多肽、其生產(chǎn)方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體特別涉及一種祀向人肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)的多肽、其生產(chǎn)方法以及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的重大疾病。世界衛(wèi)生組織所屬的“國際癌癥研究機(jī)構(gòu)”(IARC)預(yù)計(jì)，2030年癌癥病例將達(dá)2140萬例，死亡將超過1320萬人。癌癥的治療與控制已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一個(gè)亟待解決的難題。癌癥治療的常用手段主要有手術(shù)切除、放療和化療，但這些常規(guī)療法常會帶來多種副作用，如手術(shù)切除難以對浸潤性腫瘤做到完全切除且易復(fù)發(fā)；放化療對患者的健康組織會造成損傷，也容易產(chǎn)生抗藥性。
[0003]鑒于常規(guī)治療手段的缺陷與副作用，在抗癌藥物研發(fā)領(lǐng)域，研究者們一直在致力于靶向治療藥物的研制。根據(jù)腫瘤發(fā)病機(jī)制以及涉及到的信號通路研制出的靶向治療藥物能精確且特異地靶向病灶，從而能夠有效治療腫瘤且大大降低對正常組織的副作用。
[0004]常見的抗腫瘤靶向治療藥物多是某影響腫瘤生長的細(xì)胞信號通路組分蛋白的單克隆抗體。目前已有多種靶向治療藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，也有藥物通過FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場。如VEGF的單克隆抗體巴伐單抗,商品名Avastin,能抑制腫瘤新生血管的形成達(dá)到抑制腫瘤的生長的目的；HER2受體的單克隆抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab),商品名Herceptin,能靶向治療HER2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。目前，單抗藥物的研發(fā)已成為了靶向治療藥物的研制的一個(gè)重要的方向，但抗體藥物研制的費(fèi)用極高，生產(chǎn)成本也高，因此，目前常用的單抗藥物價(jià)格也是極為昂貴的。另外，抗體的分子量大，對于結(jié)構(gòu)緊密的實(shí)體瘤難以滲透到內(nèi)部，這會影響其療效的發(fā)揮。因此，尋找新的靶向藥物分子是靶向藥物研發(fā)的一個(gè)重要的方向。
[0005]多肽篩選成本較低，篩選周期也較短，改造方便，因此在靶向藥物研制中備受關(guān)注。多肽分子量小，有較低的抗原性；且易于滲透進(jìn)入細(xì)胞間隙，便于發(fā)揮作用；另外能通過多個(gè)靶點(diǎn)的靶向多肽組合形成多靶向藥物，應(yīng)用前景良好。
[0006]惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道，惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道，血管或體腔等途徑，到達(dá)其他部位繼續(xù)生長，稱腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移給腫瘤的治療帶來極大的困難，因此，如何抑制或減緩腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤靶向治療研究的一個(gè)重要的課題。人的肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)所激活的受體c_Met介導(dǎo)的信號通路是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，已經(jīng)有多項(xiàng)研究證明C-Met通路的調(diào)節(jié)紊亂與受體或者配體的高表達(dá)有關(guān)，目前，已經(jīng)有研究者篩選到了 C-Met的單克隆抗體或者多肽，而HGF的抗體也已經(jīng)獲得。
[0007]鑒于靶向多肽在作為靶向藥物中的優(yōu)勢，篩選一種能夠靶向HGF的多肽具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一在于提供一種多肽，其具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，能特異性靶向結(jié)合與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)的信號通路組分一肝細(xì)胞生長因子，從而可以抑制HGF/c-Met信號通路相關(guān)的細(xì)胞遷移過程，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該多肽有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研發(fā)與制備中有廣泛的應(yīng)用前景。
[0009]本發(fā)明的目的之二在于提供用以編碼前述多肽的、分離的多核苷酸。
[0010]本發(fā)明的目的之三在于提供包含用以編碼前述多肽的多核苷酸的表達(dá)載體。
[0011]本發(fā)明的目的之三在于提供包含前述多核苷酸或前述載體的宿主細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明的目的之四在于提供前述多肽在制備腫瘤細(xì)胞檢測或診斷試劑盒的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的目的之五在于提供前述多肽在制備肝細(xì)胞生長因子靶向制劑的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的目的之五在于提供一種腫瘤細(xì)胞檢測或診斷試劑盒，其包含前述的多肽。
