專利名稱：豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于獸類(lèi)疫病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能同時(shí)對(duì)豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體進(jìn)行批量檢測(cè)的ELISA檢測(cè)試劑盒，可用于動(dòng)物疫病流行病的檢測(cè)與調(diào)查。
背景技術(shù)：
豬瘟、豬藍(lán)耳病和豬偽狂犬病都是流行于獸類(lèi)中的烈性傳染病，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的正常發(fā)展，養(yǎng)殖場(chǎng)的獸類(lèi)一旦感染這些病毒，將造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬瘟(classical swine fever，CSF)是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的疫病之一。在危害級(jí)別上，它是我國(guó)一類(lèi)動(dòng)物疫病，OIE法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。豬瘟是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染傳染病，具有高度傳染性和致死性。1885年首先在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，以后傳播到世界各大洲，中國(guó)大部分省都有發(fā)生。其主要通過(guò)直接接觸，或由于接觸污染的媒介物而發(fā)病，消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮膚均是感染途徑。豬藍(lán)耳病是由豬藍(lán)耳病病毒引起以妊娠母豬繁殖障礙及各種年齡豬，特別是仔豬的呼吸道疾病為特征的一種嚴(yán)重的傳染性疫病，PRRS現(xiàn)已遍布于全世界主要養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)，已經(jīng)成為威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的一種豬類(lèi)傳染性病。豬發(fā)生偽狂犬病后，其臨診癥狀因日齡而異，成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和種豬不育等綜合癥侯群。15日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病死亡率可達(dá)100%，斷奶仔豬發(fā)病率可達(dá)40%，死亡率20%左右。偽狂犬病的發(fā)生具有一定的季節(jié)性，多發(fā)生在寒冷的季節(jié)，但其他季節(jié)也有發(fā)生。由此可見(jiàn)，豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒和偽狂犬病毒的侵入會(huì)對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害，這也間接導(dǎo)致了肉類(lèi)市場(chǎng)供求關(guān)系混亂、肉類(lèi)產(chǎn)品出口受阻、政府財(cái)政負(fù)擔(dān)加重和公眾恐慌，因此，使用豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病的相關(guān)疫苗進(jìn)行免疫注射，并對(duì)免疫效果進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)以確定其是否產(chǎn)生相應(yīng)的抗體保護(hù)水平具有非常重大的意義。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型目的在于提供一種同時(shí)、批量、有效地檢測(cè)豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用如下技術(shù)方案:一種豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒有一個(gè)盒體，其中，所述盒體內(nèi)設(shè)有抗原包被反應(yīng)板、豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬瘟抗體陰性對(duì)照血清、豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清、豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清、20X濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)結(jié)合物、顯色劑A、顯色劑B和終止液。[0010]具體的，所述抗原包被反應(yīng)板的規(guī)格為96孔(96T)，從左至右被均分為檢測(cè)區(qū)1、檢測(cè)區(qū)II和檢測(cè)區(qū)III三個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有32T ;所述檢測(cè)區(qū)I包被豬瘟病毒蛋白抗原，檢測(cè)區(qū)II包被豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原，檢測(cè)區(qū)III包被豬偽狂犬病病毒蛋白抗原。所述的酶標(biāo)結(jié)合物為酶標(biāo)記的抗豬IgG。上述的豬瘟病毒蛋白抗原、豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原和豬偽狂犬病病毒蛋白抗原均為高純度的原核表達(dá)蛋白，可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備或購(gòu)買(mǎi)市售產(chǎn)品均可。盒體內(nèi)可分為抗原包被反應(yīng)板和試劑反應(yīng)體系兩部分；抗原包被反應(yīng)板可以用PS材質(zhì)的酶標(biāo)板制成，試劑反應(yīng)體系的包裝瓶可以是聚丙烯瓶。