卡拉膠Carrageenan在防治豬藍(lán)耳病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及卡拉膠Carrageenan在防治豬藍(lán)耳病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV)引起。該病最早于1987年在美國爆發(fā)，隨后蔓延到歐洲，我國于1996年分離到該病毒。目前，根據(jù)基因組序列和抗原性差異，將PRRSV分為兩種基因型，一種以Lelystad Virus (LV)毒株為代表的歐洲型，另一種以ATCC VR-2332毒株為代表的美洲型。在我國，PRRSV主要以美洲型為主，但據(jù)報(bào)道也分離到歐洲型毒株。2006年，我國爆發(fā)了豬高熱病，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，后來將此毒株定義為高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSVXPRRS主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年齡段豬特別是仔豬呼吸道癥狀，特征性病變?yōu)殚g質(zhì)性肺炎，死亡率極高，是一種高度接觸性的全球性的重要傳染病。PRRSV屬于尼多病毒目(祖(10￥；[作168)、動脈炎病毒科(41^61'；^；[1^(136)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，電鏡下觀察病毒粒子呈球形或橢圓形，有囊膜。病毒基因組為一條單股正鏈RNA，全長約為15Kb，含有Y和丨非編碼區(qū)，中間為10個開放閱讀框(open readingframe，0RF)，其中0RF2-7分別翻譯病毒糖蛋白(glycoprotein，GP)GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它們不僅是病毒粒子的主要組成部分，而且在病毒粒子的包裝、成熟、免疫逃避及抗體誘導(dǎo)中產(chǎn)生重要的作用。
[0003]PRRSV的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRSV難于防控主要表現(xiàn)在以下幾方面:(1)嗜巨噬細(xì)胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì)胞(Porcinealveolar macrophages，PAMs)，PAMs是免疫細(xì)胞，破壞PAMs，從而破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而引起免疫抑制；(2)抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個原因，最近有文獻(xiàn)報(bào)道，美國出現(xiàn)了藍(lán)耳新毒株NADC30，而我國也分離到類似美國的新毒株，命名為NADC30-like，而另有文獻(xiàn)報(bào)道從豬場中分離到與疫苗毒基因組高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增強(qiáng)，分析有可能是疫苗毒反強(qiáng)或重組并散毒；(3)疫苗沒有交叉保護(hù)力，目前市場上PRRSV疫苗幾乎無交叉保護(hù)力，不同毒株間不交叉保護(hù)力；(4)抗體依賴性增強(qiáng)，PRRSV的感染會刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但低效價的抗體不但不能中和病毒，反而對病毒的增殖有促進(jìn)作用；(5)病毒持續(xù)性感染，PRRSV感染后，能夠長時間在豬體內(nèi)檢測到病毒血癥，PRRSV在體內(nèi)持續(xù)時間長達(dá)5個月；(6 )混合感染，目前臨床上多見藍(lán)耳與其他疾病混合感染，特別是圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬肺疫等與PRRSV的混合感染使PRRSV防控難上加難。
[0004]目前PRRSV防控主要有滅活疫苗和弱毒疫苗，臨床上用的較多的是弱毒疫苗。其中滅活疫苗有如下缺點(diǎn):(1)需要大劑量接種或應(yīng)用濃縮抗原，免疫期短，常需強(qiáng)化接種；(2)不能引起局部免疫，以致細(xì)胞免疫的作用弱；(3)產(chǎn)生完全免疫力需要2-3周，不利于緊急預(yù)防接種與降低疫苗費(fèi)用；(4)存在滅活不徹底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)、重組、潛在感染的危險及無交叉保護(hù)力。因此，研制新型抗PRRSV藥物迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有豬藍(lán)耳病防治技術(shù)和藥物的缺陷和不足，提供一種能夠防治豬藍(lán)耳病的物質(zhì)--卡拉膠(Carrageenan，CG)。所述卡拉膠CG對PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是針對高致病型毒株HP-PRRSV具有顯著的抗病毒作用，且其已廣泛運(yùn)用于食品添加劑中，對細(xì)胞及機(jī)體幾乎無毒性，故在豬藍(lán)耳病的防治方面具有很好的應(yīng)用前景。
