一種突變的tbc1d1蛋白信號分子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種突變的TBC1D1蛋白信號分子及其應(yīng)用，具體 而言，利用基因組編輯技術(shù)或者通過化學(xué)物質(zhì)解除動物體內(nèi)代謝調(diào)控因子TBC1D1特定位 點的磷酸化狀態(tài)，使得TBC1D1蛋白功能改變，從而達到改變動物代謝、提高其生長速度、飼 料利用率的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 提高家禽或家畜的生長速度、飼料利用率和瘦肉含量一直是畜牧業(yè)關(guān)注的重要問 題，也是傳統(tǒng)育種長期努力的目標(biāo)。目前，在畜牧業(yè)內(nèi)采取了很多方法提高生長速度和飼料 的利用率。其中比較常用的方法是在飼料中添加抗生素或類似化學(xué)制劑，但由于抗生素或 化學(xué)制劑的藥物殘留較高，增加向環(huán)境和其他物種傳播抗性的風(fēng)險，因而抗生素的使用以 及其帶來的經(jīng)濟效益都在日漸降低。另一種方法就是體外注射生長激素（GH)制劑。這類 制劑在血內(nèi)的半衰期較短，需要長期注射才能達到效果，對使用技術(shù)要求比較高，而且要嚴(yán) 格控制注射劑量以避免GH的毒副作用。以上原因也是GH在畜牧業(yè)生產(chǎn)條件下大規(guī)模實施 限制因素。人們也嘗試注射另一種激素，生長激素釋放因子（GHRF)，或者表達GHRF的DNA 質(zhì)粒來促進家禽和家畜生長，這個方法取得了很好的效果。GHRF是一種由下丘腦分泌的肽 激素，可以促進GH的釋放和合成，增加內(nèi)源性的GH含量。但這種處理方法同樣需要長期注 射。而且外源蛋白進入機體后還會引起機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，也不適用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。
[0003] 近年來隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，為提高飼料效率、生長速度和瘦肉比例，分子育 種方法被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)新品種的培育上，這些新技術(shù)的應(yīng)用極大縮短了傳統(tǒng)育種的周 期，并使得新品種培育的品質(zhì)定向性更強，例如在已獲得授權(quán)的專利CN100435848C中就提 及了這樣一種方法。該專利通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動物體內(nèi)過量表達編碼GHRF(生長激素）信 號肽的GHRFcDNA序列，從而使GHRF信號肽在動物體內(nèi)的表達維持在一定水平上。利用這 項技術(shù)培育出的新品種實現(xiàn)了飼料的高效利用、動物的生長加快以及減少動物脂肪積累的 功能。但是這項專利技術(shù)除了在動物體內(nèi)持續(xù)表達GHRFDNA序列的同時還引入了編碼抗 生素抗性基因的DNA序列，這種轉(zhuǎn)基因動物的潛在風(fēng)險尚沒有明確的評估標(biāo)準(zhǔn)，即使沒有 任何危害，公眾對轉(zhuǎn)基因食品的接受程度也比較低，這大大限制了這種轉(zhuǎn)基因新品種在畜 牧業(yè)生產(chǎn)上的推廣。
[0004] 眾所周知，動物的生長速度、飼料利用率和瘦肉含量與代謝都有極大的關(guān)系。蛋 白激酶AMPK是身體內(nèi)重要的能量感受器，是糖脂和能量代謝的重要調(diào)控因子，可通過 磷酸化下游TBC1D1蛋白調(diào)控骨骼肌糖代謝。TBC1D1蛋白是一種RabGTPase激活蛋白 (RabGAP)，在氮端有兩個磷酸化酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（phospho-tyrosinebindingdomain， PTB)，而在碳端有一個GAP結(jié)構(gòu)域（圖1所示），TBC1D1蛋白可以通過其GAP活性調(diào)控 下游的Rab蛋白，進一步調(diào)控骨骼肌中四型葡萄糖轉(zhuǎn)運體的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移過程，而這是骨 骼肌中葡萄糖吸收的一個關(guān)鍵調(diào)控步驟。另有研宄表明TBC1D1蛋白參與脂肪代謝的調(diào) 控。在人類中，TBC1D1蛋白上的突變與家族性女性肥胖癥有關(guān)（TBClDlisacandidate forasevereobesitygeneandevidenceforagene/geneinteractioninobesity predisposition.StoneS,etal. 15, 2709-27202006,HumanMolecularGenetics)。Chen S,MurphyJ,TothR,CampbellDG,MorriceNA,MackintoshC.等人在Complementary regulationofTBClDlandAS160bygrowthfactors,insulinandAMPKactivators這篇 文章（TheBiochemicaljournal409,449_459,2008)中公開了在小鼠TBC1D1 蛋白氛基酸 序列的231位點上的絲氨酸（Ser)如圖1所示，已被證明可以被上游激酶磷酸化，這一位點 磷酸化也對葡萄糖轉(zhuǎn)運以及脂代謝有重要的調(diào)控作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足，通過基因編輯技術(shù)，使TBC1D1蛋白功能序列磷酸化狀 態(tài)發(fā)生變化，從而改變蛋白功能，使得機體在同樣攝食量的情況下快速生長。
