硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗動物病毒藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于獸藥應用【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗動物病毒藥物中的應用，尤其涉及在制備抗豬流感病毒、豬藍耳病病毒以及豬偽狂犬病毒藥物的應用。本發(fā)明所述藥物抗病毒譜廣，有效率高，安全無毒副作用，無殘留，且能夠減少或替代抗生素使用，屬于新型抗病毒藥物，具有良好應用開發(fā)前景。
【專利說明】硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗動物病毒藥物中的應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥應用【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗動物病毒 藥物中的應用，尤其涉及在制備抗豬流感病毒、豬藍耳病病毒以及豬偽狂犬病毒藥物的應 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，動物疾病發(fā)病率越來越高，尤其是病毒性 疾病發(fā)病率日益升高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。盡管疫苗免疫在一定程度上能夠預 防此類疾病的發(fā)生，但由于病原菌日益加快的變異速度和新型超級病原微生物的出現(xiàn)，往 往使已研制出的疫苗在預防上效果不佳或是研制出的疫苗跟不上病原菌變異的速度，產(chǎn)生 生產(chǎn)與應用間的脫節(jié)?？股仡愃幬镫m然能夠顯著抑制或殺滅病原微生物，但抗生素長期 不科學使用，使病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時其在畜產(chǎn)品中產(chǎn)生的嚴重藥物殘留容易產(chǎn)生抗藥 性，對畜禽疫病的防治和人類的健康產(chǎn)生不良影響。因此，開發(fā)新型的綠色安全無公害，無 毒副作用，無藥物殘留，無耐藥性的抗生素替代品已成為當前畜牧獸醫(yī)科學家研究的熱點。
[0003] 近年來，酵母β -葡聚糖作為一種抗生素替代品越來越受到人們的關(guān)注，它具有 增強免疫活力、抗腫瘤活性、降低膽固醇和血脂等多種生理功能。研究報道通過化學修飾的 方法可以提高其功效，其中經(jīng)硫酸化修飾后，會使其具有或加強抗病毒活性。相關(guān)文獻報道 某些多糖對皰疹病毒、艾滋病病毒等病毒具有良好的抑制作用，且具有活性的多糖主要成 分為硫酸多糖。經(jīng)人工硫酸酯化修飾可使原來不含有硫酸根或硫酸根含量低的多糖表現(xiàn)出 較強的抗病毒活性。如作為抗腫瘤輔助治療制劑的香菇多糖本身不具抗HIV活性，硫酸酯 化修飾后則具有顯著的抗HIV活性。另外，酵母葡聚糖屬食品添加劑，已廣泛應用食品加 工，無任何殘留，因此，研究硫酸酯化酵母葡聚糖潛在的抗病毒活性，提高生物利用度， 拓寬新劑型臨床應用范圍，是未來新型抗生素替代品研究的重要發(fā)展方向。
[0004] 豬流感病毒（Swine influenza virus)是一種可引起豬急性、群發(fā)性呼吸道傳染 病病原，該病臨床以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難為特征。目前，臨床上流行血清型包括H1N1、 H3N2及H1N2等，2009年甲型流感主要為H1N1血清型，該病不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大危害，更 造成了公共衛(wèi)生安全事件。目前，對于該病的防治，國內(nèi)尚未有商品化疫苗，臨床應用主要 采用常規(guī)抗病毒藥物，但是這些常規(guī)的抗病毒藥物普遍存在病毒突變產(chǎn)生抗藥性，體內(nèi)的 低效率和毒副作用等問題?？共《警熜植焕硐?。因此尋找和開發(fā)新的抗病毒制劑成為 人們所關(guān)注的問題。
[0005] 豬藍耳病病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的俗稱，可引起豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、 早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎，各種年齡豬(特別是仔豬）呼吸障礙為特征的高度傳染性疾 病?；疾∝i和帶毒豬是本病的重要傳染源。該病主要傳播途徑是接觸感染、空氣傳播和精 液傳播，也可通過胎盤垂直傳播。易感豬可經(jīng)口、鼻腔、肌肉、腹腔、靜脈及子宮內(nèi)接種等多 種途徑而感染病毒，豬感染病毒后2?14周均可通過接觸將病毒傳播給其他易感豬。持續(xù) 性感染是豬藍耳病流行病學的重要特征，住藍耳病毒可在感染豬體內(nèi)存在很長時間，長期 危害養(yǎng)豬生產(chǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
[0006] 豬偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV)可引起多種動物共患的急性病毒性傳 染病。本病的特點是侵害豬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和引起豬的皮膚瘙癢。對2周齡以內(nèi)仔豬致死 率可達100%。成年豬多為隱性感染，也可出現(xiàn)發(fā)熱、精神沉郁癥狀，有些豬嘔吐、咳嗽。新 生仔豬、哺乳仔豬發(fā)病癥狀明顯，病豬高熱、嘔吐、食欲廢絕、呼吸急促，有神經(jīng)癥狀，興奮， 叫聲撕啞，無目的前進或轉(zhuǎn)圈，繼而出現(xiàn)肌肉痙攣、四肢麻痹，臥地、四肢做游泳狀態(tài)運動。 妊娠母豬可出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎、死胎、弱胎。公豬感染后可出現(xiàn)睪丸腫脹或萎縮，喪失種 用能力，母豬感染后可出現(xiàn)不育癥，嚴重影響種豬場生產(chǎn)及優(yōu)良品種的推廣，給養(yǎng)豬業(yè)造成 極大的損失。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了硫酸酯化酵母β -葡聚糖在制備抗動物病毒藥物中的應用。