[0006]本發(fā)明的目的是提供卡拉膠(Carrageenan，CG)在制備抗PRRSV病毒藥物中的應(yīng)用，尤其是抗HP-PRRSV藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供上述卡拉膠CG在制備防治豬藍(lán)耳病的藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明公開了卡拉膠CG在制備抗PRRSV病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0009]優(yōu)選地，所述PRRSV病毒為高致病性藍(lán)耳病病毒HP-PRRSV。
[0010]本發(fā)明還公開了卡拉膠CG在制備防治豬藍(lán)耳病的藥物中的應(yīng)用。
[0011]優(yōu)選地，所述豬藍(lán)耳病是由高致病性藍(lán)耳病病毒HP-PRRSV引起的豬藍(lán)耳病。
[0012]另外，優(yōu)選地，所述卡拉膠CG的使用劑量范圍為10?30yg/mlo
[0013]更優(yōu)選地，所述卡拉膠CG的使用劑量范圍為10?20yg/mlo
[0014]另外，包括有效量的卡拉膠CG的抗PRRSV病毒藥物，也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述PRRSV病毒為高致病性藍(lán)耳病病毒HP-PRRSV。
[0015]優(yōu)選地，所述藥物制劑為注射制劑或口服制劑。
[0016]優(yōu)選地，所述注射制劑為凍干粉針劑。
[0017]優(yōu)選地，所述口服制劑為散片劑、膠囊劑或顆粒劑。
[0018]卡拉膠(Carrageenan，CG)是從海洋紅藻中提取出來的，現(xiàn)有技術(shù)中有報(bào)道其對多種病毒具有抗病毒作用。但是，CG對不同病毒的抑制作用存在差異，這種差異與病毒的血清型及宿主細(xì)胞本身有關(guān)，而且關(guān)于卡拉膠抗病毒作用機(jī)制的研究還十分欠缺，限制了卡拉膠在抗病毒方面的應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中，尚未見有關(guān)于CG是否具有抗PRRSV病毒作用的研究和報(bào)道。
[0019]本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)了卡拉膠對PRRSV病毒的抗病毒作用，尤其是對HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，對豬藍(lán)耳病的治療提供了一種新的藥物和藥物基礎(chǔ)。
[0020]同時，本發(fā)明還系統(tǒng)研究了CG對PRRSV的抗病毒機(jī)制。首先在Marc-145細(xì)胞水平上通過91?1'-?0?、￥68丨6?1-810丨、細(xì)胞上清1'(:105()檢測及免疫熒光(正4)等多種方法研究證實(shí)了CG在Marc-145細(xì)胞和PAMs細(xì)胞水平對HP-PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，并闡述CG在病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞兩個過程中的抗病毒機(jī)制;接著在PRRSV自然宿主細(xì)胞PAMs上研究其對HP-PRRSV抗病毒作用，最后通過分析CG在Marc-145和PAMs上對細(xì)胞因子表達(dá)影響，初步闡明其是否通過抑制NF-kB通路來抗PRRSV。
[0021]本發(fā)明具有以下有益效果: 本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)了卡拉膠(Carrageenan，CG)的抗PRRSV病毒作用，尤其是對HP-PRRSV有很好的抗病毒效果。本發(fā)明通過TCID5Q、qRT-PCR、IFA及Western-Blot等多種方法研究證實(shí)了CG在Marc-145細(xì)胞和PAMs細(xì)胞水平對PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，結(jié)果表明CG能夠顯著性地降低N基因和N蛋白表達(dá)水平，且隨著CG濃度的升高，抑制效果更明顯，尤其是對高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有顯著的抗病毒作用，為研制抗豬藍(lán)耳病的新型藥物奠定了基礎(chǔ)。
[0022]本發(fā)明對豬藍(lán)耳病的治療提供了一種新的藥物和藥物基礎(chǔ)，而且，CG已廣泛運(yùn)用于食品添加劑中，對細(xì)胞及機(jī)體幾乎無毒性，故在豬藍(lán)耳病的防治方面具有很好的應(yīng)用前景。
[0023]而且CG應(yīng)用于抗HP-PRRSV，有望成為一種新型的防治豬藍(lán)耳病的藥物，為CG提供了一種新的應(yīng)用。
