單克隆抗體，能夠特異性結(jié)合游離和膜連的腫瘤壞死因 子α(TNF-α)，進(jìn)而阻斷TNF-α激活的NF-κΒ促炎通路，促發(fā)過(guò)度活化的淋巴細(xì)胞凋亡，最終抑 制免疫紊亂引起的組織損傷，是目前廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕性疾病和炎癥性腸病的生物制劑 藥物（Koji Sono，Cytokine 59,2012;Matteo Bosani，Biologics:Targets&Therapy 2009; Gert Van 4%(*6,6此，2012)。其中尤其對(duì)于炎癥性腸病的治療，相比傳統(tǒng)藥物如5-氨基水 楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑(硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤)等，IFX能夠迅速誘導(dǎo)并長(zhǎng)期維持黏 膜愈合，而后者對(duì)于延長(zhǎng)炎癥性腸病的無(wú)激素緩解期、減少并發(fā)癥、減少住院率及手術(shù)率， 最終延緩疾病的自然病程發(fā)展具有重要意義（2012ECC0)<JFX能夠發(fā)揮促進(jìn)腸道粘膜愈合 的效應(yīng)主要取決于藥物進(jìn)入患者體內(nèi)后達(dá)到并維持足夠的治療窗濃度，目前研究表明IBD 患者維持病情緩解需要IFX濃度維持在3-7yg/mL(Niels Vande Casteele Gastroenterology 2015)，當(dāng)IBD患者IFX測(cè)定濃度低于3yg/mL，采用加大IFX劑量輸注或縮 短給藥間隔的用藥方案調(diào)整能夠顯著提升患者的粘膜愈合率，反之，若患者IFX測(cè)定濃度高 于7yg/mL，適當(dāng)減量能夠在不影響患者的粘膜愈合率前提下節(jié)約患者花費(fèi)。因此，準(zhǔn)確評(píng)估 英夫利西的體內(nèi)濃度對(duì)于患者獲得更佳療效及臨床醫(yī)生治療決策具有極其重要的意義。
[0003] 英夫利西作為不屬于人體自身的蛋白，其具有一定的免疫原性，即能刺激體內(nèi)的 免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)英夫利西的抗體(anti-infliximab antibody，ATI)和致敏T淋巴細(xì)胞的 特異性免疫反應(yīng)。ATI能夠結(jié)合英夫利西加快其清除，導(dǎo)致體內(nèi)IFX濃度不足和療效不佳，同 時(shí)增加輸液反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(M· Svenson，Rheumatology，2007)。因此測(cè)定血清IFX和ATI濃 度對(duì)于臨床醫(yī)生及早發(fā)現(xiàn)可能發(fā)生IFX失應(yīng)答的患者，明確IFX失應(yīng)答的可能原因，以及指 導(dǎo)臨床治療策略調(diào)整使患者持續(xù)維持病情緩解具有相當(dāng)重要價(jià)值(Ben-Horin S，Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology，2014)〇
[0004] 目前測(cè)量血清ATI濃度的方法較多，傳統(tǒng)方法為雙抗原夾心法（double-antigen (DA)enzyme-1 inked immunosorbent assay(ELISA))和放射免疫檢測(cè)法（Ainsworth MA,Am J Gastroenterol.2008;Wolbink GJ,Arthritis Rheum.2006)，，雙抗原夾心法將IFX同時(shí) 作為捕獲ATI的抗原以及檢測(cè)ATI的抗體，存在相當(dāng)?shù)募夹g(shù)限制，如單價(jià)的IgG4型ATI只有1 個(gè)抗原決定簇，只能結(jié)合于包被的IFX，而作為檢測(cè)抗體的IFX則無(wú)法與之結(jié)合，而約36 %的 ATI就會(huì)因?qū)儆贗gG4(M. Svenson，Rheumatology ,2007)而發(fā)生漏診；另一方面，體內(nèi)類(lèi)風(fēng)濕 因子能夠針對(duì)IgG FC片段上抗原表位結(jié)合，因而也能結(jié)合于包被抗原IFX導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假 陽(yáng)性(Ben-Horin S，Gut，2010)。此外，血清中的IFX可與作為檢測(cè)抗體的IFX競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 ATI，妨礙血清ATI的檢測(cè)（Colombel JF，N Engl J Med.2010;Seow CH，Gut.2010)。另一種 測(cè)量ATI濃度的方法是放射免疫檢測(cè)法（Ainsworth MA,Am J Gastroenterol .2008; Wolbink GJ,Arthritis Rheum.2006),由于使用了放射性原料，該方法需經(jīng)過(guò)福射防護(hù)專(zhuān) 業(yè)培訓(xùn)的人員及特殊設(shè)備方能開(kāi)展，臨床上難以廣泛普及使用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可避免血清中IFX對(duì)ATI檢測(cè)的干擾，準(zhǔn)確性大大提高， 同時(shí)操作方便，靈敏度高，特異性強(qiáng)的抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