本實(shí)用新型采用酶聯(lián)免疫間接法，將豬瘟病毒蛋白抗原、豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原、豬偽狂犬病病毒蛋白抗原分別包被到包被反應(yīng)板的三個(gè)檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，所包抗原可分別與待檢樣品中的特異性抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物被吸附到固相包被反應(yīng)板上，再加入酶標(biāo)結(jié)合物(酶標(biāo)記的抗豬IgG)，形成固相病毒抗原-病毒抗體-抗豬抗體-HRP免疫復(fù)合物。如果待檢樣品中含有相應(yīng)的抗體，加入顯色劑后即為酶催化顯色，為陽(yáng)性，反之為陰性。本實(shí)用新型所述試劑盒通過(guò)對(duì)包被反應(yīng)板的抗原包被濃度和酶標(biāo)記結(jié)合物濃度的調(diào)整，使其能夠產(chǎn)生特異性顯色，從而進(jìn)行豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的檢測(cè)。該試劑盒能同時(shí)對(duì)豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體進(jìn)行批量檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、快速檢測(cè)大批量樣品等優(yōu)點(diǎn)，可用于動(dòng)物疫病流行病的檢測(cè)與調(diào)查。

圖1為本實(shí)用新型所述試劑盒的橫切面剖視圖，即盒體內(nèi)設(shè)置的組成及位置示意圖；圖中，I為抗原包被反應(yīng)板；5為ImL豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清；6為ImL豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清；7為ImL豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清；8為ImL豬瘟抗體陰性對(duì)照血清；9為ImL豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照 血清；10為ImL豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清；11為50mL 20 X濃縮洗滌液；12為IlmL樣品稀釋液；13為IImL酶標(biāo)結(jié)合物；14為6mL顯色劑A ; 15為6mL顯色劑B ;16為6mL終止液；17為盒體；圖2為圖1中的抗原包被反應(yīng)板的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，I為抗原包被反應(yīng)板；2為檢測(cè)區(qū)I ;3為檢測(cè)區(qū)II ；4為檢測(cè)區(qū)III。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本實(shí)用新型的保護(hù)范圍不限于此。如圖1和2所示，一種豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒有一個(gè)盒體17，其中，所述盒體17內(nèi)設(shè)有抗原包被反應(yīng)板1、豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清5、豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清6、豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清7、豬瘟抗體陰性對(duì)照血清8、豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清9、豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清10、20X濃縮洗滌液11、樣品稀釋液12、酶標(biāo)結(jié)合物13、顯色劑A 14、顯色劑B 15和終止液16。所述抗原包被反應(yīng)板I的規(guī)格為96T，從左至右被均分為檢測(cè)區(qū)I 2、檢測(cè)區(qū)II 3和檢測(cè)區(qū)III 4三個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有32T;所述檢測(cè)區(qū)I 2包被豬瘟病毒蛋白抗原，檢測(cè)區(qū)II 3包被豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原，檢測(cè)區(qū)III 4包被豬偽狂犬病病毒蛋白抗原?？乖环磻?yīng)板I為PS材質(zhì)的酶標(biāo)板。本實(shí)用新型所述試劑盒采用酶聯(lián)免疫間接法制備，具體制備工藝如下:(I)抗原包被反應(yīng)板I的制備:將96T酶標(biāo)板從左至右均分為檢測(cè)區(qū)I 2、檢測(cè)區(qū)II 3和檢測(cè)區(qū)III 4共三個(gè)檢測(cè)區(qū)(見(jiàn)圖2)。其中，用抗原稀釋液稀釋豬瘟病毒蛋白抗原使其終濃度為2Pg/mL，按IOOPL/孔包被檢測(cè)區(qū)I 2 ;用抗原稀釋液稀釋豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原使其終濃度為1.2Pg/mL，按IOOPL/孔包被檢測(cè)區(qū)II 3 ;用抗原稀釋液稀釋豬偽狂犬病毒蛋白抗原使其終濃度為1.5Pg/mL，按ΙΟΟμ ν孔包被檢測(cè)區(qū)III 4 ;然后用封板膜封板2 — 8°C過(guò)夜。次日，洗板I次，按150μ 7孔加入封閉液，37°C封閉2h ;然后吸出孔內(nèi)液體，置37°C烘箱中烤干，最后用鋁箔袋熱封裝袋保存。上述抗原稀釋液、封閉液的具體組分配比如下:A抗原稀釋液:每IOOOmL純化水中含碳酸鈉1.70g和碳酸氫鈉2.86g。B封閉液:每IOOOmL純化水中含牛血清白蛋白6g、蔗糖40g、胰蛋白胨IOg和proclin300 ImL0(2)豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清5的制備:將豬瘟抗體陽(yáng)性血清0.5mL加入到濃度