[0006] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下： 一種突變的TBC1D1蛋白信號分子，其保守區(qū)域氨基酸序列如SEQID:N0 1所示。
[0007] SEQID:NO1RKSFAQPGLRS TBC1D1蛋白信號分子是一種廣泛分布的蛋白分子，在很多物種中都存在，其蛋白結(jié)構(gòu) 包含有N端的兩個PTB和C端的GAP結(jié)構(gòu)域。在TBC1D1的氨基酸序列中，如SEQID:N0 2 所示的氨基酸序列在不同物種中高度保守（如圖2所示），例如小鼠（ID:NP_062610. 2)的 保守區(qū)域位點為TBC1D1氨基酸序列的227到237位氨基酸，大鼠（ID:XP_006251066. 1)的 保守區(qū)域位點為TBC1D1氨基酸序列的227到237位氨基酸，豬（ID:XP_005666634. 1)的保 守區(qū)域位點為TBC1D1氨基酸序列的190到200位氨基酸，牛（ID:XP_611974)的保守區(qū)域 位點為TBC1D1氨基酸序列的230到240位氨基酸，羊（ID:XP_005681554. 1)的保守區(qū)域 位點為TBC1D1氨基酸序列的230到240位氨基酸，狗（ID:XP_536262)的保守區(qū)域位點為 TBC1D1氨基酸序列的256到266位氨基酸，雞（NP_001254502. 1)的保守區(qū)域位點為TBC1D1 氨基酸序列的253到263,鴨（ID:XP_005029721. 1)的保守區(qū)域位點為TBC1D1氨基酸序列 的252到262,猴（ID:XP_005554711. 1)的保守區(qū)域位點為TBC1D1氨基酸序列的233到243 位氨基酸，人的TBC1D1蛋白信號分子（NP_055988. 2)的保守區(qū)域位點為TBC1D1氨基酸序 列的233到243位氨基酸。
[0008] SEQID:N0 2RKSFSQPGLRS 與SEQID:N0 2相比，本發(fā)明保護的突變的TBC1D1蛋白信號分子，其保守區(qū)域氨基酸 序列中的絲氨酸（S)改變?yōu)楸彼幔ˋ)，從而使該保守區(qū)域不能夠被磷酸化。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述突變的TBC1D1蛋白信號分子在提高生物體生長速度和飼料 利用率的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種提高生物體生長速度、提高飼料利用率的方法，其特征在于 利用基因組編輯技術(shù)或者通過化學(xué)物質(zhì)解除或阻斷生物體代謝調(diào)控因子TBC1D1蛋白信號 分子磷酸化狀態(tài)，使得TBC1D1蛋白功能改變。優(yōu)選的，將TBC1D1蛋白信號分子的保守區(qū)域 SEQID:N0 2所示的氨基酸序列中的絲氨酸非磷酸化。
[0011] 優(yōu)選的，可以將絲氨酸改變?yōu)椴荒鼙涣姿峄钠渌被?。在本發(fā)明的一個優(yōu)選 方案中，將絲氨酸改變?yōu)楸彼?，得到保守區(qū)域氨基酸序列如SEQID:N0 1所述的TBC1D1 蛋白信號分子。
[0012] 上述方法中，可以利用同源重組、鋅指核酸酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 術(shù)或者規(guī)律性成簇間隔短回文重復(fù)CRISPR/Cas系統(tǒng)，使TBC1D1蛋白信號分子基因組DNA 外顯子上編碼TBC1D1蛋白信號分子的保守區(qū)域SEQID:NO2所示的氨基酸序列的基因序 列發(fā)生改變。
[0013] 本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，通過同源重組基因打靶的方法在小鼠體內(nèi)將TBC1D1 基因組DNA序列中編碼TBC1D1氨基酸序列231位點絲氨酸的TCA變?yōu)榫幋a丙氨酸的GCA，使 得TBC1D1蛋白序列231位點中的磷酸化的絲氨酸位點（……KSF)pS(QPG……）變?yōu)椋ā?KSF)A(QPG……），使得這個位點由原來可以被磷酸化的狀態(tài)改變?yōu)椴荒茉侔l(fā)生磷酸化。小 鼠出生后經(jīng)過PCR鑒定篩選出陽性小鼠，即攜帶有TBC1D1蛋白序列231位點突變?yōu)楸彼?的基因序列。小鼠TBC1D1氨基酸序列如SEQID:NO7所示，突變后得到的TBC1D1氨基酸 序列如SEQID:NO6所示。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種含有編