[0006] 當(dāng)前ATI的ELISA檢測(cè)技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題在于尋找能夠高度特異結(jié)合ATI且容易制備的 檢測(cè)抗體，基于上述背景以及人體抗體結(jié)構(gòu)特征：即抗體分子是由2條較長(zhǎng)、相對(duì)分子量較 大的相同的重鏈和2條較短、相對(duì)分子質(zhì)量較小的相同的輕鏈經(jīng)二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形 成一個(gè)由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子，輕鏈有Kappa (κ)鏈和lambda (λ)鏈兩種同種型，正常 人類(lèi)血清中κ:λ的比例為2:l(Lam CW，Clin Biochem 1991)，IFX的輕鏈全部是由κ鏈組成 的，無(wú) λ鏈，而ATI的輕鏈主要是由λ鏈組成(M · Svenson，Rheumatology，2007)，因此本發(fā)明人 開(kāi)展了 anti-XELISA法間接檢測(cè)血清ATI的濃度，該法使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗λ 鏈抗體作為檢測(cè)抗體，可避免血清中IFX對(duì)ATI檢測(cè)的干擾，準(zhǔn)確性大大提高，同時(shí)新方法操 作簡(jiǎn)便，普通實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展，測(cè)量結(jié)果靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠廣泛應(yīng)用臨床，從而實(shí)現(xiàn) 了本發(fā)明的目的。
[0007] 本發(fā)明的抗英夫利西抗體(ATI)的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] 首先用TNF-α包被ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體（IFX)，使英夫利西單克 隆抗體（IFX)與TNF-a結(jié)合固定于ELISA板上作為固定抗原，將ELISA板上固定有英夫利西單 克隆抗體的孔分成待測(cè)樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔；
[0009] 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔中加入含B S A的P B S溶液，然后再加入倍比稀釋的已知濃度的抗F (ab'）2段的IgG抗體(Ben-Horin 3,6此，2010)，而后加入底物了1?，在冊(cè)？的催化下變?yōu)樗{(lán) 色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測(cè)定其吸光度值，通過(guò)已知濃度的抗F(ab'） 2段的IgG抗 體的吸光度值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0010] 在待測(cè)樣本孔處加入待測(cè)血清，使血清中的ATI與IFX結(jié)合從而固定下來(lái)，然后再 加入HRP標(biāo)記的針對(duì)ATI的抗λ鏈的IgG抗體，該抗體僅與ATI結(jié)合，不與IFX結(jié)合，而后加入底 物TMB，在HRP的催化下變?yōu)樗{(lán)色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測(cè)定其吸光度值，根據(jù)待 測(cè)血清的吸光度值與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出血清中ATI的濃度。
[0011] 所述的含BSA的PBS溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液。
[0012]所述的測(cè)定吸光度值是在酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度值。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括 抗英夫利西抗體包被的ELI SA板、HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗F(ab '）2段的IgG 抗體、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、H2S〇4和輔助試劑組成；
[0014] 所述的抗英夫利西抗體包被的ELISA板是通過(guò)以下方法制備的：用TNF-α包被 ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體（IFX)，使英夫利西單克隆抗體（IFX)與TNF-a結(jié)合 固定于ELISA板上作為固定抗體，由此得到抗英夫利西抗體包被的ELISA板。
[0015] 所述的輔助試劑包括PH9.6的碳酸氫鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的ros溶液、質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0.1 % BSA的PBS溶液、體積分?jǐn)?shù)0.05 % PBST溶液和蒸餾水。
[0016] 所述的PH9.6的碳酸氫鹽緩沖液每升是這樣配制的：將Na2C〇3 1.59g和NaHC〇3 2.93g加入1L的蒸餾水中，調(diào)pH達(dá)到9.6，得到碳酸氫鹽緩沖液；