0.01mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液中，最終定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(3)豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清6的制備:將豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性血清0.5mL加入到濃度0.01mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液中，最終定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。 (4)豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清7的制備:將豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性血清0.5mL加入到濃度0.0lmol/L、pH7.2的PBS緩沖液中，最終定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(5)豬瘟抗體陰性對(duì)照血清8的制備:將豬瘟抗體陰性血清ImL加入到濃度
0.0lmol/L、pH7.2的PBS緩沖液中，最終定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(6)豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清9的制備:將豬藍(lán)耳病抗體陰性血清ImL加入到濃度0.01mol/L、pH7.2的PBS緩沖液中，最終定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(7)豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清10的制備:將豬偽狂犬病抗體陰性血清ImL加入到濃度0.0lmol/L、pH7.2的PBS緩沖液中，最終定容至IOOmL,然后按ImL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(8) 20X濃縮洗滌液11的制備:將4g磷酸二氫鉀、58g十二水磷酸氫二鈉、160g氯化鈉、IOmL吐溫-20和ImL Proclin 300加入到純化水中，最終定容至1L，然后按50mL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(9)樣品稀釋液12的制備:將1.28磷酸二氫鈉g、0.41g磷酸氫二鈉、20.09g氯化鈉、ImL吐溫_20、50mL新生牛血清、0.2g指示劑、ImL曲拉通X-100和ImL Proclin 300力口入到純化水中，最終定容至1L，然后按IlmL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(10)酶標(biāo)結(jié)合物13的制備:將2.42g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.8g酶穩(wěn)定劑、IOOmL新生牛血清、1.5mL曲拉通X_100、8.5g氯化鈉、ImL Proclin 300、Ig紅色染料、
1.65mL濃鹽酸和0.5mL HRP-抗豬IgG抗體加入到純化水中，最終定容至1L，然后按IlmL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。[0032](11)顯色劑A 14的制備:將檸檬酸2.10g，結(jié)晶乙酸鈉12.25g，過(guò)氧化脲0.6g加入到純化水中，最終定容至1L，然后按6mL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(12)顯色劑B 15的制備:將檸檬酸2.1Og7EDTA 0.3g, TMB-HCl 0.6g加入到純化水中，最終定容至1L,然后按6mL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(13)終止液16的制備:將濃硫酸108.5mL緩慢溶于純化水中，定容至1000ml，然后按6mL/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝。(14)組盒:每個(gè)試劑盒配備I塊抗原包被反應(yīng)板、I瓶豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、I瓶豬瘟抗體陰性對(duì)照血清、I瓶豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、I瓶豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清、I瓶豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、I瓶豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清，I瓶20 X濃縮洗滌液、樣品稀釋液I瓶，I瓶酶標(biāo)結(jié)合物、I瓶顯色劑A、1瓶顯色劑B和I瓶終止液，組成一個(gè)試劑盒。本實(shí)用新型采用高純度的豬瘟病毒蛋白、豬藍(lán)耳病病毒蛋白和豬偽狂犬病病毒蛋白作為包被抗原進(jìn)行特異性的豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的檢測(cè)。其原理是:將豬瘟病毒蛋白抗原、豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原、豬偽狂犬病病毒蛋白抗原分別包被到抗原包被反應(yīng)板I的檢測(cè)區(qū)I 2、檢測(cè)區(qū)II 3和檢測(cè)區(qū)III 4中，所包抗原可分別與待檢樣品中的特異性抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物被吸附到固相包被反應(yīng)板上，再加入酶標(biāo)記的抗豬IgG，形成固相病毒抗原-病毒抗體-抗豬抗體-HRP免疫復(fù)合物。如果待檢樣品中含有相應(yīng)的抗體，加入顯色劑后即為酶催化顯色，為陽(yáng)性；反之為陰性。該試劑盒的使用說(shuō)明，其具體操作步驟如下:(I)配洗液:將50ml的20X濃縮洗滌液加純化水稀釋至1000ml，充分搖勻后備
