通過天然感受態(tài)轉化屬于鏈球菌屬的細菌的方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2010年6月23日，題為"通過天然感受態(tài)轉化屬于鏈球菌屬的 細菌的方法"的中國專利申請201080028500. 6的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及通過天然感受態(tài)（competence)轉化屬于鏈球菌屬（Streptococcus genus)的細菌的方法。
【背景技術】
[0003] 嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus)廣泛用于制造酸乳酪（yoghurt)和 瑞士型或意大利型干酪。這些產(chǎn)品具有每年大約四百億美元的市場價值，從而使嗜熱鏈球 菌成為具有巨大市場重要性的物種。即使該細菌的發(fā)酵性質(zhì)已經(jīng)通過篩選和傳統(tǒng)方法得到 逐步改善，但仍然具有通過天然方法或通過遺傳工程進一步改善的巨大潛能。為了能夠不 使用任何遺傳工程技術而天然改善嗜熱鏈球菌技術性能、生理性質(zhì)，在不同培養(yǎng)基中的行 為對于發(fā)酵食品和飼料業(yè)非常重要。所獲得的嗜熱鏈球菌改良株將完全順從于與用于食品 和飼料的活微生物相關的當前所有的調(diào)節(jié)。
[0004] 當前可利用的嗜熱鏈球菌基因組序列的計算機（insilico)分析提示，通過橫向 基因轉移獲得許多基因（1)。如在使用感受態(tài)作為用于基因組可塑性的整體機制的病原性 鏈球菌中所報道的，這些橫向基因轉移潛在地通過被稱為感受態(tài)的天然轉化而發(fā)生。
[0005] 感受態(tài)是細胞從其環(huán)境中攝取細胞外（"裸")DNA并將該DNA(或其部分）整合在 其基因組中的能力。感受態(tài)可以分為天然感受態(tài)和人工感受態(tài)。天然感受態(tài)是細菌菌株在 遺傳上具有執(zhí)行該DNA攝取的特定能力。天然感受態(tài)被認為是在天然環(huán)境中自發(fā)發(fā)生，并 且還在實驗室環(huán)境中觀察到天然感受態(tài)。天然感受態(tài)似乎是鏈球菌的共同特征（2, 3)。與 之相比，人工感受態(tài)在實驗室環(huán)境下激發(fā)并由使裸DNA能夠瞬時透過細胞組成。
[0006] 因此，天然基因轉化是通過天然感受態(tài)使給定細菌菌株能夠被轉化，即被修飾從 而將多核苷酸整合至其基因組的過程。
[0007] 在肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)中對鏈球菌的天然感受態(tài)進行了最 深入的研宄，并且發(fā)現(xiàn)鏈球菌的天然感受態(tài)似乎是鏈球菌種的共同特征。感受態(tài)通常受到 嚴格調(diào)節(jié)并且包括兩組基因：早期感受態(tài)基因和晚期感受態(tài)基因（4)。在肺炎鏈球菌中，天 然感受態(tài)是依賴于培養(yǎng)基中信息素（CSP)的積累的瞬時事件。早期感受態(tài)基因編碼二組分 系統(tǒng)（TCS:ComD和ComE)，其同族誘導因子（CSP:ComC)和旨在CSP輸出和熟化的ABC轉運 子的組分（ComA和ComB)。CSP誘導時，TCS活化感受態(tài)〇因子ComX(〇X)的轉錄。該選 擇性〇因子由于正調(diào)節(jié)DNA攝取、保護和整合至染色體所需的所有重要的晚期基因，而是 天然感受態(tài)的核心調(diào)節(jié)子。參見圖1的圖示。
[0008] 在嗜熱鏈球菌（S.thermophilus)基因組中發(fā)現(xiàn)了推定的comX基因和組裝對嗜 熱鏈球菌天然感受態(tài)至關重要的所有晚期感受態(tài)基因的其他基因（1)。此外，計算機鑒定 中公認為 〇x的推定"ComX-盒"在含有至關重要的晚期感受態(tài)基因的所有操縱子的上游。 用于天然感受態(tài)的所有至關重要基因在嗜熱鏈球菌中的這種維持提示其在嗜熱鏈球菌生 態(tài)龕位中發(fā)揮重要的生理性功能（將DNA用作養(yǎng)分、基因組可塑性…）（1)。在2006年， Havarstein(5)小組通過使用遺傳工程學方法發(fā)現(xiàn)天然感受態(tài)在嗜熱鏈球菌LMG18311中 的功能性。