重組人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,特別地涉及一種重組人胰高血糖素樣肽-1突變體融 合蛋白及其制備方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]糖尿?。╠iabetes mellituS,DM)是一種多病因的代謝性疾病,其特點(diǎn)是慢性高血 糖,伴隨因胰島素分泌和/或作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。臨床研究發(fā) 現(xiàn),I型糖尿病,以往稱為胰島素依賴型糖尿病,約占糖尿病病人總數(shù)的15%左右,常發(fā)生 于兒童和青少年,但也可發(fā)生于其它年齡,甚至80-90歲時(shí)也有患病的可能。II型糖尿病, 又稱為非胰島素依賴型糖尿病,約占糖尿病病人總數(shù)的80%以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全球有II型 糖尿病患者1. 6億,我國達(dá)4000多萬人,其發(fā)病率正呈迅速上升之勢,在發(fā)展中國家(包括 中國)尤為顯著,預(yù)測到2025年,全球?qū)⒃鲋?. 8億人。依據(jù)目前的醫(yī)療手段,糖尿病無 根治辦法。因此,糖尿病已經(jīng)成為當(dāng)前威脅人類健康的重要疾病,其對人體的危害僅次于癌 癥。
[0005] 世界上治療II型糖尿病以磺酰脲類藥物為主,輔以雙胍類、a _糖苷酶抑制劑等 藥物。但是磺酰脲類藥物的副作用大,長期使用會因?yàn)橐葝u素過度分泌而導(dǎo)致胰島0細(xì) 胞衰竭。胰島0 -細(xì)胞功能衰竭,體內(nèi)胰島素絕對或相對缺乏,是導(dǎo)致糖尿病的根本原 因。因此尋找新一代治療II型糖尿病藥物的開發(fā)熱點(diǎn)之一。人胰高血糖素樣肽-1 (human glucogan like peptide-1,hGLP-1)是由腸道L細(xì)胞合成和分泌的由30個(gè)氨基酸組 成的多肽。國內(nèi)外研究顯示hGLP-1是迄今已知的誘導(dǎo)胰島素分泌能力最強(qiáng)的物質(zhì),可 以促進(jìn)胰島素基因轉(zhuǎn)錄和胰島素分泌,提高受體對胰島素的敏感性,消除胰島索抵抗所 引發(fā)的各種并發(fā)癥,且它降低血糖的作用依賴于患者血糖的濃度,用藥后不會造成低血 糖。此外,hGLP-1還可抑制胃的排空、控制食欲、減輕體重、消除患者饑餓感和糖尿病典 型的"三多"癥狀,在降血脂和預(yù)防冠心病方面也有一定的作用。除了調(diào)節(jié)血糖,hGLP-1 最顯著的功能是促進(jìn)膜島細(xì)胞功能再生,防止膜島細(xì)胞凋亡。然而,hGLP-1的 活性形式是hGLP-1 (7-36),hGLP-1 (7-36)在體內(nèi)很快被一種蛋白酶一二肽?;拿?IV (dipeptidyl-peptidase IV,DPP IV )從N末端降解2個(gè)氨基酸殘基而變成一種無活性的 hGLP-1 (7-36)。因此hGLP-1 (7-36)在體內(nèi)的半衰期不足5 min,其新陳代謝的時(shí)間為12~ 13 min。hGLP-1 (7-36)較短的體內(nèi)半衰期決定了只有頻繁、反復(fù)地給藥才能取得令人滿意 的療效,這就極大地限制了它的臨床應(yīng)用及療效,還給病人造成了不必要的麻煩和痛苦。
[0006] 為了克服上述缺點(diǎn),開發(fā)長效的hGLP-1 (7-36)突變體是目前的研究熱點(diǎn)。該裂解 主要受體內(nèi)絲氨酸蛋白酶-DPP IV的催化,因?yàn)閔GLP-1 (7-36)序列第8位丙氨酸(Ala)可 被DPP IV特異性所識別,為了保護(hù)hGLP-1不被DPP IV所降解,延長其在體內(nèi)的生物半衰期, 可以用甘氨酸(Gly)代替第8位丙氨酸(Ala)對hGLP-1的N-末端進(jìn)行修飾。
[0007] 人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)融合技術(shù)是構(gòu)建長效蛋白類藥物的 有效技術(shù)手段,已在多種藥物研究中得到應(yīng)用。所謂的白蛋白融合技術(shù)利用白蛋白分子質(zhì) 量大的性狀將藥物蛋白易致機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的部分折疊包入其內(nèi),暴露藥物蛋白活性區(qū) 域,使其位于融合蛋白的表面。這種處理手段的優(yōu)點(diǎn)不但可顯著降低產(chǎn)品的過敏反應(yīng),還可 防止機(jī)體酶系統(tǒng)對藥物蛋白的降解,提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和延長其療效。人血白蛋白融合技 術(shù)與化學(xué)修飾相比,不需要額外的化學(xué)修飾,生產(chǎn)工藝簡單,產(chǎn)物均一,質(zhì)量控制相對容易, 延長藥物半衰期的效果可能比化學(xué)修飾更有效。
[0008] 重組人胰高血糖素樣肽-1突變體就是將GLP-1 (7-36)第8位的丙氨酸突變?yōu)楦?氨酸,并將GLP-1 (7-36)突變體串聯(lián)直接與人血白蛋白的N段連接,并在酵母系統(tǒng)中表達(dá)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明是為了克服重組人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白表達(dá)量不高,不適 合工業(yè)化生產(chǎn)的缺陷提出的。