用。`(2)編號(hào):每次試驗(yàn)應(yīng)在抗原包被反應(yīng)板的檢測(cè)區(qū)1、檢測(cè)區(qū)II和檢測(cè)區(qū)III上分別設(shè)空白對(duì)照孔I L，陰性對(duì)照孔2孔，陽(yáng)性對(duì)照孔2孔，其余為待檢樣品孔。(3)加樣品稀釋液:用加樣器在抗原包被反應(yīng)板的待檢樣品孔中加入樣品稀釋液，每孔100μ I ;空白對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔不加樣品稀釋液。(4)加樣:分別于各待檢樣品孔加入待檢樣品10μ 1，檢測(cè)區(qū)I上的陰性對(duì)照孔加入豬瘟抗體陰性對(duì)照血清100 μ 1，陽(yáng)性對(duì)照孔加入豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清100 μ I。檢測(cè)區(qū)II上的陰性對(duì)照孔加入豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清100 μ 1，陽(yáng)性對(duì)照孔加入豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清100μ I。檢測(cè)區(qū)III上的陰性對(duì)照孔加入豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清100 μ 1，陽(yáng)性對(duì)照孔加入豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清100 μ I。空白對(duì)照孔不加樣。(5)溫育(一):充分混勻，貼上封板膜，37±2°C溫育30分鐘。(6)洗板(一):洗板機(jī)洗或手洗5次。(7)加酶標(biāo)結(jié)合物:除空白對(duì)照孔以外，各孔中加入酶標(biāo)結(jié)合物100 μ I。(8)溫育(二):貼上封板膜，37±2°C溫育30分鐘。(9)洗板(二):洗板機(jī)洗或手洗5次。(10)加顯色劑:每孔加入顯色劑A 50 μ 1，全部加完后再在每孔中加入顯色劑B50 μ 1，混勻。(11)溫育(三):37 ±2 °C 顯色 10 分鐘。(12)終止:顯色完畢后立即于每孔加50 μ I終止液，混勻。[0050](13)測(cè)定:終止后應(yīng)在10分鐘內(nèi)完成判讀。對(duì)空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值0D?；蚴褂秒p波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm，參考波長(zhǎng)可選630nm或 655nm。(14)結(jié)果判定:試劑盒閾值=0.1+陰性對(duì)照OD平均值。若陰性對(duì)照OD平均值^ 0.05則按實(shí)際值計(jì)算；若陰性對(duì)照OD平均值< 0.05則按0.05計(jì)算。若待檢樣品OD值〈試劑盒閾值，結(jié)果判為陰性；若待檢樣品OD值>試劑盒閾值，結(jié)果判為陽(yáng)性。按照各個(gè)檢測(cè)區(qū)的陰性對(duì)照OD平均值分別計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的閾值，即可通過(guò)各個(gè)檢測(cè)區(qū)待檢樣品孔的OD值與該檢測(cè)區(qū)的閾值進(jìn)行比較，判定各樣品的結(jié)果。本實(shí)用新型試劑盒能同時(shí)對(duì)豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體進(jìn)行批量檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、快速檢測(cè)大批量樣品等優(yōu)點(diǎn)，可用于動(dòng)物疫病流行病的檢測(cè)與調(diào) 查。
權(quán)利要求1.一種豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒有一個(gè)盒體，其特征在于，所述盒體內(nèi)設(shè)有抗原包被反應(yīng)板、豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬瘟抗體陰性對(duì)照血清、豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清、豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清、20X濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)結(jié)合物、顯色劑A、顯色劑B和終止液。
2.如權(quán)利要求1所述豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗原包被反應(yīng)板的規(guī)格為96孔，從左至右被均分為檢測(cè)區(qū)1、檢測(cè)區(qū)II和檢測(cè)區(qū)III三個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有32孔；所述檢測(cè)區(qū)I包被豬瘟病毒蛋白抗原，檢測(cè)區(qū)II包被豬藍(lán)耳病病毒蛋白抗原，檢測(cè)區(qū)III包被豬偽狂犬病病毒蛋白抗原。
3.如權(quán)利要求1所述豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑 盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)結(jié)合物為酶標(biāo)記的抗豬IgG。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒有一個(gè)盒體，其中，所述盒體內(nèi)設(shè)有抗原包被反應(yīng)板、豬瘟抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬瘟抗體陰性對(duì)照血清、豬藍(lán)耳病抗體陰性對(duì)照血清、豬偽狂犬病抗體陰性對(duì)照血清、20×濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標(biāo)結(jié)合物、顯色劑A、顯色劑B和終止液。該試劑盒能同時(shí)批量檢測(cè)出待檢樣品是否含有豬瘟病毒抗體、豬藍(lán)耳病病毒抗體和豬偽狂犬病病毒抗體，具有靈敏度高、特異性好、快速檢測(cè)大批量樣品等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK203101397SQ20132009100
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者趙林萍, 曾小宇, 張如民, 任寶紅, 李丹, 孫強(qiáng), 苗銀萍, 王鵬, 李慧英, 王集美, 魯龍, 孫帥嶺, 魏卓, 王思敏, 楊陽(yáng), 岳崢 申請(qǐng)人:鄭州中道生物技術(shù)有限公司