[0017] 所述的用TNF-α包被ELISA板是用含500ng/ml TNF-α的碳酸氫鹽緩沖液包被ELISA 板。
[0018] 所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的ros溶液是在PH7.4的PBS溶液（磷酸鹽緩沖液）中加入 BSA使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液；
[0019]所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 1 % BSA的PBS溶液是在pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入BSA，使 其濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液。
[0020] 所述的體積分?jǐn)?shù)0.05 % TOST溶液是指含體積分?jǐn)?shù)0.05 % Tween-20的ros溶液，其 是在pH7.4PBS溶液(磷酸鹽緩沖液）中加入Tween-20，使其體積分?jǐn)?shù)為0.05 %，由此得到體 積分?jǐn)?shù)〇.〇5%PBST溶液。
[0021] 本發(fā)明在ATI測(cè)定時(shí)，選用HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的抗λ鏈抗體作為檢測(cè)抗體， 該抗體僅與ATI結(jié)合，不與IFX結(jié)合，可使ATI的檢測(cè)結(jié)果不受血清中IFX的影響，同時(shí)由于不 存在ATI的標(biāo)準(zhǔn)品，所以我們選用已知濃度的可以與IFX結(jié)合的抗F(ab'） 2段的IgG抗體進(jìn)行 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，使結(jié)果可信，準(zhǔn)確性大大提高。同時(shí)新方法操作簡(jiǎn)便，普通實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展， 測(cè)量結(jié)果靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠廣泛應(yīng)用臨床。
【附圖說(shuō)明】：
[0022] 圖1是ATI標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0023]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0024]實(shí)施例1:血清ATI濃度測(cè)定：
[0025] -、試劑準(zhǔn)備：
[0026] (l)TNF-a:l〇〇yg TNF-α中加入lml無(wú)菌去離子水，在室溫下靜置2小時(shí)，加入4ml質(zhì) 量分?jǐn)?shù)0.1%BSA-roS溶液，分裝到250μ1的EP管中，-20°C低溫保存，避免反復(fù)凍融，工作濃 度為含500ng/ml TNF-a的碳酸氫鹽緩沖液，使用時(shí)，用下面的碳酸氫鹽緩沖液(PH9.6)稀 釋。
[0027] (2)碳酸氫鹽緩沖液:將Na2C03 1.59g和NaHC03 2.93g加入1L的蒸餾水，調(diào)pH達(dá)到 9.6,4°C保存不能超過(guò)1個(gè)月，使用前需恢復(fù)至室溫
[0028] (3) IFX標(biāo)準(zhǔn)品：用BCA法測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品的IFX濃度，并分裝到250μ1的EP管保存于-20 °C，可凍融2次。
[0029] (4)HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體：分裝到250μ1 EP管，-20 °C保存。使用時(shí)在495μ 11 %BSA-roS溶液中加入5μ1的HRP標(biāo)記的抗λ鏈單抗，吸取40μ1上述溶液，加入lml 1 % BSA-PBS溶液中，作為工作溶液；
[0030] (5)HRP標(biāo)記的抗F(ab '）2段的IgG抗體:分裝到的250μ 1 EP管，-80°C低溫保存。為 了中期存儲(chǔ)，可與保護(hù)性過(guò)氧化物酶溶液按1:100稀釋?zhuān)?°C可保存超過(guò)6個(gè)月。工作濃度為 600ng/ml，2yl 加入 lml 1%BSA-PBS 溶液即可；
[0031] (6) TMB: 4 °C保存，使用前需恢復(fù)至室溫
[0032] (7)2M H2S〇4:4°C保存，使用前需恢復(fù)至室溫
[0033] 所述的l%BSA-roS是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的PBS溶液，其是在pH7.4磷酸鹽緩沖液 (PBS)中加入BSA使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液；
[0034] 所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA-PBS是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA的roS溶液，是在pH7.4磷酸 鹽緩沖液(PBS)中加入BSA，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %，由此得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA的PBS溶液。 [0035]二、ATI 的測(cè)定
