專利名稱：一種制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化制備領(lǐng)域。涉及到利用膨化技術(shù)與酸堿溶液處理相結(jié)合制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖生物的エ藝。
背景技術(shù)：
酵母是ー種重要的食品エ業(yè)微生物，其細(xì)胞壁從外向內(nèi)分三層，分別為甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖。最里層的葡聚糖有三類堿溶性葡聚糖，堿不溶、酸可溶性葡聚糖，酸堿不溶性葡聚糖，其中酸堿不溶性葡聚糖即為活性多糖，除含有少量的β- 1，6鍵外，幾乎都是β _ 1，3鍵，因此也稱(I, 3)-匍聚糖。酵母β _1，3- D-匍聚糖能增強(qiáng)哺乳動物的免疫力、抗癌、抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、降低膽固醇和血脂、促進(jìn)傷ロ愈合等，是ー種良好的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑。酵母β -I, 3-D-葡聚糖因其難溶性在抗腫瘤等的臨床應(yīng)用上受到限制，其高度的粘性、持水性和熱穩(wěn)定性以及制備エ藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)、造紙和建筑材料等行業(yè)中廣泛應(yīng)用。從酵母細(xì)胞中提取β_1，3- D-葡聚糖就是要從細(xì)胞壁中去除甘露聚糖和蛋白質(zhì)。酵母細(xì)胞壁是β -I, 3-D-葡聚糖的ー個主要來源，早在1939年人們就提出啤酒酵母具有免疫增強(qiáng)特性，但直到I960年才研究發(fā)現(xiàn)提供免疫特性的主要因素是存在于酵母細(xì)胞壁的葡聚糖成分，約占啤酒酵母干重的15%。葡聚糖構(gòu)象對其活性的影響并非主要的，β -I, 3-糖苷鍵才是其具有抗腫瘤活性的關(guān)鍵。堿不溶性葡聚糖的低水溶性限制了它在臨床上的應(yīng)用。雖然ロ服通常不會產(chǎn)生毒副作用，但靜脈注射就可能產(chǎn)生ー些無法估計的毒副作用，例如肝脾腫大，微血栓形成，循環(huán)系統(tǒng)崩潰、炎性肉芽腫形成等。因此需要對β-l，3-D-葡聚糖進(jìn)行衍生化改性，獲得水溶 性良好且具有免疫活性的羧甲基葡聚糖。β -I, 3-D-葡聚糖的衍生化就是在分子表面取代一定的親水基團(tuán)，增加水溶性并且保持或加強(qiáng)其免疫活性。目前所應(yīng)用的衍生化手段很多，主要有羧甲基化，羧こ基化，乙基化，磺基化，羧基化等。其方法是選擇不同的底物，在一定的介質(zhì)中，控制一定的反應(yīng)條件使葡萄糖基上的羥基被底物基團(tuán)所取代。難點(diǎn)是控制得到一定取代度葡聚糖，使該衍生物能夠溶于水而且不破壞它原來的螺旋結(jié)構(gòu)，正是這種構(gòu)型，使得它具有特殊的活性。比較各種衍生化方法，羧甲基化條件比較容易控制。羧甲基化衍生物在取代度DS=O. 75時，顯示出最高的活性，當(dāng)DS>1.0或分子量較低時，則沒有活性。羧甲基葡聚糖與葡聚糖相比具有更強(qiáng)的溶解性和免疫激活效應(yīng)，能夠加強(qiáng)機(jī)體的非特異性防御功能如巨噬細(xì)胞活化功能，促進(jìn)TNF-α合成，同時對動物機(jī)體也顯示了潛在的抗病毒，防輻射和抗突變的能力，能保護(hù)大鼠肝細(xì)胞免受氧化損傷。葡聚糖水溶性衍生物同時具有顯著的抗腫瘤活性。羧甲基葡聚糖可以使內(nèi)毒素血癥動物腫瘤壞死因子水平顯著降低，能夠抑制小鼠肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)外采取的提取方法主要有酸法、堿法、酸堿綜合法等，這些方法的提取條件一般都比較劇烈，酸堿試劑容易腐蝕儀器設(shè)備、對環(huán)境污染嚴(yán)重，得到的葡聚糖成品純度不高，需要進(jìn)ー步純化。堿破壁法構(gòu)成酵母細(xì)胞壁的葡聚糖有兩層一層是可以被堿水解的，另ー層則不溶于堿。當(dāng)利用堿溶液對酵母進(jìn)行破壁吋，堿可以溶解掉酵母細(xì)胞壁中的堿可溶性葡聚糖層，同時溶解部分脂類，從而使酵母細(xì)胞壁的通透性變大，胞內(nèi)物質(zhì)容易析出。本實(shí)驗(yàn)采用自溶后的酵母殘渣，外加膨化解除去大量的蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，降低后續(xù)堿處理工序中堿液濃度和用量，以便在較溫和的條件下盡量保持葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)完整，提高堿不溶性葡聚糖成品的得率及純度，為啤酒廢酵母的綜合利用提供理論依據(jù)。在國內(nèi)外報道中，關(guān)于β- 1，3- D-葡聚糖的制備，多采用酸、堿或與有機(jī)溶劑相結(jié)合的方法。曾有人分別用Sevage法、酸法和堿法進(jìn)行對比、測試，發(fā)現(xiàn)用Sevage法難以從啤酒酵母中提取i3-l，3_D-葡聚糖；酸法浸提所得的粗多糖得率高，但含大量甘露聚糖及蛋白質(zhì)，純度不高，エ藝過于復(fù)雜，且酸法腐蝕設(shè)備，危害工人健康；堿法浸提エ藝簡單，產(chǎn)品為較高純度的β_1，3-D-葡聚糖，是從廢酵母中有效β- 1,3- D-葡聚糖的理想途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了提供一種制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖的方法，本發(fā)明的方法利用膨化技術(shù)與酸堿溶液處理相結(jié)合制備酵母β -I, 3-D-葡聚糖生物，不僅可大大節(jié)約制備1，3- D-葡聚糖的時間，而且降低提取成本。本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明的方法是通過以下步驟來實(shí)現(xiàn)的