這通過使用包含在調(diào)節(jié)肽誘導的啟動子控制下的comX的基于質(zhì)粒的系統(tǒng)而得 以實現(xiàn)（blp系統(tǒng)，（6))。顯著地，利用全部基因組DNA或者線性dsDNA以與肺炎鏈球菌類 似的效率實現(xiàn)了高轉化率（1(T3至1(T2) (5)。值得注意的是，在這種情況下，通過ComX的 遺傳工程化誘導使晚期感受態(tài)基因的人工誘導成為可能。然而并且令人驚訝的是，通常發(fā) 現(xiàn)于肺炎鏈球菌基因組中并且在天然感受態(tài)的誘導中發(fā)揮關鍵作用的早期感受態(tài)基因無 一存在于嗜熱鏈球菌基因組中。最近，證明嗜熱鏈球菌LMD-9能夠在在化學限定培養(yǎng)基中 生長的過程中誘導感受態(tài)。在LMD-9菌株中，發(fā)現(xiàn)在這些條件下尤其需要轉運子Ami用于 comX的轉錄誘導（7)。Ami系統(tǒng)主動將細胞外培養(yǎng)基中存在的寡肽輸入并已知在革蘭氏陽 性菌中具有營養(yǎng)和信號轉導的功能（7, 8, 9)。由于這種化學限定培養(yǎng)基是不含肽的培養(yǎng)基， Gardan等人（7)預言在這些生長條件下，細菌合成并分泌特定的感受態(tài)刺激肽，然后通過 Ami系統(tǒng)感受到該感受態(tài)刺激肽并再次輸入。內(nèi)化后，該現(xiàn)象然后與特定的胞質(zhì)調(diào)節(jié)子相互 作用，導致comX的轉錄誘導（模型可參見圖2)。在化學限定培養(yǎng)基條件下負責comX表達 和天然轉化的信息素和轉錄調(diào)節(jié)子仍不可知。
[0009] 雖然化學限定培養(yǎng)基中的天然轉化對于LMD-9菌株非常有效（10_4至10_3)， LMG18311菌株的轉化率顯著較低（1(T至1(T6)。此外，在化學限定培養(yǎng)基中生長的 CNRZ1066菌株的情況下，可能檢測不到轉化子（轉化率< 1(T8) (7)。據(jù)發(fā)明人了解，目前沒 有不使用遺傳工程而在嗜熱鏈球菌的菌株中誘導天然感受態(tài)的成功報道。
[0010] 現(xiàn)有技術仍然需要在鏈球菌中、優(yōu)選嗜熱鏈球菌和/或唾液鏈球菌 (Streptococcussalivarius)中誘導天然感受態(tài)的方法，和使用全世界公認的非GM0技術 轉化所述細菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了新的疏水短肽Shp316,其具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序 列，并且參與嗜熱鏈球菌菌株的天然感受態(tài)。此外，本發(fā)明人還證明了該肽的片段能夠在屬 于鏈球菌屬的細菌中誘導天然感受態(tài)。
[0012] Shp316具有以下氨基酸序列：
[0013] MKTLKIFVLFSLLIAILPYFAGCL(SEQIDN0:l)〇
[0014] 因此，本發(fā)明涉及具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列或與SEQIDNO: 1具有至 少75%的同一性的肽或者所述肽的片段，其中所述肽或其片段能夠在嗜熱鏈球菌菌株中誘 導或提高感受態(tài)。
[0015] 通常，所述肽或其片段能夠在編碼SEQIDNO: 1的基因已被失活的嗜熱鏈球菌菌 株LMD-9中誘導或提高感受態(tài)。
[0016] 在本申請中，"本發(fā)明的肽"的表述涵蓋具有氨基酸序列SEQIDNO: 1的肽、具有與 SEQIDN0:1具有某種相似性（至少75%的同一性）的氨基酸序列的肽和其片段（還稱為 "成熟"肽）。本發(fā)明的肽的實例公開在附文III中。
[0017] 在提及肽時，"能夠在編碼SEQIDNO: 1的基因已被失活的嗜熱鏈球菌菌株LMD-9 中誘導或提高感受態(tài)"的表述是指能夠在實驗A中將轉化率提高至少10倍，優(yōu)選至少50 倍，至少100倍，甚至更優(yōu)選至少1000倍的任何肽。
[0018] 按照實施例中和以下的描述進行測定肽誘導或提高感受態(tài)的能力的實驗A:
[0019] 將shp316基因（編碼肽Shp316的基因）已失活的LMD-9的突變株，例如LMD9-A blp: :P_x-luxABAshp316: :P32-cat(該菌株的詳細信息參見實施例2)在M17-乳糖培養(yǎng)基 中預培養(yǎng)。收集預培養(yǎng)的細胞（5000g，9分鐘，20°C)并在化學限定培養(yǎng)基（CDM，參見附文 I)中洗滌2次，然后重懸在CDM中。將洗滌后的細胞稀釋在新鮮的CDM培養(yǎng)基中以獲得在 600nm為0.05的光密度，然后在37°C孵育。孵育1.5小時后，將培養(yǎng)基分為2份試樣，每份 10mL，并將0或1000nM肽加入至所述培養(yǎng)樣本中。最后，將10mL的每個試樣分成兩個樣本， 每個樣本5mL。所述2個樣本之一接受1yg/mLpGIUD0855ery(具有紅霉素抗性基因的質(zhì) 粒）。通過進行實施例1所述的天然轉化實驗研宄樣本的感受態(tài)表型。培養(yǎng)培養(yǎng)物6小時 并將系列稀釋液鋪在含有或不含2. 5yg/mL紅霉素的M17-乳糖瓊脂培養(yǎng)基的表面。針對 每個樣本計算存在或不存在所述肽時的轉化率，并用總細菌群中的紅霉素抗性細胞的比例 表不。
[0020] 如果在所述肽存在下的轉化率與不存在所述肽的轉化率之比為至少10,優(yōu)選至少 50,更優(yōu)選至少100,甚至更優(yōu)選至少1000,則認為所述肽已經(jīng)誘導或提高了其中的shp316 基因已失活的LMD-9菌株的感受態(tài)。
[0021] 本發(fā)明的肽與SEQIDNO: 1可具有至少75%同一性，優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至 少79%同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至少83%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQIDNO: 1 具有至少87%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至少91 %同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ IDNO: 1具有至少95%同一性。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列：AGCL或 TGCL〇
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列： PYFAGCL、LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL或PYFTGCL。
[0024] 在特定的實施方式中，所述多肽具有以下氨基酸序列： MKTLKIFVLFSLLIPILPYFAGCL(SEQIDN0:2)〇
[0025] 該序列與SEQIDNO: 1具有高于95%的同一性。推定該肽來自嗜熱鏈球菌菌株 CNCM1-2423 的基因組，該菌株由RhodiaFoodSAS(B.P. 10,Z.A.deBuxi紅es, 86220Dan g6-Saint_Romain)于2000年4月5日保藏在法國微生物保藏中心（CNCM)(Collection NationaledeCulturesdeMicroorganismes, 28rueduDocteurRoux, 75724ParisCEDEX 15,France)，保藏號為CNCM1-2423。
[0026] 在另一個具體的實施方式中，所述肽具有以下氨基酸序列：
[0027] MKKLKLFTLFSLLITILPYFTGCL(SEQIDN0:3)〇
[0028] 該序列與SEQIDN0:1具有高于79 %的同一性，與SEQIDN0:1具有高于 83 %的相似性。推定該肽來自現(xiàn)有技術已知的菌株唾液鏈球菌菌株SK126 (登錄號NZ_ ACL001000018)的基因組。
[0029] 因此，在具體的實施方式中，本發(fā)明的肽可以與SEQIDNO: 1具有至少79%相似 性，優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至少83%相似性，更優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至少87%相似 性，甚至更優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至少91 %相似性，甚至更優(yōu)選與SEQIDNO: 1具有至少 95 %相似性。
[0030] 通過使用基于化學相似性或氨基酸之間的進化距離的相似性打分矩陣測定兩