一種能夠防治豬藍耳病的生物活性分子-抗菌肽Cecropin D的制作方法
【專利說明】—種能夠防治豬藍耳病的生物活性分子-抗菌肽Cecrop i η
D
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領域。更具體地，涉及一種能夠防治豬藍耳病的生物活性分子抗菌肽Cecropin D。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome viruse, PRRSV)引起，PRRS主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年齡階段豬特別是仔豬呼吸道癥狀，特征性病變?yōu)殚g質(zhì)性肺炎，死亡率極高，是一種高度接觸性的全球性的重要傳染病。該病最早于1987年在美國爆發(fā)，隨后蔓延到歐洲，我國于1996年分離到該病毒。目前，根據(jù)基因組序列和抗原性差異，將PRRSV分為兩種基因型，一種以Lelystad Virus (LV)毒株為代表的歐洲型，另一種以ATCC VR-2332毒株為代表的美洲型。在我國，PRRSV主要以美洲型為主，但據(jù)報道也分離到歐洲型毒株。2006年，我國爆發(fā)了豬高熱病，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，后來將此毒株定義為高致病型毒株(Highlypathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse, HP-PRRSV),目前，高致病性豬藍耳病(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome,HP-PRRS)是對養(yǎng)豬業(yè)損害最大的疾病之一，由于該病毒具有免疫抑制性、抗體依賴增強性、持續(xù)性感染、病毒血癥維持時間長等特點，目前沒有很好的疫苗和藥物可以防控藍耳病。
[0003]PRRSV屬于尼多病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，電鏡下觀察病毒粒子呈球形或橢圓形，有囊膜。病毒基因組為一條單股正鏈RNA，全長約為15Kb，含有5'和3'非編碼區(qū)，中間為10個開放閱讀框(openreading frame, 0RF),其中 0RF2-7 分別翻譯病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它們不僅是病毒粒子的主要組成部分，而且在病毒粒子的包裝、成熟、免疫逃避及抗體誘導中產(chǎn)生重要的作用。
[0004]PRRS的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRS難于防控主要表現(xiàn)在以下幾方面:(1)嗜巨噬細胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs), PAMs是免疫細胞，破壞PAMs,從而破壞機體免疫系統(tǒng),從而引起免疫抑制；(2)抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個原因，疫苗沒有交叉保護力；(3)抗體依賴性增強，PRRSV的感染會刺激機體產(chǎn)生抗體，但低效價的抗體不但不能中和病毒，反而對病毒的增殖有促進作用；(4)病毒持續(xù)性感染，PRRSV感染后，能夠長時間在豬體內(nèi)檢測到病毒血癥；(5)混合感染，目前臨床上混合感染，特別是圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌等與PRRSV的混合感染，使PRRSV防控難上加難。
[0005]目前PRRS防控主要有滅活疫苗和弱毒疫苗，臨床上用的較多的是弱毒疫苗。其中滅活疫苗有如下缺點:(1)需要大劑量接種或應用濃縮抗原，免疫期短，常需強化接種；(2)不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱；(3)產(chǎn)生完全免疫力需要2?3周，不利于緊急預防接種與降低疫苗費用；(4)存在滅活不徹底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返強、重組及潛在感染的危險。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越來越多的問題。
[0006]1975年，瑞典科學家Boman等從惜古比天蠶蛹中誘導分離得到一種抗菌肽，并命名為Cecropin。天蠶素Cecropin D (⑶)是家蠶體內(nèi)cecropins家族的一種抗菌小肽，由36個氨基酸殘基組成，分子量為3.9KDa，含有2段α -螺旋，中間由一段結(jié)節(jié)部位相連，N端經(jīng)常是一些強堿性氨基酸殘基，C端則由非極性氨基酸殘基構(gòu)成疏水性區(qū)域。目前已證明CD對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌有抗微生物學活性。而關(guān)于抗菌肽Cecropin D(CD)是否具有抗病毒活性，尤其是否具有抗PRRSV病毒的作用，至今還未見有相關(guān)的研究或報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有豬藍耳病防治技術(shù)的不足，提供一種能夠防治豬藍耳病的生物活性分子抗菌肽Cecropin D(⑶)。該抗菌肽⑶對PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是針對高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有顯著的抗病毒作用，在豬藍耳病的防治方面具有很好的應用前景。
[0008]本發(fā)明的目的是提供抗菌肽Cecropin D(⑶)在制備抗PRRSV病毒藥物中的應用，尤其是抗HP-PRRSV藥物中的應用。
[0009]本發(fā)明另一目的是提供抗菌肽Cecropin D (⑶)在制備防治豬藍耳病藥物中的應用。