Α、采用下列(a)或(b)方法進(jìn)行堿處理和膨化；
a、堿處理取啤酒酵母IOOg加入200-300ml的IM氫氧化鈉，在溫度80_100°C條件下作,2h后,在3000r/min的速度下離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀物；膨化將所述沉淀物放入微波爐中膨化，微波處理火力為高火，微波處理時間為10分鐘；
b、雙螺桿膨化機(jī)膨化以啤酒酵母為原料，按每IOOg啤酒酵母加1-1.5M氫氧化鈉15—20ml，在拌勻條件下緩緩加入膨化機(jī)，螺桿轉(zhuǎn)速30HZ，膨化溫度120_130°C;所述膨化機(jī)為雙螺桿膨化機(jī)；
B、中和處理將步驟I所得膨化進(jìn)行降溫處理，當(dāng)其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為20%的こ酸進(jìn)行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0時為止。C、分離將步驟2所得中和液在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下進(jìn)行離心分離，收集、合并離心液；加熱真空濃縮至原體積的一半，然后加入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇；
D、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35°C下攪拌O. 5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應(yīng)3 h，反應(yīng)產(chǎn)物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
E、按質(zhì)量質(zhì)量體積=1:1.25:1. 25取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸，，放入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3h、堿化溫度35°C、堿化時間
O.5 h條件下進(jìn)行反應(yīng)；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的方法采用膨化輔助提取明顯地縮短了提取時間，并且提高了多糖的提取率，優(yōu)于其它提取方法；采用輔助法提取多糖產(chǎn)量較其他エ藝高，優(yōu)化工藝科學(xué)可行，這樣加快了羧甲基葡聚糖的制備速度，為啤酒廢酵母多糖的藥物開發(fā)和保健品的應(yīng)用提供幫助；不僅可大大節(jié)約制備1，3- D-葡聚糖的時間，而且可降低提取成本。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)ー步描述
本發(fā)明的エ藝如下
啤酒廢酵母堿溶解一微波破碎(或雙螺桿膨化機(jī)膨化破碎)一離心一上清液濃縮一加醇沉淀一羧甲基化一真空干燥一羧甲基葡聚糖。實(shí)施例I :
1、堿處理取IOOg酵母加IM氫氧化鈉200-300ml，在溫度80_100°C條件下作用2h后， 在3000r/min的速度下離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀；
2、微波膨化將沉淀收集的堿處理過的酵母放入微波爐中膨化，微波處理火力為高火，微波處理時間為8分鐘；注意控制微波處理火力和時間，膨化期間，用微波專用勺翻動酵母，使其受熱均勻；
3、中和處理將步驟2所得膨化進(jìn)行降溫處理，當(dāng)其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為20%的こ酸進(jìn)行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0吋；
4、分離將中和液在轉(zhuǎn)速4000 r/min下進(jìn)行離心分離，收集、合并離心液，加熱真空濃縮至原體積的一半,然后加入其2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇；
5、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35で下攪拌0.5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應(yīng)3 h，反應(yīng)產(chǎn)物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