[0010] 本發(fā)明提供一種重組人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白,編碼該融合蛋白的 核苷酸序列為SEQ ID No. 1。
[0011] 為了更好地實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的,本發(fā)明還提供一種重組人胰高血糖素樣肽-1突變體 融合蛋白的制備方法,所述制備方法包括以下步驟: 步驟(1)重組人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白表達(dá)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建; 步驟(2)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中并誘導(dǎo)表達(dá)篩選得到重組子; 步驟(3)重組子發(fā)酵,得到發(fā)酵液上清; 步驟(4)將步驟(3)得到的發(fā)酵液上清純化制得融合蛋白。
[0012] 所述步驟(1)重組人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白表達(dá)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu) 建包括以下步驟:將具有序列表SEQ ID No. 1所示序列的DNA片段合成后連接到pMD-18T 載體上,形成pMD-18T-(GLP-lA2G)2-HSA質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5a中進(jìn)行克隆,提取單 克隆質(zhì)粒,用兩種限制性內(nèi)切酶SacII和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物以重量比為1.0%的瓊脂 糖凝膠電泳,用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的基因,與經(jīng)過兩種限制性內(nèi) 切酶雙酶切的酵母表達(dá)載體連接,構(gòu)建出重組質(zhì)粒。
[0013] 所述限制性內(nèi)切酶為Sac II和Xho I,所述酵母表達(dá)載體為pPICZ a,所述重組質(zhì) 粒為 pPICZ a - (GLP-1A2G) 2-HSA。
[0014] 所述步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中并誘導(dǎo)表達(dá)篩選重組子包括以下步 驟:將重組質(zhì)粒線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化所述畢赤酵母,轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即加入山梨醇,混勻后 涂布于YPDZ平板,培養(yǎng)至菌落出現(xiàn),篩選陽性克隆得到重組子一;將得到的重組子一接種 于裝有50ml BMGY培養(yǎng)基的500ml三角瓶中,30°C 300r/min培養(yǎng)至A6。。值為2. 0-6. 0,離心 收集菌體,然后用BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至A6。。值為1. 0,30°C,300r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng), 每隔24h補(bǔ)加一次甲醇(補(bǔ)加甲醇至濃度為0.5wt%),誘導(dǎo)表達(dá)96h后,離心取菌液上清, SDS-PAGE分析,篩選得到表達(dá)量最高的重組子二。
[0015] 畢赤酵母優(yōu)選為畢赤酵母X33,當(dāng)畢赤酵母為畢赤酵母X33時(shí),篩選得到的重組子 一為X33/pPICZ a - (GLP-1A2G) 2-HSA,篩選得到的重組子二為表達(dá)量最高的重組子二X33/ pPICZa- (GLP-1A2G) 2-HSA〇
[0016] 所述BMGY培養(yǎng)基組分為lwt%酵母提取物,2wt%蛋白胨,1. 34wt%YNB,4X 10 5wt% 生物素,lwt%甘油,其余為水; 所述BMMY培養(yǎng)基組分為lwt%酵母提取物,2wt%蛋白胨,1. 34wt%YNB,4X 10 5wt%生物 素,0. 5wt%甲醇,其余為水; 所述步驟(3)重組子發(fā)酵,得到發(fā)酵液上清包括以下步驟:將篩選得到的表達(dá)量最高 的重組子二 X33/pPICZ a - (GLP-1A2G) 2-HSA 接種于 YH)液體培養(yǎng)基,30°C、250 ~300rpm 條 件下培養(yǎng)16~24小時(shí),直到0D600=2~6作為種子液;然后將種子液以5~10%的接種 量接種基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基;培養(yǎng)直到甘油被完全耗盡后,開始補(bǔ)加50%的甘油補(bǔ)料,所述每升甘 油補(bǔ)料中需添