[0015]本發(fā)明的目的之六在于提供前述多肽在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的目的之七在于提供一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物組合物，其包含可藥用載體及前述的多肽。
[0017]關(guān)于本發(fā)明的具體內(nèi)容，將在下文結(jié)合附圖及相應(yīng)實(shí)施例做詳細(xì)解釋說明。
【附圖說明】
[0018]通過結(jié)合附圖進(jìn)行的示例性實(shí)施例的以下描述，本發(fā)明的這些和/或其他方面和優(yōu)點(diǎn)將變得清楚和更易于理解，其中:
圖1示出了前7輪篩選的PE熒光強(qiáng)度隨著富集的次數(shù)增加不斷加強(qiáng)的流式細(xì)胞儀記錄的等高線圖(PE指代藻紅蛋白受激發(fā)所發(fā)出的熒光，SSC指代流式細(xì)胞儀檢測的顆粒的側(cè)向散射光數(shù)據(jù)；eCPX為篩選中使用的細(xì)菌展示多肽庫原庫的自命名，Ml代表完成了一次磁珠分選，縮小了庫容的細(xì)菌展示多肽庫子庫，而F1-F6分別指代進(jìn)行了 I至6次熒光激活細(xì)胞分選術(shù)分選得到的庫容更小的子庫)。
[0019]圖2示出了在經(jīng)過較為嚴(yán)格的洗滌條件下，單克隆菌clone I以及clone 2所帶PE熒光的強(qiáng)度變化，間接地示出了兩個(gè)細(xì)菌單克隆與HGF結(jié)合的比例變化情況。
[0020]圖3示出了在孵育過程中使用不同的細(xì)胞因子干擾單克隆菌clone I和clone 2分別與HGF孵育后在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)合率匯總直方圖(BSA指代牛血清白蛋白，VEGF指代血管內(nèi)皮生長因子，bFGF指代堿性成纖維細(xì)胞生長因子，EGF指代表皮生長因子；另，圖中*表示該數(shù)據(jù)與HGF組比較有顯著性差異，0.01〈P〈0.05)。
[0021]圖4示出了使用MTT法檢測不同濃度的control p印tide，HGP-1和HGP-2多肽在獨(dú)立使用時(shí)對人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的抑制作用(**表示該組數(shù)據(jù)與HGF組比較有極顯著差異，P〈0.01)。
[0022]圖5示出了使用細(xì)胞劃痕法檢測不同濃度的control p印tide，HGP-1和HGP-2多肽在獨(dú)立使用時(shí)對人類黑色素瘤細(xì)胞系MDA-MB-435S遷移的抑制作用(**表示該組數(shù)據(jù)與HGF組比較有極顯著差異，P〈0.01)。
具體實(shí)施方案
[0023]根據(jù)本發(fā)明的具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所具有的氨基酸序列的多肽是通過細(xì)菌表面展示多肽庫和磁珠分選以及熒光激活細(xì)胞分選術(shù)篩選得到，得到的多肽可以與肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)特異性地結(jié)合，因此可望能夠運(yùn)用于靶向治療腫瘤遷移的靶向藥物研發(fā)中。
[0024]下面示例性實(shí)施例中未注明條件的實(shí)驗(yàn)方法可以按本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，例如，可以參照 Sambrook 等人的《Molecular cloning: a laboratory manual))(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
[0025]1.構(gòu)建細(xì)菌表面展示隨機(jī)肽庫
本發(fā)明所使用的細(xì)菌表面展示隨機(jī)肽庫是從美國加州大學(xué)圣巴巴拉分?；瘜W(xué)工程系的Patrick S.Daugherty實(shí)驗(yàn)室獲得。本實(shí)施例中選擇大腸桿菌MC1061 [F_araD139D (ara-leu) 7696 galE15 galK16 D (lac) X74 rpsL (StrR) hsdR2 (rK-mK]3) mcrA mcrBl](Casadaban and Cohen, 1980)菌株進(jìn)行細(xì)菌展不多肽庫的構(gòu)建,所用質(zhì)粒為pBAD33。該細(xì)菌展示多肽庫的構(gòu)建過程如下。首先，對外膜蛋白(OmpX, outer membrane protein X)進(jìn)行改造，用氨基酸序列GSKSRR把OmpX的C端和N端連上，并在OmpX第2個(gè)環(huán)(loop)的s53和s54殘基之間打開,形成游離于胞外的C00H端和NH2端,成為CPX (circularlypermuted outer membrane protein OmpX)骨架(請參見 Rice et al.(2006) proteinSc1.15,825-836)。而把CPX骨架蛋白的165位的丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?66位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，成為 eCPX (enhance CPX)。(請參見 Jeffrey J.Rice et al.ProteinEngineering, Design & Select1n.2008, 21(7): 435 - 442.)將包含有 15個(gè)隨機(jī)氨基酸的序列X15連接到CPX骨架的N端。把經(jīng)過改造的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061 [F_araD139D (