[0008] 具體包括： 硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗Η1Ν1豬流感病毒藥物中的應用；其中所用硫酸酯化 酵母β -葡聚糖IC50為1. 72mg/ml。
[0009] 硫酸酯化酵母β -葡聚糖在制備抗豬藍耳病毒藥物中的應用；其中所用硫酸酯化 酵母β -葡聚糖IC50為0· 62mg/ml。
[0010] 硫酸酯化酵母β -葡聚糖在制備抗豬偽狂犬病毒藥物中的應用；其中所用硫酸酯 化酵母β -葡聚糖IC50為2. 03 mg/ml。
[0011] 典型例子為：配制l〇mg/ml的硫酸酯化酵母β-葡聚糖藥物制劑溶液，它是將lg 硫酸酯化酵母β -葡聚糖，溶解在l〇〇ml注射溶水，115°C，20min。
[0012] 另一個典型例子為：配制5mg/ml的硫酸酯化酵母β -葡聚糖藥物制劑溶液，方法 如下：稱取0. 5g硫酸酯化酵母β -葡聚糖，溶解在100ml注射溶水，115°C，20min。
[0013] 本發(fā)明人曾在第三屆京津冀畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新研討會公開過硫酸酯化酵母 β -葡聚糖對小鼠抗H1N1豬流感病毒感染研究思路，本次會議征集論文主題為"新思想、 新方法、新觀點"。本論文主要說明的是硫酸酯化酵母β_葡聚糖具有潛在的抗病毒作用這 個思路，但尚未公開任何試驗數(shù)據(jù)，并不能支持該觀點成立與否，且這部分研究為體內(nèi)抗病 毒，與本發(fā)明申請體外抗病毒研究相互補充，且具有相對獨立性。
[0014] 為更加準確的確定本發(fā)明的應用效果，本發(fā)明人進行了如下的試驗： 試驗一： 硫酸酯化酵母β -葡聚糖抗Η1Ν1豬流感病毒的藥效研究 1材料和方法 1. 1毒株豬流感病毒Η1Ν1株由本實驗室分離鑒定。
[0015] 1.2雞胚9-11日齡雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。
[0016] 1.3藥物硫酸酯化酵母葡聚糖，本實驗室前期制備，并已發(fā)表相關(guān)文章(苯 酚-硫酸法測定硫酸酯化酵母葡聚糖含量，動物醫(yī)學進展，2011，9)。金剛烷胺購自沈陽康 芝制藥有限公司。
[0017] 2試驗方法 2. 1藥物準備 配制50mg/ml的硫酸酯化酵母β -葡聚糖藥物制劑溶液，同時配制5mg/ml金剛燒胺藥 物制劑溶液。按照2倍比例逐次稀釋，高壓滅菌，制備一系列不同濃度藥物。
[0018] 2. 2藥物對雞胚毒性試驗 將不同稀釋度試藥物接種雞胚尿囊腔，〇. 5ml/胚，作5個重復，同時設生理鹽水空白對 照。置37°C恒溫箱孵育，每天觀察雞胚死亡或發(fā)育情況，棄掉24小時內(nèi)死亡的雞胚。
[0019] 2.3藥物在雞胚內(nèi)抗豬流感病毒的試驗 先后將不同稀釋度藥物與等量100EID50病毒液注入雞胚后，0. 2mL/枚，作5個重復。 同時設立病毒陽性對照和生理鹽水陰性對照。37°C恒溫培養(yǎng)，連續(xù)3天觀察雞胚存活情況， 然后置于4°C冰箱過夜，次日收取胚蛋尿囊腔液，測定雞胚尿囊液的血凝（HA)效價。
[0020] 結(jié)果與分析 3. 1藥物對雞胚毒性試驗結(jié)果 在實驗過程中，當硫酸酯化酵母β -葡聚糖藥物用量達15mg/胚時，雞胚出現(xiàn)致死現(xiàn) 象。發(fā)明藥物半數(shù)致死量LD50為40. 23mg/胚。而對照藥物金剛烷胺半數(shù)致死量LD50為 19. 78mg/胚。在給藥劑量小于10mg/胚時，未見藥物對雞胚發(fā)育產(chǎn)生不良影響。在雛雞整 個發(fā)育過程中，未見異?，F(xiàn)象。結(jié)果表明，硫酸酯化酵母β-葡聚糖雞胚發(fā)育毒性極低。
[0021] 3. 2藥物在雞胚內(nèi)抗豬流感病毒的試驗結(jié)果 由表1、表2可以看出，在樣品濃度達1.72mg/胚時，病毒抑制率可達50%以上。硫酸 酯化酵母β -葡聚糖抗H1N1豬流感病毒的藥效優(yōu)于金剛烷胺，且毒性極低，其治療指數(shù)TI 明顯高于金剛烷胺。
[0022] 表1硫酸酯化酵母β -葡聚糖抗Η1Ν1豬流感病毒的實驗結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗動物病毒藥物中的應用。
2. 硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗Η1Ν1豬流感病毒藥物中的應用；其中所用硫酸 酯化酵母β -葡聚糖IC50為1. 72mg/ml。
3. 硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗豬藍耳病毒藥物中的應用；其中所用硫酸酯化酵 母 β -葡聚糖 IC50 為 0· 62mg/ml。
4. 硫酸酯化酵母β-葡聚糖在制備抗豬偽狂犬病毒藥物中的應用；其中所用硫酸酯化 酵母β -葡聚糖IC50為2. 03 mg/ml。
【文檔編號】A61K31/737GK104095873SQ201410382428
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】孫英峰, 韓偉, 李秀麗, 張莉, 路超, 任衛(wèi)科, 馮婧, 楊春蕾, 田向?qū)W, 李富強, 王英珍, 張健, 王成龍 申請人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所