6、取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸投料比為I:I. 25:1. 25 (質(zhì)量/質(zhì)量/體積)，放入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3 h、堿化溫度35°C、堿化時間O. 5 h條件下進(jìn)行反應(yīng)；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。實(shí)施例2:
1、堿處理100g酵母加IM氫氧化鈉200-300ml，溫度80-100°C，作用2h后3000r/min離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀；
2、雙螺桿膨化機(jī)膨化沉淀收集的酵母，緩緩加入膨化機(jī)膨化，螺桿轉(zhuǎn)速30HZ，膨化溫度120-130°C。膨化機(jī)為雙螺桿膨化機(jī)，螺桿轉(zhuǎn)速30HZ，膨化溫度可控；
3、中和處理將1，2上述提取物進(jìn)行降溫處理，當(dāng)其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為20%的こ酸進(jìn)行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0時為止；
4、分離將中和液在轉(zhuǎn)速4000 r/min下進(jìn)行離心分離，收集、合并離心液，加熱真空濃縮至原體積的一半,然后加入其2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇；
5、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35°C下攪拌O. 5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應(yīng)3 h，反應(yīng)產(chǎn)物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
6、取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸投料比為I:1.25 1.25 (質(zhì)量/質(zhì)量/體積)，放入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3h、堿化溫度35°C、堿化時間O. 5 h條件下進(jìn)行反應(yīng)；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。
權(quán)利要求
1.一種制備酵母β- 1,3- D-葡聚糖衍生物的制備方法，其特征在干所述方法是通過以下步驟來實(shí)現(xiàn)的 Α、采用下列(a)或(b)方法進(jìn)行堿處理和膨化； a、堿處理取啤酒酵母IOOg加入200-300ml的IM氫氧化鈉，在溫度80_100°C條件下作用2h后,在3000r/min的速度下離心15min,水洗2遍,過濾離心,收集沉淀物；膨化將所述沉淀物放入微波爐中膨化，微波處理火力為高火，微波處理時間為10分鐘； b、雙螺桿膨化機(jī)膨化以啤酒酵母為原料，按每IOOg啤酒酵母加1-1.5M氫氧化鈉15-20ml，在拌勻條件下緩緩加入膨化機(jī)，螺桿轉(zhuǎn)速30HZ，膨化溫度120_130°C ； B、中和處理將步驟I所得膨化進(jìn)行降溫處理，當(dāng)其溫度低于50°C吋，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為20%的こ酸進(jìn)行中和，こ酸加入量為使提取物的pH值降低至7.0時為止； C、分離將步驟2所得中和液在轉(zhuǎn)速4000 r/min下進(jìn)行離心分離，收集、合并離心液；加熱真空濃縮至原體積的一半，然后加入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇； D、羧甲基化制備將步驟3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氫氧化鈉混合均勻，35で下攪拌0.5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C條件下攪拌反應(yīng)3 h，反應(yīng)產(chǎn)物用95%こ醇洗滌，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥； E、按質(zhì)量質(zhì)量體積=1:1. 25:1. 25取葡聚糖、氫氧化鈉、ー氯こ酸，放入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的こ醇溶液中，在醚化溫度50°C、醚化時間3h、堿化溫度35°C、堿化時間O.5 h條件下進(jìn)行反應(yīng)；在此エ藝條件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度為O. 79。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備酵母β-1,3-D-葡聚糖衍生物的制備方法，所述方法利用膨化技術(shù)與酸堿溶液處理相結(jié)合制備酵母β-1,3-D-葡聚糖生物，不僅可大大節(jié)約制備β-1,3-D-葡聚糖的時間，而且降低提取成本。
文檔編號A61P31/12GK102690368SQ201210199499
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者郭宏昌 申請人:郭宏昌