[0024]另外，本發(fā)明通過多種方法驗(yàn)證研究了CG對HP-PRRSV的抗病毒作用，而且闡述了其在病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞兩個過程中的抗病毒機(jī)制，為其應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0025]圖1為卡拉膠CG細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。
[0026]圖2為卡拉膠CG抗病毒試驗(yàn)中，分別經(jīng)不同濃度CG作用36h后，N基因相對于內(nèi)參GAPDH的表達(dá)水平圖(先接毒，后加CG)。
[0027]圖3為卡拉膠CG抗病毒試驗(yàn)中，分別經(jīng)不同濃度CG處理后的HP-PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞上清中的病毒滴度圖(先接毒，后加CG)。
[0028]圖4為卡拉膠CG抗病毒試驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度CG處理36h后，N蛋白表達(dá)水平圖(先接毒，后加CG)。
[0029]圖5為卡拉膠CG抗病毒試驗(yàn)中，分別經(jīng)不同濃度CG作用36h后，N基因相對于內(nèi)參GAPDH的表達(dá)水平圖(病毒與CG同時孵育)。
[0030]圖6為卡拉膠CG抗病毒試驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度CG處理36h后，N蛋白表達(dá)水平圖(病毒與CG同時孵育)。
[0031 ]圖7為卡拉I父CG抗病毒間接免疫9?光試驗(yàn)檢測CG抗病毒效果圖。
[0032]圖8為卡拉膠CG抗病毒機(jī)制一病毒吸附細(xì)胞過程中4基因相對于內(nèi)參GAPDH的表達(dá)水平圖。
[0033]圖9為卡拉膠CG抗病毒機(jī)制一病毒吸附細(xì)胞過程中，N蛋白Western-Blot檢測圖。
[0034]圖10為卡拉膠CG抗病毒機(jī)制一病毒吸附細(xì)胞過程中，細(xì)胞上清TCID5Q病毒滴度測定。
[0035]圖11為卡拉膠CG抗病毒機(jī)制一病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中4基因相對于內(nèi)參GATOH的表達(dá)水平圖。
[0036]圖12為卡拉Jj父CG抗病毒機(jī)制一病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中，N蛋白Western-Blot檢測圖。
[0037]圖13為卡拉膠CG抗病毒機(jī)制一病毒進(jìn)入細(xì)胞過程中，細(xì)胞上清TCID5Q病毒滴度測定。
[0038]圖14為卡拉膠CG在PRRSV自然宿主細(xì)胞PAMs上抗病毒作用圖。
[0039]圖15為卡拉膠CG在PAMs細(xì)胞上對細(xì)胞因子IFN-α表達(dá)的影響。
[0040]圖16為卡拉膠CG在PAMs細(xì)胞上對細(xì)胞因子IFN-β表達(dá)的影響。
[0041 ]圖17為卡拉膠CG在Marc-145細(xì)胞上對細(xì)胞因子IFN-α表達(dá)的影響。
[0042]圖18為卡拉膠CG在Marc-145細(xì)胞上對細(xì)胞因子IFN-β表達(dá)的影響。
[0043]圖19為卡拉膠CG在Marc-145細(xì)胞上對細(xì)胞因子IL-6表達(dá)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0045]除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。
[0046]本發(fā)明以下實(shí)施例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有試驗(yàn)至少3次獨(dú)立重復(fù)，結(jié)果采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用單因素方差分析和T檢測分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用以P〈0.05作為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分析軟件為SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
[0047]實(shí)施例1卡拉膠CG細(xì)胞毒性試驗(yàn)
1、AlamarBlue(購自Invitrogen公司)作為活細(xì)胞代謝指示劑，在線粒體酶促還原反應(yīng)下會產(chǎn)生可測量的熒光代謝產(chǎn)物，通過測定其熒光強(qiáng)度可監(jiān)測細(xì)胞活性。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞至60-70%，棄去培養(yǎng)