[0036] (1)用100μΙ含500ng/ml TNF-α的碳酸氫鹽緩沖液包被ELISA板，4°C過(guò)夜培育
[0037] (2)用 250μ1 0.05%PBST 洗板 2 次，洗去未附著于 ELISA 板上的 TNF-a，用 150μ1 1% BSA-PBS封閉1-2小時(shí)，由此得到TNF-a包被ELISA板；
[0038] (3)ELISA板上每孔加入100μΙ 100μg/ml IFX，通過(guò)與TNF-a特異性結(jié)合固定于 ELISA板上，作為捕獲ATI的抗原，室溫下孵育1小時(shí)，200rpm振動(dòng)；
[0039] (4)用250μ1 0.05%PBST洗板3次，洗去未結(jié)合的IFX，由此得到抗英夫利西抗體包 被的ELISA板，將抗英夫利西抗體包被的ELISA板的孔分成待測(cè)樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔；
[0040] (5)在待測(cè)樣本孔處加入100μΙ用1%BSA-PBS稀釋的血清(一般稀釋倍數(shù)為100倍， 可根據(jù)結(jié)果減少或增加稀釋倍數(shù)），使血清中的ATI與IFX特異性結(jié)合，以及陰性對(duì)照(全陰 性血清，按1:100稀釋?zhuān)?，空白?duì)照（1 %BSA-PBS)，同時(shí)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔處加入100μΙ 1 %BSA- PBS，每個(gè)標(biāo)本設(shè)置1-2個(gè)副孔，室溫下孵育1小時(shí)，200rpm振動(dòng)
[00411 (6)用250μ1 0.05%PBST洗板4次，洗去血清中未與IFX結(jié)合的成分
[0042] (7)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔處加入100μΙ HRP標(biāo)記的抗F(ab'）2段的IgG抗體，與結(jié)合于 ELISA板上的IFX結(jié)合，濃度從600ng/ml開(kāi)始，連續(xù)倍比稀釋?zhuān)玫?個(gè)濃度（600ng/ml， 300ng/ml，150ng/ml，75ng/ml，37 · 5ng/ml，18· 75ng/ml，9 · 375ng/ml)，最后一個(gè)孔僅加 1 % BSA-PBS，每個(gè)濃度設(shè)置1-2個(gè)副孔，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在待測(cè)樣本孔中，每孔加入100μΙ HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體，與結(jié)合于IFX上的ATI結(jié)合，不與IFX結(jié)合，室溫下孵育1小時(shí)， 200rpm振動(dòng)
[0043] (8)用250μ1 0.05%roST洗板4次，洗去未結(jié)合的抗F(ab'）2段IgG抗體及抗λ鏈IgG 抗體；
[0044] (9)避光下，每孔加入100μΙ TMB，直到4分鐘后(通常在3-6分鐘變色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔 的顏色深淺決定是否終止反應(yīng))變成藍(lán)色后加入50μ1的2Μ H2S〇4終止反應(yīng)，變成黃色 [0045] (10)在30分鐘內(nèi)于酶標(biāo)儀上讀取450nm的吸光度值。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出血清 中ATI的濃度。ATI標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。
[0046]從圖1可以看出，其檢測(cè)范圍為0_600ng/ml，待測(cè)樣本的濃度計(jì)算方法為將待測(cè)樣 本的0D值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的公式，再乘以稀釋倍數(shù)即可。
[0047]選取28例既往未接受過(guò)英夫利西治療的克羅恩病或正常受試者作為陰性對(duì)照，測(cè) 量陰性對(duì)照組的血清ATI濃度，可得出血清ATI濃度的檢測(cè)下限為1.05±0.79μg/ml?？组g變 異系數(shù)為0.84%，板間變異系數(shù)為7.93%。
[0048]在63個(gè)IFX治療的⑶患者中，應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)方法(抗λ鏈ELISA法)可檢測(cè)出22 個(gè)患者ATI陽(yáng)性(34.9 % )，而雙抗原夾心法僅可測(cè)出18個(gè)⑶患者ATI陽(yáng)性(28.5 % )，有4個(gè)患 者遺漏，且這4個(gè)患者血清中均可檢測(cè)出IFX。為進(jìn)一步驗(yàn)證血清IFX的存在對(duì)ATI檢測(cè)的干 擾，選取檢測(cè)高濃度ATI且IFX檢測(cè)不出的血清作為研究對(duì)象，外源性的加入梯度濃度的IFX (2.5，5，7.5，10μg/ml)，室溫下孵育lh后分別用本發(fā)明的檢測(cè)方法(抗λ鏈ELISA法)和雙抗 原夾心法檢測(cè)ATI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入2.5μg/ml外源性的IFX后，抗λ鏈ELISA法檢測(cè)ATI的水平較 未加外源性IFX前下降76%，而隨后加入5,7.5,10μg/ml不再繼續(xù)影響ATI的測(cè)定。9份血清 中有3份血清的ATI用抗λ鏈ELISA法是可以檢測(cè)出來(lái)的，但用雙抗原夾心法完全檢測(cè)不出。 而且，該研究發(fā)現(xiàn)16個(gè)IFX+ATI +(即血清中可同時(shí)檢測(cè)出IFX和ATI)的患者隨訪(fǎng)一段時(shí)間 后，6個(gè)月時(shí)有6個(gè)患者(37.5%)發(fā)生IFX失應(yīng)答，12個(gè)月時(shí)有7個(gè)患者(43.8%)發(fā)生失應(yīng)答， 24個(gè)月時(shí)有10個(gè)患者(78.6 % )發(fā)生失應(yīng)答，說(shuō)明抗λ鏈ELISA法在可檢測(cè)出IFX的血清中檢 測(cè)ATI的敏感性?xún)?yōu)于傳統(tǒng)的雙抗原夾心法。