[0010]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
公開了抗菌肽Cecropin D在制備抗PRRSV病毒藥物中的應用，所述抗菌肽CecropinD的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。優(yōu)選地，所述PRRSV病毒為高致病性藍耳病病毒HP-PRRSVo
[0011]公開了抗菌肽Cecropin D在制備防治豬藍耳病藥物中的應用，所述抗菌肽Cecropin D的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。優(yōu)選地，所述豬藍耳病是由高致病性藍耳病病毒HP-PRRSV引起的豬藍耳病。
[0012]SEQ ID N0.1 所示序列為:WNPFKELERAGQRVRDAIISAGPAVATVAQATALAK。
[0013]另外，上述抗菌肽Cecropin D含有2段α -螺旋，中間由一段結(jié)節(jié)部位相連#端是強堿性氨基酸殘基，C端由非極性氨基酸殘基構(gòu)成疏水性區(qū)域。
[0014]所述抗菌肽Cecropin D使用劑量范圍為100 mg/L?300 mg/L。
[0015]包括有效量的抗菌肽Cecropin D的抗PRRSV病毒藥物，也應在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述PRRSV病毒為高致病性藍耳病病毒HP-PRRSV。
[0016]該藥物的劑型可以為注射制劑或口服制劑。
[0017]本發(fā)明首先合成抗菌肽Cecropin D的基因序列引物，并利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達抗菌肽Cecropin D (⑶),然后通過抗大腸桿菌DH5 α實驗驗證其抗菌活性,進一步在Marc-145細胞和PAMs細胞水平上，通過qRT-PCR、Western_Blot、TCID5tl檢測及IFA等方法研究其對HP-PRRSV毒株的抗病毒活性，并通過病毒吸附、進入細胞和進入細胞后2h、4h四個過程研究闡述其抗病毒機制。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述方法制得的抗菌肽Cecropin D有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成為新型的防治豬藍耳病的生物活性分子。
[0018]另外,對于抗菌肽Cecropin D的表達,為了獲得穩(wěn)定高效表達抗菌肽⑶的酵母工程菌，本發(fā)明通過不同濃度ZeocinTM抗性篩選高拷貝質(zhì)粒，通過碳源、氮源、發(fā)酵罐溶氧量、PH值及表達時間對發(fā)酵條件進行了摸索，為篩選高效穩(wěn)定表達CD工程菌奠定了基礎，而且本發(fā)明表達抗菌肽⑶的表達載體為PGAPZ α Α,此載體不需要甲醇誘導，從而使表達更加方便，且表達量更高。具體抗菌肽Cecropin D (⑶)的表達純化方法如下:
(I)基因序列合成:通過The Antimicrobial Peptide Database (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)查找到抗菌肽⑶的氨基酸序列，根據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子偏嗜性優(yōu)化密碼子，設計引物，為了使表達產(chǎn)物分泌到細胞外且形成天然N端以保證其活性，設計引物時在5'端加入AAAAGA Kex2蛋白酶切位點。
[0019]設計的兩對引物Pl和P2，P3和P4序列如下:
引物 Pl (SEQ ID N0.2 所示)
CCATTCAAGGAGTTGGAGAGAGCTGGTCAAAGAGTCAGAGACGCTATCATCTCCGCT ；
引物 P2 (SEQ ID N0.3 所示)
CAAAGCGGTAGCTTGAGCGACGGTAGCGACAGCTGGACCAGCGGAGATGATAGCGTC。
[0020]引物P3 (SEQ ID N0.4 所示)
CCCTCGAGAAAAGATGGAACCCATTCAAGGAGTTGGAG ；
引物 P4 (SEQ ID N0.5 所示)
GCTCTAGATTAGTTCTTAGCCAAAGCGGTAGCTTGAGCo
[0021]通過引物互為模版融合PCR合成⑶基因序列。
[0022](2)克隆轉(zhuǎn)化:將合成得到的⑶基因序列克隆到酵母表達載體pGAPZ a A (購自Invitrogen公司)中，構(gòu)建pGAPZ a A-CD重組酵母表達載體，線性化后300V、200Q電擊15ms轉(zhuǎn)化入酵母表達宿主菌SMDl 168 (購自Invitrogen公司),線性化酶為Avr II,構(gòu)建重組酵母表達工程菌。
[0023](3)轉(zhuǎn)化子篩選:經(jīng)不同濃度Zeocin?的YPDS平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，用于高效表達目的蛋白。
[0024](4)表達:用滅菌槍頭挑篩選到的具有Zeocin?抗性的單菌落，于5mL的YPD液體培養(yǎng)基中進行一級培養(yǎng)，30°C，200 r/min振蕩過夜，至0D_=2?6，即細胞處于對數(shù)生長期。取ImL —級培養(yǎng)液,重懸于50mL的YPD液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報紙包扎，培養(yǎng)約72小時，離心收集上清。
[0025](5)純化:His-tag柱子過柱純化上清，純化產(chǎn)物即為抗菌肽⑶，分裝，_80°C保存。
[0026]實驗結(jié)果顯示,本發(fā)明所述方法制得的抗菌肽Cecropin D有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成為新型的防治豬藍耳病的生物活性分子，為抗菌肽Cecropin D抗病毒作用的研究提供了先決條件，而且為抗菌肽Cecropin D的推廣應用提供了理論基礎。
[0027]本