[0049] 表1.抗λ鏈ELISA法和雙抗原夾心法檢測(cè)ATI
[0052] 所述的0 · 05 % TOST是指含體積分?jǐn)?shù)0 · 05 % Tween-20的PBS溶液，其是在pH 7 · 4的 磷酸鹽緩沖液中加入Tween-20，使其體積分?jǐn)?shù)為0.05 %，由此得到體積分?jǐn)?shù)0.05 % TOST溶 液。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗英夫利西抗體的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： 首先用TNF-α包被ELISA板，然后加入英夫利西單克隆抗體，使英夫利西單克隆抗體與 TNF-a結(jié)合固定于ELISA板上作為固定抗原，將ELISA板上固定有英夫利西單克隆抗體的孔 分成待測(cè)樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔； 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔中加入含BSA的PBS溶液，然后再加入倍比稀釋的已知濃度的抗F(ab'）2段的 IgG抗體，而后加入底物TMB，在HRP的催化下變?yōu)樗{(lán)色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測(cè)定 其吸光度值，通過(guò)已知濃度的抗F(ab'） 2段的IgG抗體的吸光度值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； 在待測(cè)樣本孔處加入待測(cè)血清，使血清中的抗英夫利西抗體(ATI)與IFX結(jié)合從而固定 下來(lái)，然后再加入針對(duì)ATI的HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體，而后加入底物TMB，在HRP的催化下 變?yōu)樗{(lán)色，后在酸的作用下變?yōu)辄S色，最后測(cè)定其吸光度值，根據(jù)待測(cè)血清的吸光度值與上 述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出血清中ATI的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗英夫利西抗體的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的含BSA的PBS 溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗英夫利西抗體的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的測(cè)定吸光度 值是在酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度值。4. 一種抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括抗英夫利西抗體包被的 ELI SA板、HRP標(biāo)記的抗λ鏈的IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗F(ab '）2段的IgG抗體、四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)、H2S〇4和輔助試劑組成； 所述的抗英夫利西抗體包被的ELI SA板是通過(guò)以下方法制備的：用TNF-α包被ELI SA板， 然后加入英夫利西單克隆抗體，使英夫利西單克隆抗體與TNF-a結(jié)合固定于ELISA板上作為 固定抗原，由此得到英夫利西抗體包被的ELISA板。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的輔助 試劑包括PH9.6的碳酸氫鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的PBS溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %BSA的roS溶 液、體積分?jǐn)?shù)〇. 05 % PBST溶液和蒸餾水。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗英夫利西抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的用 TNF-a包被ELISA板是用含500ng/ml TNF-a的碳酸氫鹽緩沖液包被ELISA板。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK106093413SQ201610571902
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】本·沙朗, 馮婷, 陳旻湖
【申請(qǐng)人】本·沙朗, 陳旻湖